Khảo sát tiềm năng kháng khuẩn từ cao chiết lá cây ổi (psidium guajava l ) nghiên cứu khoa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN KHẢO SÁT TIỀM NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CAO CHIẾT LÁ CÂY ỔI (Psidium guajava L.) Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN KHẢO SÁT TIỀM NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CAO CHIẾT LÁ CÂY ỔI (Psidium guajava L.) Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Đoàn Thanh Liêm Khoa: Cơng nghệ sinh học Các thành viên: Trần Hồng Tấn Kha Lương Thị Cẩm Vân Lê Thị Trúc Linh Hà Long Người hướng dẫn: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Khảo sát tiềm kháng khuẩn từ cao chiết ổi (Psidium guajava L.) - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đồn Thanh Liêm - Lớp: DH15SH03 Khoa: Cơng nghệ sinh học Năm thứ: Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Mục tiêu đề tài: Tìm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ổi có khả kháng loại vi khuẩn gây bệnh người Tính sáng tạo: Hiện Việt Nam chưa có nghiên cứu việc lấy hợp chất tự nhiên ổi để kháng vi khuẩn gây bệnh Những vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa có nguy gây nhiễm trùng bệnh viện, nhiễm trùng cộng đồng đề kháng kháng sinh Việc tìm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ổi kháng lại chủng vi khuẩn có ý nghĩa thiết thực Trong giới có số nghiên cứu khả kháng khuẩn ổi Nwankwo cộng (2013), Mohammed cộng (2016) chưa có chuyên sâu kết chưa thuyết phục Vì đề tài hồn tồn Việt Nam định thực nghiên cứu đề tài Kết nghiên cứu: Chúng thực nghiên cứu khảo sát loại dung môi từ ổi kháng lại vi khuẩn gây bệnh người Staphylococcus aureus kháng methycillin, Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa kết đạt sau:  Qua loại dung môi khảo sát nước, ethanol, hexane, diclorometan, nhận thấy dung môi cho lượng cao chiết thấp hexane với hiệu suất thu hồi 3,88% Dung môi ethanol cho khối lượng cao chiết cao với hiệu suất thu hồi 46% so với dung môi khác Chứng tỏ dung mơi ethanol có khả chiết nhiều hợp chất có ổi  Cao chiết với nước ethanol có khả kháng loại chủng vi khuẩn thử nghiệm Trong đó, cao chiết với nước có đường kính vịng kháng khuẩn với MRSA cao (20,67 ± 1,52 mm) cao chiết với ethanol có đường kính vịng kháng khuẩn với MRSA cao (19,67 ± 1,15 mm) Hai cao chiết cịn lại hexane CH2Cl2 khơng có khả kháng khuẩn loại chủng vi khuẩn thử nghiệm  Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết cho thấy cao chiết với nước có tác động ức chế E coli S.typhi nồng độ tối thiểu (MIC) 6,25 mg/mL có tác động ức chế P aeruginosa MRSA nồng độ tối thiểu (MIC) 3,125 mg/mL Qua trình thu nhận lựa chọn cao chiết để xác định cấu trúc phân tử, thu nhận loại cao chiết qua phương pháp chiết lỏng - lỏng cao ethyl axetat, cao hexane, cao nước (ethyl axetat dung môi bán phân cực, haxane dung môi không phân cực nước dung môi phân cực mạnh) đạt kết sau:  Vạch cao ethyl axetat hình chất bảng gel rõ so với vạch cao cịn lại Vì cao ethyl axetat có chứa hợp chất tự nhiên nhiều cao lại  Kết khảo sát khả kháng khuẩn loại cao chiết sau thực phương pháp chiết lỏng- lỏng là: _ Cao hexane khơng có khả kháng khuẩn _ Cao nước có khả kháng khuẩn MRSA: 22.33 ± 0,57b mm, E.coli: 20,33 ± 1,62b mm, S.typhi: 15,67 ± 0,33b mm, P.aeruginosa: 15,33 ± 0,57b mm _ Cao ethyl axetat kháng vi khuẩn cao MRSA: 31.67 ± 1,52a mm, E.coli: 22,67 ± 1,62a mm, S typhi: 18,00 ± 1,00a mm, P aeruginosa: 17,67 ± 1,15a mm Từ kết chúng tơi nhận thấy khả kháng MRSA cao ổi có nhiều hợp chất tự nhiên bán phân cực (ethyl axetat dung mơi bán phân cực) Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: Lá ổi trở thành nguồn nguyên liệu cung cấp cho việc điều chế thuốc kháng sinh điều trị bệnh nhiễm khuẩn người Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài Nguyễn Đoàn Thanh Liêm Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài (phần người hướng dẫn ghi): Xác nhận đơn vị Người hướng dẫn Nguyễn Tấn Phát Ngày tháng năm Người hướng dẫn Dương Nhật Linh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Họ tên: Nguyễn Đoàn Thanh Liêm Ảnh 4x6 Sinh ngày: 22 tháng 03 năm 1996 Nơi sinh: Hịa Thành Tây Ninh Lớp: DH15SH03 Khóa: 2015-2019 Khoa: Công nghệ sinh học Địa liên hệ: 68 Lê Thị Trung phường Phú Lợi thành phố Thủ Dầu Một tình Bình Dương Điện thoại: 0974465457 Email: 1553010088liem@ou.edu.vn II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP * Năm thứ 1: Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học Kết xếp loại học tập: 6.39 Sơ lược thành tích: Trung bình * Năm thứ 2: Ngành học: Cơng nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học Kết xếp loại học tập: 5.88 Sơ lược thành tích: Trung bình * Năm thứ Ngành học: Công nghệ sinh học_ Y dược Khoa: Công nghệ sinh học Kết xếp loại học tập: 6.37 Sơ lược thành tích: Trung bình Xác nhận đơn vị Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài Nguyễn Đồn Thanh Liêm MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG .iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC SƠ ĐỒ vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Tổng quan nguyên liệu 12 1.1.1 Sơ lược ổi (Psidium guajava L.) 12 1.1.2 Nguồn gốc phân bố 13 1.1.3 Đặc điểm hình thái 13 1.1.4 Giá trị dinh dưỡng thành phần hóa học ổi 15 1.2 Tổng quan số vi khuẩn gây bệnh người 18 1.2.1 Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) 18 1.2.2 Escherichia coli 20 1.2.3 Salmonella typhi 21 1.2.4 Pseudomonas aeruginosa 22 1.3 Tình hình nghiên cứu nước nước 22 1.4 Khái quát phương pháp chiết cao dược liệu 24 1.4.1 Phân loại cao dược liệu: 24 1.4.2 Các kĩ thuật chiết dược liệu: 25 1.5 Khái quát phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 27 1.5.1 Phương pháp khuếch tán 27 1.5.2 Phương pháp pha loãng liên tiếp 29 1.6 Sắc ký mỏng (TCL) 30 1.7 Phương pháp sắc ký cột 31 1.8 Phương pháp xác định cấu trúc 31 i VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu 33 2.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 33 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất mơi trường 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 34 2.2.2 Quy trình thu nhận xử lý mẫu 35 2.2.3 Xác định tên khoa học thuốc 35 2.2.4 Quy trình chiết xuất cao dược liệu từ ổi 35 2.2.5 Khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn cao chiết 37 2.2.6 Định tính khả kháng khuẩn gây bệnh 38 2.2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với vi khuẩn gây bệnh 39 2.2.8 Thu nhận lựa chọn cao chiết để xác định cấu trúc toàn phân tử 41 2.2.9 Phương pháp sắc kí mỏng (TCL) 41 2.2.10 Phương pháp sắc kí cột 42 2.2.11 Phương pháp xác định cấu trúc 42 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết giám định tên khoa học 44 3.2 Kết chiết cao dược liệu 44 3.3 Kết định tính khả kháng khuẩn 46 3.4 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết 50 3.5 Thu nhận lựa chọn cao chiết để xác định cấu trúc toàn phân tử 53 3.6 Kết sắc ký mỏng sắc ký cột 56 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 4.1 Kết luận 63 ii 4.2 Đề nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 68 iii Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát có khả khuẩn cao để xác định hợp chất tự nhiên phân đoạn nên kết sẽ bổ sung đầy đủ sau 61 GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Nghiên cứu khoa học Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát 4.1 Kết luận Sau thời gian thực đề tài chúng tơi hồn thành mục tiêu thu cao chiết, khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thu kết sau: Đối với khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, cao chiết nước cho kết vòng kháng cao E coli 9,67 ± 0,58 mm, P aeruginosa 13,33 ± 1,15 mm, S.typhi 11,33 ± 1,15 mm, loại cao chiết cịn lại khơng có khả kháng khuẩn Sau thí nghiệm chúng tơi xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết từ ổi là: Đối với cao nước, E coli S.typhi có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1/16 tương đương 6,25 mg/mL P aeruginosa MRSA có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1/32 tương đương với 3,125 mg/mL Đối với cao ethanol, E coli, S.typhi P Aeruginosa có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1/16 tương đương 6,25 mg/mL MRSA có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1/32 tương đương với 3,125 mg/mL Kết khảo sát khả kháng khuẩn loại cao chiết sau thực phương pháp chiết lỏng- lỏng là: Cao hexane khơng có khả kháng khuẩn, cao nước có khả kháng khuẩn MRSA: 22.33 ± 0,57b mm, E.coli: 20,33 ± 1,62b mm, S.typhi: 15,67 ± 0,33b mm, P.aeruginosa: 15,33 ± 0,57b mm, cao ethyl axetat kháng vi khuẩn cao MRSA: 31.67 ± 1,52a mm, E.coli: 22,67 ± 1,62a mm, S typhi: 18,00 ± 1,00a mm, P aeruginosa: 17,67 ± 1,15a mm Chúng nhận thấy có nhiều hợp chất tự nhiên bán phân cực (ethyl axetat dung môi bán phân cực) ổi có khả kháng MRSA cao Tất thí nghiệm cho thấy khả kháng khuẩn từ cao chiết ổi kháng cao Staphylococcus aureus kháng methylcillin (MRSA) 63 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát 4.2 Đề nghị Kết đề tài tiền đề cho cơng trình nghiên cứu hợp chất kháng vi khuẩn gây bệnh người có nguồn gốc từ ổi ( Psidium guajava L) Để hoàn thiện cho đề tài nghiên cứu chúng tơi có số đề nghị sau: _ Chúng bổ sung thêm kết thí nghiệm cịn lại sớm _ Khảo sát thêm khả kháng với loại vi khuẩn khác _ Xác định hợp chất ổi để bổ sung thêm nguồn thuốc kháng sinh 64 GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Nghiên cứu khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: [1] Đái Thị Xuân Trang (2012), khảo sát khả điều trị bệnh tiểu đường từ cao chiết ổi ( Psidium guajava L.), tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ [2] Đỗ Đình Hải (2012) Rau rừng Việt Nam [3] Lê Văn Phủng (2012), Vi khuẩn y học, Nhà xuất giáo dục Việt Nam [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh [5] Nguyễn Thanh Bảo (2008), Vi khuẩn học, Đại học Y Dược Tp.HCM [6] Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất y học, tập 1, trang 200-207 Tiếng Anh: [7] Abdeirahirn S I., Almadboul A Z., Omer M E A & Elegami A (2002), “Antimicrobial activity of Psidium guajava L.”, Fitoterapia, 73: 713-715 [8] Aunpad R., Pipatsatitpong D (2014) “Isolation and Characterization of a Bacteriocin with Anti-MRSA Activity from Bacillus sp” Strain WASM925M Thai Journal of Pharmacology, 36(2), 19-28 [9] Bipul Biswas, Kimberly Rogers, Fredrick McLaughlin, Dwayne Daniels, and Anand Yadav (2013) “Research Article Antimicrobial Activities of Leaf Extracts of Guava (Psidium guajava L.) on Two Gram-Negative and GramPositive Bacteria.”, 746165, [10] Buchanan R E., Gibbons N E (1994), “Bergey’s manual of determinative bacteriology”, W E Johnson library [11] Cardozo V F., Oliveira A G., Nishio E K., Perugini M R., Andrade C G., Silveira W D., Nakazato G (2013) “Antibacterial activity of extracellular compounds produced by a Pseudomonas strain against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains” Annals of clinical microbiology and antimicrobials, 12(1), 12 65 GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Nghiên cứu khoa học [12] Francesca I., Doroudchi M M., Ismail N., Carreno A., Griner E., Lim M A (2015) “Registered report: Interactions between cancer stem cells and their niche govern metastatic colonization” Elife, 4, e06938 [13] Garode A M., Waghode S M (2014) “Antibacterial activity of Psidium guajava Linn (guava) leaves extracts on bacterial pathogens International Journal of Bioassays”, 3(2), 1794-1796 [14] Gnan S O., Demello M T (1999), “ Inhibition of Staphylococcus aureus by aqueous Goiaba extracts Journal of Ethnopharmacology”, 68(1-3), 103-108 [15] Kalita D., Saikia J CH., Sindagi A S., Anmol G K (2012), “Antimicrobial activity of leaf extract of two medicinal plants of Boghora Hill (Morigaon) Assam against human pathogens”, The bioscan an international quarterly journal of life sciences, 7(2), pp 271-274 [16] Lora-Tamayo J., Murillo O., Iribarren J A., Soriano A., Sánchez-Somolinos M., Baraia-Etxaburu J M., Benito N (2012) “A large multicenter study of methicillin–susceptible and methicillin–resistant Staphylococcus aureus prosthetic joint infections managed with implant retention” Clinical infectious diseases, 56(2), 182-194 [17] Mahfuzul Hoque M D., Bari M L., Inatsu Y., Juneja V K., Kawamoto S (2007), “Antibacterial activity of guava (Psidium guajava L.) and neem (Azadirachta indica A Juss.) extracts against foodborne pathogens and spoilage bacteria”, Foodborne pathogens and disease, 4(4), 481-488 [18] Meckes M., Calzada F., Tortoriello B J., Gonzalez J L and Martinez (1996) “Terpenoids isolated from Psidium guajava hexane extract with depressant activity on central nervous system” Phytotherapy Research, 10(7), 600-603 [19] Mohammed A H., Na’inna S Z., Yusha’u M., Salisu B., Adamu U and Garba, S A (2017) “In vitro Antibacterial Activity of Psidium guajava Leaves Extracts against Clinical Isolates of Salmonella specie” UMYU Journal of Microbiology Research , Volume Number 66 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tn Phỏt [20] Nobre L S., Gonỗalves V L., Saraiva L M (2008) “Flavohemoglobin of Staphylococcus aureus” In Methods in enzymology (Vol 436, pp 203-216) Academic Press [21] Nwankwo I U., Amaechi N (2013), “ Antibacterial Activity of Azadirachita indica and Psidium guajava Extracts against Three Bacterial Strains”, Vol.3, No.10, 2224-3186 [22] Nwinyi O C., Chinedu S N., Ajani O O (2008), “ Evaluation of antibacterial activity of Pisidium guajava and Gongronema latifolium”, Journal of medicinal plants Research, 2(8), 189-192 [23] Paovalo C., Chulasiri M U (1986) “Bacterial mutagenicity of fractions from chloroform extracts of Ceylon cinnamon” Journal of Food Protection, 49(1), 12-13 [24] Rajasekaran C., Meignanam E., Vijayakumar V., Kalaivani T., Ramya S., Premkumar N., Siva R., Jayakumararaj R (2008), “Investigations on Antibacterial Activity of Leaf Extracts of Azadirachta indica A.Juss (Meliaceae): A Traditional Medicinal Plant of India”, Ethnobotanical Leaflets 12, pp 12131217 [25] Wang S H., Sun Z L., Guo Y J., Yang B Q., Yuan Y., Wei Q., Ye K P (2010) “Meticillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from foot ulcers in diabetic patients in a Chinese care hospital: risk factors for infection and prevalence” Journal of medical microbiology, 59(10), 1219-1224 [26] Xavier C., Ramírez Lázaro M J., Lehours P., Mégraud F (2013) “Diagnosis and Epidemiology of H elicobacter pylori Infection” Helicobacter, 18, 5-11 67 GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Nghiên cứu khoa học PHỤ LỤC Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố khả kháng vi khuẩn gây bệnh cao chiết từ ổi phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0 Tỉ lệ pha loãng cao chiết 0,1 g / mL DMSO Pseudomonas aeruginosa 68 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Escherichia coli 69 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Samonella typhi 70 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát MRSA 71 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Thu nhận lựa chọn cao chiết để xác định cấu trúc toàn phân tử Escherichia coli 72 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Pseudomonas aeruginosa 73 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Samonella typhi 74 Nghiên cứu khoa học GVHD: ThS Dương Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát MRSA 75 ... nhiều nghiên cứu công bố việc sử dụng hợp chất từ ổi để kháng l? ??i vi khuẩn gây bệnh Từ l? ? thực đề tài ? ?Khảo sát tiềm kháng khuẩn từ dịch chiết ổi (Psidium guajava L. )? ?? Mục tiêu: : nhằm nghiên cứu. .. thực nghiên cứu đề tài Kết nghiên cứu: Chúng thực nghiên cứu khảo sát loại dung môi từ ổi kháng l? ??i vi khuẩn gây bệnh người Staphylococcus aureus kháng methycillin, Escherichia coli, Salmonella... ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN KHẢO SÁT TIỀM NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CAO CHIẾT L? ? CÂY ỔI (Psidium guajava L. ) Chủ nhiệm đề tài: