Virus gây bệnh viêm gan siêu vi c tái xác định kiểu gen dựa trên vùng trình tự ns5b và xác định các đột biến đa hình đơn nucleotide (snp) trên gen il28b nhằm tiên lượng phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân ngh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN VIRUS GÂY BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C: TÁI XÁC ĐỊNH KIỂU GEN DỰA TRÊN VÙNG TRÌNH TỰ NS5B VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (SNP) TRÊN GEN IL28B NHẰM TIÊN LƯỢNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ THÍCH HỢP CHO BỆNH NHÂN Sinh viên thực hiện: Từ Thị Ngọc Hồng Dung Nguyễn Vương Minh Hoàng Nguyễn Thị Minh Hiền Hồ Thị Tây Trần Thị Diễm Kiều Người hướng dẫn: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy TP Hồ Chí Minh, 2013 GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy LỜI CẢM ƠN Chuyên đề kết gần tháng chúng em tìm hiểu, nghiên cứu thực đề tài viêm gan siêu vi C phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Ngồi nỗ lực, phấn đấu thân, chúng em nhận nhiều bảo, quan tâm giúp đỡ Do đó, hồn thành chun đề này, cho phép chúng em gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: Cô – PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy -người bảo, hướng dẫn giải thích khúc mắc chúng em từ học tập đến làm chuyên đề này.Cô người hỗ trợ chỉnh sửa cho chúng em chuyên đề Anh – Trần Huỳnh Minh Nhật – người bảo, hướng dẫn giúp đỡ chúng em lúc làm chuyên đề góp ý chỉnh sửa cho chúng em hồn thành chun đề Các Anh/Chị Cơng ty Việt Á hướng dẫn giúp đỡ chúng chúng em tận tình trình làm thực nghiệm công ty Các thầy cô khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Mở TP.HCM, người truyền đạt cho chúng em kiến thức lí luận nghiên cứu khoa học Các thầy cô tham gia hội đồng dành thời gian xem xét, đánh giá chỉnh sửa chuyên đề em.Các góp ý quý thầy giúp cho chun đề thêm xác, hồn thiện có thêm định hướng nghiên cứu tương lai Các bạn nghiên cứu đề tài viêm gan siêu vi C, bạn lớp SH09A2, SH09VS chúng em học tập chia sẻ buồn vui trình học Đại học thực chuyên đề tốt nghiệp Cuối cùng, xin cám ơn ba mẹ, anh chị em, người hỗ trợ mặt tinh thần vật chất để chuyên tâm học hành có thành ngày hơm Kính chúc người thật nhiều sức khỏe, niềm vui, may mắn sống thành công cơng việc! Tp Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 04 năm 2013 Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy M L DANH MỤC BẢNG .5 DANH MỤC HÌNH .6 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .8 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 10 THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI .13 PHẦN I TỔNG QUAN 18 I.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C 18 I.1.1 Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi C .18 I.1.2 Đặc điểm bệnh học 18 I.1.3 Các đường lây truyền virus HCV 22 I.1.4 Dịch tễ học bệnh viêm gan siêu vi C 23 I.2 VIRUS GÂY BỆNH VIÊM GAN C – VIRUS HCV .26 I.2.1 Phân loại cấu trúc HCV .26 I.2.2 Cấu trúc máy di truyền 28 I.2.3 Cơ chế xâm nhập gây bệnh virus HCV 31 I.2.4 Các genotype (subtype) 32 I.3 BIỆN PHÁP PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ 36 I.3.1 Biện pháp phòng ngừa 36 I.3.2 Điều trị viêm gan C 36 I.3.3 Phác đồ điều trị 39 I.4 ĐỊNH DANH VIRUS HCV .42 I.4.1 Các phương pháp chẩn đoán HCV .42 I.4.2 Các phương pháp định danh HCV .46 Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy I.4.3 Đặc điểm vùng NS5B 48 I.4.4 Định danh HCV dựa vào vùng non-structure NS5B 49 I.4.5 Hiệu chỉnh trình tự (Proofreading) .54 I.4.6 Nghiên cứu phát sinh loài 55 I.5 TỔNG QUAN VỀ INTERFERON VÀ VÙNG GEN IL-28B 59 I.5.1 Tổng quan interferon 59 I.5.2 Tổng quan vùng gen IL28B 61 I.6 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SNP TRÊN GEN IL28B 63 I.6.1 Phân tích SNP dựa lai đặc hiệu allele .63 I.6.2 Phương pháp mở rộng mồi 63 I.6.3 Phương pháp chọn ước thực nghiệm sử d ng nghiên cứu 64 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 66 II.1 VẬT LIỆU 66 II.2 PHƯƠNG PHÁP 68 II.2.1 Phương pháp khai thác thu thập tài liệu 68 II.2.2 Khảo sát in silico 69 II.2.3 Thực nghiệm 73 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 82 III.1 KẾT QUẢ KHAI THÁC VÀ THU THẬP TÀI LIỆU .82 III.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO 83 III.2.1 Kết xây dựng sở liệu (database) c c cho genotype 1, .83 II.2.2 ết thống kê kiểu gen NP rs12 rs 84 III.2.3 Kết đánh giá thiết kế mồi 89 III.3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM NHẰM KHUẾCH ĐẠI VÙNG NS5B CHO CÁC MẪU BỆNH PHẨM HCV 103 II.3.1 Kết hiệu chỉnh trình tự với Sea View Chromas Pro 104 III.3.2 Kết so sánh với sở liệu Genbank 106 Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy III.3.3 Xây dựng sở liệu trình tự NS5B –HCV .1088 III.3.4 Phân tích phả hệ 1088 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 115 IV.1 KẾT LUẬN .11515 IV.2 KIẾN NGHỊ 11616 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 PHỤ LỤC 127 Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy DANH M C BẢNG Bảng I.1 Tỷ lệ số lượng người nhiễm viêm gan C theo WHO 233 Bảng I.2 Tỷ lệ kiểu gen HCV 327 mẫu huyết Việt Nam xác định kỹ thuật LiPA 255 Bảng I.3 So sánh kết xác định genotype HCV dùng phương pháp LiPA(5’UTR) phương pháp giải trình tự phần vùng NS5B 511 Bảng I.4 So sánh kết xác định genotype HCV thu từ phương pháp LiPA version (5’UTR) Real-time PCR (NS5B) 522 Bảng II.1 Trình tự thơng số đánh giá mồi IDT annhyb cặp mồi khuếch đại vùng NS5B 711 Bảng III.1 Các kỹ thuật sử d ng phát NP rs12 rs8099917 855 Bảng III.2 Trình tự thơng số đánh giá mồi IDT annhyb cặp mồi tối ưu nhằm khuếch đại vùng NS5B 922 Bảng III.3 Trình tự thông số đánh giá cặp mồi , mẫu d phương pháp real-time PCR IDT khuếch đại cho rs12979860 .944 Bảng III.4 Trình tự thơng số đánh giá cặp mồi , mẫu d phương pháp real-time PCR thừa kế IDT khuếch đại cho rs8099917 966 Bảng III.5 Trình tự thông số đánh giá cặp mồi IDT nhằm khuếch đại cho rs12979860 sau chỉnh sửa 98 Bảng III.6 Các thông số đánh giá cặp mồi, mẫu d ằng IDT nhằm khuếch đại cho rs8099917 sau chỉnh sửa 1000 Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy DANH M H NH Hình I.1 Diễn biến tự nhiên bệnh viêm gan C 19 Hình I.2 Tỷ lệ nhiễm HCV (%) giới 244 Hình I.3 Mối quan hệ họ hàng họ Flaviviridae 2727 Hình I.4 Cấu trúc HCV 2727 Hình I.5 Cấu trúc gen họ Flaviviridae 28 Hình I.6 Cấu trúc HCV vùng protein mã hóa từ gen HCV 2929 Hình I.7 Quá trình xâm nhập vào tế đích khởi đầu lây nhiễm HCV 322 Hình I.8 Sự phân bố genotype HCV giới 3333 Hình I.9 Tỷ lệ phân bố genotype HCV theo quốc gia khu vực 344 Hình I.10 Sự phân bố genotype Đông Nam Á Trung Quốc 355 Hình I.11 Tỷ lệ phân bố genotype Đông Nam Á Trung Quốc 366 Hình I.12 đồ điều trị cho bệnh nhân nhiễm HCV genotype 400 Hình I.13 đồ điều trị bệnh nhân nhiễm HCV genotype 2,3 411 Hình I.14 Biểu đồ so sánh tỷ lệ SVR phác đồ điều trị 411 Hình I.15 Biểu đồ mơ tả vị trí motif domain HCV RdRp 4848 Hình I.16 Cấu trúc HCV RdRp .4949 Hình 1.17 Tỷ lệ kiểu sai sót giải trình tự tự động phương pháp đánh dấu huỳnh quang mồi hai cách đọc nucleotide tự động Phred (màu xám) ABI (màu đen) (Ewing cs, ) 544 Hình I.18 Sự phân bố alen C/T SNP rs12979860 giới 622 Hình III.1 Vị trí NP rs12 rs N T số 19 người 833 Hình III.2 Biểu đồ thống kê tần số trung ình có trọng số NP rs12 A) NP rs (hình ) bệnh nhân nhiễm HCV giới .855 Hình III.3 Biểu đồ thống kê phân bố rs12 (hình NP rs (Hình A) (Hình ) bệnh nhân nhiễm HCV theo chủng tộc 866 Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy Hình III.4 Biểu đồ thống kê phân bố SNP kiểu gen rs12979860 bệnh nhân nhiễm HCV theo địa l (hình A) theo kiểu gen HCV (hình ) 8686 Hình III.5 ối liên hệ NP rs với giới tính ệnh nhân viêm gan C 8787 Hình III.6 Biểu đồ thống kê khả đáp ứng virus kéo dài (SVR) SNP rs1297960 bệnh nhân nhiễm HCV theo chủng tộc 8888 Hình III.7 Biểu đồ thống kê khả đáp ứng virus kéo dài (SVR) SNP rs12979860 bệnh nhân nhiễm HCV theo địa lý 8888 Hình III ối liên quan NP rs (trái) rs12 (phải) với kết đáp ứng virus kéo dài ệnh nhân HCV 8989 Hình III.9 Kiểm tra mồi mẫu d rs12 (A) rs8099917 (B) chương trình Annhy 10303 Hình III.10 Kết điện di sản phẩm PCR (mẫu VA-1) với cặp mồi N 2F/N 2R, RNA tách chiết theo phương pháp phenol:chloroform 1044 Hình III.11 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang bị nhiễu hai đầu 1044 Hình III.12 Biểu đồ huỳnh quang có peak ổn định chọn 1055 Hình III.13 Vị trí sai lệch hai kết giải trình tự mẫu VA-1 cặp mồi NS5B2F/NS5B2R a) kết gióng cột Sea View, b) biểu đồ tín hiệu huỳnh quang mở Chromas Pro Tín hiệu huỳnh quang xác nhận có hai adenine liên tiếp vị trí 1066 Hình III.14 Cây phả hệ HCV dựng phương pháp (A) Neigh or-joining, (B) Minimum evolution, (C) Maximum likelihood 10909 Hình III.15 Các trình tự su type 2j an đầu (A) sau chỉnh sửa (B) 1111 Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy DANH M C CHỮ VIẾT TẮT 5’ N (5’ Non Coding Region) hay 5’ UTR (5’ Untranslated Region): Vùng gen không mã hóa nằm đầu 5’ aa (amino acid): Đơn phân tạo nên chuỗi polypeptid hay protein ALT (Alanine Aminotransferase): Men xúc tác phản ứng chuyển nhóm amino, diện chủ yếu tế bào gan Anti-LKM1: Kháng thể kháng microsome gan/thận type AVP (antivaral protein): protein kháng virus CD81: Thành viên họ protein tetraspanin, nơi gắn với protein màng E2 virus CLDN (claudin): Protein màng tế bào người DNA: deoxyribonucleic acid EASL (European Association for the Study of Liver): Hiệp Hội Nghiên Cứu Bệnh Gan Châu Âu GAG (Glycosylaminoglycan): Th thể bề mặt tế bào HCV (Hepatitis C Virus): Virus viêm gan C HGV (Hepatitis G Virus): Virus viêm gan G HRM: High Resolution Melting IFN: interferon IL28B: Interleukin 28B LDLR (Low-density lipoprotein receptor): Th thể bề mặt tế bào mRNA (messenger ribonucleic acid): RNA thông tin MGB: Minor Groove Binder Nu (nucleotide): Đơn phân tạo nên chuỗi DNA hay RNA NST: Nhiễm sắc thể NS5B (Non Structure 5B): Vùng gen mã hóa protein khơng cấu trúc OCLN (occludin): Protein màng tế bào người, tương tác với protein E2 virus PEG-INF/RBV: pegylated interferon ribavirin PCR: Polymerase Chain Reaction Trang GVHD: PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction): PCR định lượng RC (Replication complex): phức hợp chép RdRp (RNA-dependent RNA polymerase): RNA virus ph thuộc vào RNA polymerase RNA: ribonucleic acid RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): Tính đa hình chiều dài đoạn giới hạn SR-B1 (Scavenger receptor class B type 1): Kháng thể ngăn cản xâm nhiễm virus SVR ( ustained Virological Response): Đáp ứng siêu vi lâu dài SNP (single nucleotide polymorphism): Tính đa hình đơn nucleotide ULN (Upper Limit of Normal): Giới hạn mức ình thường Trang GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Trang 152 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết đánh giá cặp mồi NS5B_F1, NS5B_R NS5B_F2 AnnHyb (trình tự gen tham chiếu có mã số truy cập NC_009827) BLAST Trang 153 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết đánh giá cặp mồi DM107 DM106 AnnHyb (trình tự gen tham chiếu có mã số truy cập NC_009827) BLAST Trang 154 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết đánh giá cặp mồi DM105 DM104 AnnHyb (trình tự gen tham chiếu có mã số truy cập NC_009827) BLAST Trang 155 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Trang 156 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết đánh giá cặp mồi R4, R3 R5 AnnHyb AnnHyb (trình tự gen tham chiếu có mã số truy cập NC_009827) BLAST Trang 157 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết đánh giá cặp mồi F56_1-3 R56_1-3 AnnHyb (trình tự gen tham chiếu có mã số truy cập NC_004102) BLAST Trang 158 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy PH L C Kết BLAST hệ mồi-mẫu d xác định SNP rs12979860 Hình ồi R 1F Hình ồi R 1F Trang 159 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình ẫu d ồi R Trang 160 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Kết BLAST hệ mồi-mẫu d xác định SNP rs8099917 Hình ồi R 6F Hình ồi R 6R Trang 161 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình ẫu d R PH L C Hình Kết BLAST trình tự X3601-6-9 Trang 162 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết BLAST trình tự X3602-6-9 Hình Kết BLAST trình tự X3602-7-9 Hình Kết BLAST trình tự X3602-14-8 Trang 163 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết BLAST trình tự 1317 Hình Kết BLAST trình tự X3601 Hình Kết BLAST trình tự VA-1 Trang 164 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình Kết BLAST trình tự X3603 Hình Kết BLAST trình tự VA-6 Hình 10 Kết BLAST trình tự X3602 Trang 165 GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Hình 11 Kết BLAST trình tự X3604 Hình 12 Kết BLAST trình tự X3604-15-8 Trang 166 ... GAN SIÊU VI C: TÁI XÁ ĐỊNH KIỂU GEN DỰA TRÊN VÙNG TRÌNH TỰ NS5B VÀ XÁ ĐA H NH ĐỊNH Á ĐỘT BIÊN ĐƠN NU LEOTIDE (SNP) TRÊN GEN IL28B NHẰM TIÊN LƯỢNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ THÍCH HỢP CHO BỆNH NHÂN... liệu trên, vi? ? ?c tiến hành đề tài ? ?Virus gây vi? ?m gan siêu vi C: Tái x? ?c định kiểu gen dựa trình tự vùng gen mã hóa protein khơng c? ??u tr? ?c (Non Structure) NS5B x? ?c định đột iên đa hình đơn nucleotide. .. HCV Đối với điều trị vi? ?m gan siêu vi C, vi? ? ?c định lượng định genotype virus HCV quan trọng, đ? ?c biệt định genotype C? ?c genotype kh? ?c HCV c? ? ph? ?c đồ điều trị kh? ?c (về thu? ?c, thời gian điều trị,