Xác định môi trường cảm ứng tạo phôi thích hợp và cải thiện khả năng tạo dòng đơn bội kép bằng colchicine trong nuôi cấy bao phấn bắp nghiên cứu khoa học

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG TÊN ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG CẢM ỨNG TẠO PHÔI THÍCH HỢP VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TẠO DỊNG ĐƠN BỘI KÉP BẰNG COLCHICINE TRONG NUÔI CẤY BAO PHẤN BẮP Mã số đề tài: Thuộc nhóm ngành khoa học: Nơng – Lâm – Ngƣ nghiệp Bình Dƣơng, 4/2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG TÊN ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH MƠI TRƢỜNG CẢM ỨNG TẠO PHƠI THÍCH HỢP VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TẠO DÒNG ĐƠN BỘI KÉP BẰNG COLCHICINE TRONG NI CẤY BAO PHẤN BẮP Thuộc nhóm ngành khoa học: Nông – Lâm – Ngƣ nghiệp Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Năm thứ: /4 Lớp: NN01, khoa: Công nghệ sinh học Ngành học: Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS Lê Thị Kính Ngƣời hƣớng dẫn 2: CN Phạm Ngọc Hải Bình Dƣơng, 4/2014 i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan bắp 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Nguồn gốc phân bố .3 1.1.3 Tình hình sản xuất bắp trên giới Việt Nam 1.1.4 Vai trò bắp kinh tế 1.2 Tổng quan nuôi cấy bao phấn bắp 1.2.1 Các giai đoạn phát triển in vivo hạt phấn bắp 1.2.2 Sự phát triển hạt phấn bắp điều kiện in vitro 1.2.3 Các nghiên cứu ni cấy bao phấn ngồi nƣớc 1.2.4 Các nhân tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy bao phấn bắp .9 1.2.5 Cải thiện khả tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy bao phấn bắp colchicine .15 Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu .18 2.1.1 Địa điểm thời gian thí nghiệm 18 2.1.2 Vật liệu 18 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Xác định giai đoạn phát triển hạt phấn bắp in vivo 19 2.2.2 Thí nghiệm 1: Xác định mơi trƣờng cảm ứng tạo phơi thích hợp cho ni cấy bao phấn bắp 19 ii 2.2.3 Thí nghiệm 3: Cải thiện khả tạo dịng đơn bội kép ni cấy bao phấn bắp colchicine 22 Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Xác định giai đoạn phát triển hạt phấn bắp in vivo .25 3.2 Thí nghiệm 1: Xác định mơi trƣờng cảm ứng tạo phơi thích hợp cho ni cấy bao phấn bắp 29 3.3 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng myo-inositol nồng độ sucrose lên tạo phôi bao phấn bắp 34 3.4 Thí nghiệm 3: Cải thiện khả tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy bao phấn bắp colchicine 39 3.4.1 Ảnh hƣởng colchicine lên khả cảm ứng tạo phôi bao phấn bắp 39 3.4.2 Ảnh hƣởng colchicine lên khả tái sinh nuôi cấy bao phấn bắp 41 3.4.3 Ảnh hƣởng cochicine đến khả tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy bao phấn bắp 43 Phần 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 iii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Thành phần hóa học hạt bắp tẻ so với gạo phân tích 100g Bảng 2.1: Các hóa chất đƣợc sử dụng đề tài 18 Bảng 2.2: Các nghiệm thức thí nghiệm 20 Bảng 2.3: Các nghiệm thức thí nghiệm 21 Bảng 2.4: Các nghiệm thức thí nghiệm 22 Bảng 3.1: Tỉ lệ phôi tạo thành từ bao phấn bắp ba môi trƣờng MS, N6, YP 29 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng myo-inositol nồng độ sucrose lên tạo phôi bao phấn bắp NK 35 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng myo-inositol nồng độ sucrose lên tạo phôi bao phấn bắp HN88 36 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng colchicine lên khả cảm ứng tạo phôi bao phấn bắp NK67 ngày thứ 30 sau nuôi cấy 39 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng colchine lên khả tái sinh nuôi cấy bao phấn bắp 41 iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1: Sự phát triển in vitro hạt phấn bắp Hình 1.2: Cấu tạo cờ bắp bắp 12 Hình 3.1: Bắp nguồn HN88 NK67 đƣợc trồng chăm sóc nhà lƣới sau 30 ngày gieo hạt 25 Hình 3.2: Một số giai đoạn phát triển in vivo hạt phấn bắp độ phóng đại 40X 26 Hình 3.3: Sự tƣơng quan giai đoạn phát triển hạt phấn với hình thái cờ bắp, bắp bao phấn 27 Hình 3.4: Ni cấy bao phấn bắp NK67 môi trƣờng cảm ứng tạo phôi N6 28 Hình 3.5: Cấu trúc phơi hình thành từ nuôi cấy bao phấn bắp HN88 môi trƣờng YP sau 34 ngày nuôi cấy 32 Hình 3.6: Phơi phát sinh từ bao phấn bắp NK67 môi trƣờng YP sau 34 ngày nuôi cấy 33 Hình 3.8: Phôi phát sinh từ bao phấn bắp HN88 nghiệm thức S12M0 sau 34 ngày nuôi cấy 38 Hình 3.9: Cây bắp NK67 mơi trƣờng tái sinh sau 10 ngày ni cấy 42 Hình 3.10: Cây bắp in vitro từ nuôi cấy bao phấn bắp NK67 sau 55 ngày chuyển nhà lƣới 45 v DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng cochicine đến khả tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy bao phấn bắp 43 vi DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT CTCP: Công ty cổ phần MS: Murashige and Skoog, 1962 PTN: Phịng thí nghiệm N6: Chu, 1975 YP: Ku cs, 1981 vii BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung - Tên đề tài: Xác định mơi trƣờng cảm ứng tạo phơi thích hợp cải thiện khả tạo dòng đơn bội kép colchicine nuôi cấy bao phấn bắp - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Lớp: NN01 Khoa: Công nghệ sinh học Năm thứ: - Sinh viên thực hiện: Hồ Thanh Tùng Lớp: NN01 Khoa: Công nghệ sinh học Năm thứ: - Số năm đào tạo: Số năm đào tạo: Ngƣời hƣớng dẫn: TS Lê Thị Kính CN Phạm Ngọc Hải Mục tiêu Mục tiêu dài hạn: Sử dụng phƣơng pháp cấy bao phấn để tạo dòng bắp chủng ƣu tú thời gian ngắn, phục vụ cho công tác lai chọn tạo giống bắp ƣu lai F1 Mục tiêu cụ thể: - Xác định mơi trƣờng thích hợp cho cảm ứng tạo phôi nuôi cấy bao phấn kiểu gen bắp sử dụng đề tài - Nâng cao tỉ lệ đơn bội kép tái sinh từ bao phấn bắp việc xử lý colchicine - Từ kết nghiên cứu đề tài, nghiên cứu ứng dụng số kiểu gen bắp khác Tính sáng tạo - Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn bắp tạo dòng ƣu tú thời gian ngắn với độ cao - Sử dụng colchicine cải thiện tỉ lệ cấy đơn bội kép tái sinh từ bao phấn bắp viii - Cây tái sinh từ nuôi cấy bao phấn bắp đƣợc sử dụng phục vụ cho lai tạo giống bắp ƣu lai F1 nghiên cứu di truyền biến dị Kết nghiên cứu Đối với thí nghiệm xác định mơi trƣờng cảm ứng tạo phơi thích hợp cho ni cấy bao phấn Môi trƣờng cảm ứng tạo phôi thích hợp ni cấy bao phấn bắp mơi trƣờng YP + 500mg/l casein hydrolysate + 0,5 g/l than hoạt tính + 12 g/l sucrose + 0,1 mg/l TIBA Myo-inositol khơng có tác dụng kích thích tạo phôi nuôi cấy bao phấn bắp Ở nồng độ 50 mg/l, myo-inositol ức chế tạo phôi bao phấn bắp Nồng độ sucrose thích hợp để ni cấy bao phấn bắp NK67 HN88 môi trƣờng YP 12% Đối với thí nghiệm cải thiện khả tạo dịng đơn bội kép ni cấy bao phấn bắp colchicine Xử lý bao phấn colchicine 0,02% 0,003% ba ngày trƣớc nuôi cấy không gây ảnh hƣởng xấu đến khả cảm ứng tạo phôi tái sinh từ nuôi cấy bao phấn bắp Xử lý bao phấn colchicine 0,02% ba ngày trƣớc nuôi cấy làm tăng tỉ lệ đơn bội kép nuôi cấy từ bao phần kiểu gen NK67 Đóng góp mặt kinh tế - xã hội Sản phẩm: - Môi trƣờng cảm ứng tạo phơi thích hợp cho ni cấy bao phấn bắp - Tạo dòng đơn bội kép thời gian ngắn với số lƣợng lớn - Báo cáo khoa học - Góp phần làm phong phú nguồn bắp giống thị trƣờng, đẩy mạnh phát triển nông nghiệp nƣớc nhà Khả áp dụng đề tài: 49 20 CIMMYT (2001), 1999/2000 word Maize Facts and Trends, p.60 21 Das U.R., Hadiuzzaman S., Barker R.H (2002), Effects of microspore stage, pre and post temperature and donors environment on maize (Zea mays L.) anther culture response, Plant Tissue Culture, 12(1), pp 37-47 22 Dieu P and Backert M (1986), Further studies of androgenetic embryo production and plant regeneration from in vitrocultured anthers in maize (Zea mays L.) Maydica, 3, pp 245-259 23 Dunwell J.M (2010), Haploids in flowering plants: origins and exploitation., Plant Biotechnol , 8, pp 377–424 24 Dupuis I and Pace G.M (1992), Gene transfer to maize male reproductive structure by particle bombardment of tassel primordia, Plant cell report, 12, pp 607-611 25 FAOSTAT (2007), FAO Statistics Division, pp.336 26 Genovesi A.D (1990), Maize (Zea mays L.) In vitroproduction of haploids In Biotechnology in Agriculture and Forestry, Haploids in Crop Improvement I, Ed Bajaj Y.P.S., Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hongkong, 12: 176-203 27 Genovesi A.D and Collins G.B (1982), In vitroproduction of haploid plants of corn via anther culture, Crop Science, 22, pp 1137-1144 28 Genovesi A.D and Yingling R.A (1990), Isolated microspore culture of Zea mays L., Abstract VIIth International Congress Plant Tissue and Culture, IAPTC, Amsterdam, pp.186 29 Germanà M A (2009), Haploid and doubled haploids in fruit trees In: Touraev A, Forster B, Jain M (eds) Advances in haploid production in higher plants, Springer, Heidelberg, pp 241–263 50 30 Greyson R.I and Dunlop J.D (1886), Generation of embryoids from primary and secondary anther cultures, Maize Genetics Newsletter, 60, pp 64-66 31 Guha S., Maheshwari S.C (1964), In vitro production of embryos from anthers of Datura, Nature, 204, pp 497–498 32 Hassan L., Ahmad S.D and Okumus A (2001), The direct regeneration of maize haploids through anther culture, On Line Journal of Biological Sciences, 1(10), pp.900-901 33 Heberle-Bros E (1982), In vitropollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L and its relation to pollen sterility, sexual balance and floral induction of the pollen donor plans, Planta, pp 396-401 34 Hongchang M., Liang G.H and Wassom C.E (1991), Effect of growth regulators and genotypes on callus and embryoid induction from maize anther culture, Plant Breeding, 105, pp 47-52 35 Kasha K.J., Kao K.N (1970), High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.) Nature, 225, pp.874–876 36 Kovacs G., Kovacs M and Barnabas (1992), Effect ofgenotype and induction nutrient medium in maize anther culture, Novenytermeles, 41(3), pp 193-200 37 Ku M.K., Cheng W.C., Kuo L.C., Kuan Y.L., An H.P and Huang C.H (1981), Induction factors and morphocytological characteristics of pollen – derived plants in maize (Zea mays) Proceedings of Symposium Plant Tissue Culture, pp.35-42 38 Kuo C., Tsai C., Quin Y and Zhang S (1988), Anther culture and plant regeneration from protoplast of maize (Zea mays L.) Biotechnology Applied Biology, pp.703-708 Recent Advances 51 39 Last D.I., Brettell R.I.S (1990), Embryo yield in wheat anther culture is influenced by the choice of sugar in the culture medium, Plant cell Reports, 9, pp 14-16 40 Lyne R.l., Benette R.I., Hunter C.P (1986), Embryoid and plant pro-duction from cultured barley anthers, In: L.A Withers andP.G Anderson (eds) Plant Tissue Culture and Its Agricultural Application, pp 405-411 41 Miao S.H., Kuo C.S., Gui Y.L., Sun A.T., Ku S.Y., Lu W.L and Wang Y.Y (1978), Induction of plants of maize and observations on their progency, In Proceedings of Symposium Plant Tissue Culture Science, Press, Peking, pp 2333 42 Mohammadi P.P., Moieni A., Jalali-Javaran M (2007), Colchicine induced embryogenesis and doubled haploid production in maize (Zea mays L.) anther culture, Ranian journal of Biotechnology, (3) 43 Moraes A.P, Bered F., Carvalho F.I.F., Kaltchuk-Santos E (2008), Morphological Markers for Microspore Developmental Stage in Maize, An international journal, 51 (5), pp 911-916 44 Murashige T and Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Physiological Plant, 15, pp 473-497 45 Niroula R.K., Sah B.P., Bimb H.P and Nayak S (2005), effect of genotype and culture media on callus induction and plant regeneration from matured rice grain culture, J Inst Agric Anim Sci., 26, Pp.21-26 46 Nitsch C., Anderson S., Godard M., Neuffer M.G and Sheridan W.F (1982), Production of haploid plants of Zea maysand Penisetum through androgenesis, In Variabilities in Plants Regenerated from Tissue Culture Ed Earle E.D Demarly Y Praeger, New York, pp 69-91 47 Nitsch JP, Nitsch C (1969), Haploid plants from pollen grains, Science, 163, pp 85-87 52 48 Pace G.M., Reed J.N., Ho L.C and Fahe J.W (1987), Anther culture of maize and visualization of embryogenic microspores by fluorescent microscopy, Theoretical Applied Genetics, 73, pp 863-869 49 Pescitell S.M and Petalino J.F (1988), Microspore development in culture maize anthers, Plant Cell Report, 7(6), pp 441-444 50 Petalino J.F and Jones A.M (1986), Anther culture of elite genotypes of Zea mays L Crop Science, 26, pp 1024-1074 51 Petalino J.F and Thompson S.A (1987), Genetic analysis of anther culture response in maize, Theoretical Applied Genetics, 74, pp 284-286 52 Raina S.K (1989), Tissue culture in rice improvement: Status and potential Adv Agron, 42, pp 339-398 53 Saisingtong S., Schmid J.E., Stamp P and BUTER B (1996), Colchicine mediated chromosome, Theoretical Applied Genetics, 92(8), pp 1017-1023 54 Sangwan-Norreel B.S., Sangwan R.S., Pare J (1986), Haploidie et embryogenèse provoquée in vitro, Bull Society of Botany, 4, pp.7–39 55 Satorova T.N (1994), Specific features of the cultureof maize anthers on the example of genotype B14 x Wt9, Izvestiya An Rossijskaya AN Seriya Biologiceskay (Russian Fed.), 5, pp 771-773 56 Sheridan W.F., Nitsh, C and Neuffer (1980), Antherculture studies, Maize Genetics Cooperation Newsletter, p.54 57 Takashima S., Hasegava H., Nakamura A (1995), A simple method for chromosome doubling in tobacco anther culture – direct applica-tion of colchicine to anthers before culture, Breed Sci, 45, pp 107–110 58 Thompson K.F (1972), Oil-seed rape, In: Reports of the Plant Breeding Institute, Cambridge University Press, Cambridge, pp 94–96 59 Tsay H.S and Widholm J.M (1986), International Congress Plant Cell Culture, 6, pp 125 60 Wassom., J.J., Mei, Rocheford T.R and Widholm J.M (2001), Interaction of environment and ABA and GA treatment on the maize anther culture response, Plant Cell Tissue Organ Culture, 64(1), pp 69-72 53 61 Yuan Y.X., Geng J.F., Zhang X.W., Jiang W.S., Han Y.P and Gao M.Q (2001), Studies on factors affecting embryoid induction efficiency in maize (Zea mays L.) anther culture, Acta Agriculturae Boreali Sinica, 16(3), pp 1216 62 Zaki M., Dickinson H (1995), Modification of cell development in vitro: the effect of colchicine on anther and isolated microspore culture in Brassica napus, Plant Cell Tissue Organ Culture, 40, pp 255–270 63 Zheng W.Z., Huan J.X., Guan Y.L and Wang W.X (1983), Effects of plant harmones on maize anther culture, Cell Tissue Culture Technical Cereal Crop Improvement, pp 434 Internet 64 http://vi.wikipedia.org/wiki/Ng%C3%B4 65 http://tuoitre.vn/Pages/Printview.aspx?ArticleID=581341 54 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần hóa học mơi trƣờng MS, YP, N6 STT Vi lƣợng Đa lƣợng MS YP N6 (mg/l) (mg/l) (mg/l) Tên hóa chất CoCl2.6H2O 0,025 - - CuSO4 0,025 - - FeNaEDTA 36,70 - 36,70 H3BO3 6,20 - 1,60 KI 0,83 - 0,80 MnSO4.H2O 16,90 440 3,33 Na2MoO4.2H2O 0,25 - - ZnSO4.7H2O 8,60 150 1,50 CaCl2 332,02 3,52 125,33 10 KH2PO4 170,00 10,2 400,00 11 KNO3 1900,00 50,0 2830,00 12 MgSO4 180,54 7,4 90,27 13 NH4NO3 1650,00 3,3 463,00 14 Glycine 2,00 - 2,00 15 myo-Inositol 100,00 - - 16 Nicotinic acid 0,50 0,52 0,50 17 Pyridoxine HCl 0,50 - 0,50 18 Thiamine HCl 0,10 0,10 1,00 19 Glutamic - 50,0 - 20 L prolin - 50,0 - 21 Asparagin - 6,0 - Vitamin 55 Bảng ANOVA 1: ảnh hƣởng ba môi trƣờng MS, N6, YP đến tỷ lệ tạo phôi bao phấn bắp ngày thứ 30 56 Bảng ANOVA 2: ảnh hƣởng ba môi trƣờng MS, N6, YP đến tỷ lệ tạo phôi bao phấn bắp ngày thứ 34 57 Bảng ANOVA 3: Ảnh hƣởng myo-inositol nồng độ sucrose lên tạo phôi bao phấn bắp NK ngày thứ 34 58 Bảng ANOVA 4: Ảnh hƣởng myo-inositol nồng độ sucrose lên tạo phôi bao phấn bắp NK ngày thứ 38 59 Bảng ANOVA 5: Ảnh hƣởng myo-inositol nồng độ sucrose lên tạo phôi bao phấn bắp HN88 ngày thứ 34 60 Bảng ANOVA 6: Ảnh hƣởng myo-inositol nồng độ sucrose lên tạo phôi bao phấn bắp HN88 ngày thứ 38 61 Bảng ANOVA 7: Ảnh hƣởng colchicine lên tạo phôi bao phấn bắp NK67 ngày thứ 30 62 Bảng 8: So sánh khác biệt khả cảm ứng tạo phôi nghiệm thức xử lý colchicine 0,02% nghiệm thức đối chứng t-Test: Paired Two Sample for Means Mean Variance Observations Pearson Correlation Hypothesized Mean Difference Df t Stat P(T