TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, HÓA HỌC,TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA TRINH NỮ HOÀNG CUNGCRINUM LATIFOLIUM L. VÀ VIỆC PHÂN LẬP CÁC ALKALOID TRONG CÂY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI NGUYỄN TẤT THÀNH

KHOA DƯỢC - BỘ MÔN DƯỢC LIỆU

-Đồ án chuyên ngành

TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, HÓA HỌC,TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA TRINH NỮ HOÀNG

CUNG CRINUM LATIFOLIUM L

VÀ VIỆC PHÂN LẬP CÁC ALKALOID TRONG CÂY

TP Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI NGUYỄN TẤT THÀNH

KHOA DƯỢC - BỘ MÔN DƯỢC LIỆU

-Đồ án chuyên ngành

TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, HÓA HỌC,TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA TRINH NỮ HOÀNG CUNG

CRINUM LATIFOLIUM L

VÀ VIỆC PHÂN LẬP CÁC ALKALOID TRONG CÂY

GVHD: Nguyễn Tường VânSinh viên thực hiện:

Phan Thị Lan – 1511536411 - 16DDS.CL2A Lê Thị Hường – 1600000457 - 16DDS.CL3A Nguyễn Thị Huyền – 1600000191 - 16DDS.CL2A Vũ Thị Thúy Hường – 1600000190 - 16DDS.CL2A Quách Thị Huyền Trang – 1600000189 - 16DDS.CL2A

Tp Hồ Chí Minh, năm 2018

1.3.2 Phân bố - Sinh thái 6

CHƯƠNG II THÀNH PHẦN HÓA HỌC 7

CHƯƠNG IV SƠ LƯỢC VỀ BỆNH U XƠ TỬ CUNG 16

4.1 Tỷ lệ và yếu tố thuận lợi 16

4.2 Nguyên nhân 16

4.3 Triệu chứng 17

4.4 Hướng điều trị 17

CHƯƠNG V KINH NGHIỆM SỬ DỤNG 18 5.1 Điều trị u tuyến tiền liệt, u nang buồng trứng, u xơ tử cung, u vú, viêm loét dạ dày

5.2 Chữa u xơ tiền liệt tuyến 18

5.3 Điều trị viêm họng hạt 19

5.4 Tăng sức đề kháng cho bệnh nhân ung thư 19

5.5 Các bài thuốc của tiến sĩ võ văn chi 19

5.6 Một số kinh nghiệm khác 20

CHƯƠNG VI CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG TRINH NỮ HOÀNG CUNG 21

6.1 Các quy trình chiết cao cồn, alkaloid từ TNHC 21

6.1.1 Chiết cao cồn, phân đoạn alkaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt 21 6.1.2 Chiết alcaloid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp 21

6.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC 21

6.3 Thiết lập chất đối chiếu 21

6.4 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu đối chiếu 23

6.4.1 Tiêu chuẩn chung 23

6.4.2 Dữ liệu phổ của CĐC criamidin 24

6.4.3 Dữ liệu phổ của CĐC lycorin 25

6.4.4 Dữ liệu phổ của CĐC hippadin 25

6.5 Xây dựng phương pháp HPLC,CE, dấu vân tay để định tính, định lượng alkaloid 26 6.5.1 Quy trình xử lý mẫu 26

6.5.2.Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng HPLC 26

6.5.3 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng CE 26

6.5.6 Phương pháp dấu vân tay định tính alkaloid 27

7.1 Tổng quan 29

7.2 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 30

7.2.1 Nguồn dược liệu 30

7.2.2 Quy trình chiết các hợp chất tự nhiên 31

7.2.3 Chiết phân đoạn và phân lập 31

7.2.4 Xác định hợp chất tinh khiết, 6-Hydroxycrinamidin (6HC) 32

7.2.5 Hoạt tính chống oxy hóa 32

7.2.5.1 Thử nghiệm DPPH 32

7.2.5.2 Thử nghiệm tẩy trắng β-caroten 32

7.2.6 Chuẩn bị đại thực bào 33

7.2.6.1 Động vật 33

7.2.6.2 Chuẩn bị đại thực bào phúc mạc chuột 33

7.2.6.3 Chuẩn bị bạch cầu đơn nhân người 33

7.2.7 Chuẩn bị mẫu 33

7.2.8 Thử nghiệm MTT 33

7.2.9 Độc tính trên tế bào lympho, EL4-luc2 34

7.2.10 Thử nghiệm sản xuất ROS 34

7.2.11 Xác định sự ức chế khuếch đại tín hiệu của EL4-luc2 qua hoạt động của đại

7.3.3.2 Tế bào khối u (EL4-luc2) 36

7.3.4 Nghiên cứu sự sản xuất ROS bởi bạch cầu đơn nhân khi có mặt dịch chiết TNHC 36

Phụ lục A Các thông tin liên quan 44

Tài liệu tham khảo 45

LỜI CÁM ƠN

“Cuộc vui nào rồi cũng sẽ tàn”, đây là câu nói mọi người thường dùng trong những cuộc chia ly, và đây cũng là hiện thực chúng em sắp phải đối mặt Đa số chúng em bước vào ngôi trường Đại học Nguyễn Tất Thành này đều từ những sinh viên cao đẳng Dược và rồi từ đó liên thông lên đại học Dược Do đó, thời gian chúng em gắn bó với ngôi trường này chắc hẳn nhiều hơn đa số những sinh viên khác Vì vậy, đến khi sắp phải rời khỏi ngôi trường này, chúng em không tránh khỏi cảm giác buồn rầu và hụt hẫng Đây có lẽ cũng là môn học cuối cùng chúng em được các thầy cô hướng dẫn và chỉ dạy.

Là một trong những sinh viên ngành Dược của trường ĐH Nguyễn Tất Thành, trong quá trình học tập tại nhà trường chúng em đã hiểu rõ được tầm quan trọng của ngành Dược đối với sức khỏe con người đồng thời luôn nắm được trách nhiệm của bản thân khi sau này sẽ là người có ảnh hưởng đến sức khỏe tính mạng của mọi người Là sinh viên năm cuối, chúng em luôn muốn được học hỏi hết mình trước khi rời khỏi ghế nhà trường để nắm cho mình những kiến thức chuyên ngành thật vững chắc Và trường Đại học Nguyễn Tất Thành cũng như các thầy cô đang giảng dạy tại trường đã luôn tạo điều kiện cho chúng em học hỏi trong suốt quãng thời gian qua.

Không những thế, trường còn tạo điều kiện cho chúng em được thực hành môn Đồ án chuyên ngành, mà qua đó chúng em có cơ hội được nghiên cứu sâu hơn về bộ môn Dược liệu Qua quá trình nghiên cứu, chúng em đã biết được rằng những bước đầu khi nghiên cứu tìm hiểu về cây thực vật đòi hỏi rất nhiều sự tỉ mỉ, chính xác và kiên trì Nhờ đó, phần nào chúng em cũng hiểu được nỗi khó khăn và vất vả của các thầy cô khi nghiên cứu và giảng dạy bộ môn này.

Lời đầu tiên chúng em xin cảm ơn trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo điều kiện cho chúng em được thực hiện môn học này Và đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Tường Vân đã không ngại khó khăn mà giúp đỡ chúng em tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện, chúng em còn thiếu kinh nghiệm nên không tránh được những thiếu sót, vì vậy kính mong thầy cô thông cảm bỏ qua và góp ý để chúng em có thể rút kinh nghiệm và hoàn thiện bài đồ án một cách tốt hơn.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tại Việt Nam, Trinh nữ hoàng cung từ lâu đã được coi là vị thuốc quý Theo nghiên cứu khoa học gần đây, công dụng của Trinh nữ hoàng cung được quan tâm và đã thử nghiệm trên lâm sàng được ứng dụng phổ biến như thực phẩm chức năng hoặc thuốc Các dịch chiết alkaloid từ lá TNHC có tác dụng điều trị u xơ tử cung, phì đại lành tính tuyến tiền liệt với chế phẩm như Crila; bên cạnh đó tác dụng kháng viêm, chống oxi hóa cũng đã được nghiên cứu và công bố Các kết quả nghiên cứu về cây TNHC của Ts.Ds Nguyễn Thị Ngọc Trâm từ năm 1990 được liên tục công bố trên các tạp chí khoa học uy tín quốc tế Ngoài ra còn có công trình nghiên cứu của Ts.Ds Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh Nữ

Hoàng Cung – Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”

Để đảm bảo chất lượng, nâng cao giá trị sử dụng và phát triển nghiên cứu sâu hơn về TNHC chúng em thực hiện đề tài “Đặc điểm thực vật, hóa học, tác dụng của Trinh nữ hoàng cung và việc phân lập các alkaloid trong cây” với mục tiêu tổng hợp tài liệu, trình bày các nội dung cơ bản về cây TNHC, cụ thể như sau:

- Tổng quan về thực vật học

- Tổng quan về thành phần hóa học - Các tác dụng dược lý chính

- Kinh nghiệm sử dụng trong dân gian - Các phương pháp chiết xuất alcaloid

- Phân lập hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung.

- Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây Trinh nữ hoàng cung - Xây dựng quy trình định tính, định lượng alkaloid bằng phương pháp HPLC - Bài dịch về cây Trinh nữ hoàng cung

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây Trinh Nữ Hoàng Cung 4

Hình 1.2: Thân cây Trinh Nữ Hoàng Cung 4

Hình 1.3: Phiến lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung 5

Hình 1.4: Cụm hoa cây Trinh Nữ Hoàng Cung 5

Hình 1.5: Hoa cây Trinh Nữ Hoàng Cung 6

Hình 1.6: Quả Trinh Nữ Hoàng Cung 6

Hình 1.7.(1) Cây với thân hành và lá (2) Cụm hoa (3) Một phần bao hoa và bộ nhị; (4) Bộ nhụy 6

Hình 1.8 Cấu tạo vi phẫu và sơ đồ cấu tạo lá Trinh nữ hoàng cung 7

Hình 1.9 Mép lá với 2 lớp tế bào 7

Hình 1.10 Sơ đồ cấu tạo chi tiết lá Trinh nữ hoàng cung 8

Hình 1.11: Mảnh biểu bì mang lỗ khí có cấu tạo đặc trưng của lớp 1 lá mầm 8

Hình 1.12 Cấu tạo vi phẫu và sơ đồ cấu tạo rễ 8

Hình 1.14 Mảnh biểu bì mang lỗ khí 9

Hình 1.15 Mảnh mô mềm 9

Hình 1.16 Mạch xoắn 9

Hình 1.17 Tinh thể calci oxalat hình kim 9

Hình 2.2 Các alkaloid khung Crinin 10

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của các hợp chất Flavonoid trong cây TNHC 11

Hình 7.1 6-Hydroxycrinamidin (6HC) 35

Hình 7.2 Tác dụng dịch chiết của TNHC lên khả năng tồn tại của các đại thực bào 36

Hình 7.3 Ảnh hưởng của dịch chiết CL đến sự gia tăng của tế bào lympho EL4-luc2 ở 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy 37

Hình 7.4 Ảnh hưởng dịch chiết TNHC đến sự sản xuất ROS trong tế bào đơn nhân 37

Hình 7.5 Ảnh hưởng của dịch chiết TNHC trong việc điều chỉnh khả năng của các tế bào đơn nhân người sau khi xử lý 24 giờ để tạo ra ROS sau khi kích thích bởi PMA, zymosan hoặc fMLP 39 Hình 7.6 Ảnh hưởng của dịch chiết nước và flavonoid của TNHC trên sự biểu hiện IL1-β, TNFα và IL-6 mARN trong các đại thực bào phúc mạc 39 Hình 7.7 Ảnh hưởng của dịch chiết nước và flavonoid của TNHC trên thụ thể mannose, CD36, Dectin-1 và TGFβ mARN trong các đại thực bào phúc mạc 40 Hình 7.8 Ảnh hưởng của chất dịch chiết nước và flavonoid của TNHC trên oxygenase-1å(HO-1), NAD(P)H: quinoneoxidoreductase (NQO1) và Nrf2 mARN biểu hiện trên các đại thực bào phúc mạc 40 Hình 7.9 Tác dụng của dịch chiết TNHC đối với hoạt động chống khối u của đại thực bào màng bụng 44

DANH MỤC BẢNG

Bảng 6.1 Thành phần pha động của các quy trình xác định độ tinh khiết của các

nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC 28

Bảng 6.2 Kết quả độ tinh khiết sắc ký (%) của các CĐC bằng HPLC 28

Bảng 6.3 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của CĐC sau khi đóng gói 29

Bảng 6.4 Giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC 30

Bảng 6.5 Kết quả định lượng alcaloid trong lá TNHC (n = 6) 32

Bảng 7.1: Tính chất oxi hóa khử của các dịch chiết TNHC 47

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TIẾNG VIỆT

Al-NK Dịch chiết cồn được chiết alkaloid AL-NK.

Al-SPE Alkaloid được chiết bằng phương pháp chiết pha Al-SA Cắn alkaloid chiết từ mẫu thử

TIẾNG ANH

BPH Benign Prostatic Hyperplasia

ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity PC3 Prostate Cancer Cell Line

PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells MTH Methylthiohydantoin-Tryptophan

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1 Vị trí trong bảng phân loại thực vật [26]

Họ Amaryllidaceae và chi Crinum Họ Amaryllidaceae có tên gọi theo đa số tài liệu

của các nhà thực vật học Việt nam là họ Thủy tiên, Loa kèn đỏ, Náng hay Lan Huệ Vị

trí của chi Crinum thuộc họ Thủy tiên theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín

của A L Takhtajan công bố năm 1987 và đã sửa đổi năm 2009 như sau:

Bộ Thủy tiên (Amaryllidales) Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae)

Chi Crinum L Loài C.latifolium

1.2 CHI CRINUM

Crinum thuộc họ Thủy tiên: thân cỏ, sống nhiều năm nhờ hành hay thân rễ Lámọc từ gốc, mỏng hay mọng nước, gân lá song song Riêng về chi Crinum, các

bẹ lá hợp thành thân giả cao 10-15 cm Cụm hoa dạng chùm, tán, ít hay nhiều

hoa và có một mo bao lại Trục cụm hoa dài mọc từ mặt đất Hoa đều, lưỡng

tính, 5 vòng, mẫu 3 Bao hoa: 6 phiến cùng màu dạng cánh hoa, dính thành ống dài, ít khi rời Vài loại có tràng phụ Bộ nhị: 6 nhị đính trên 2 vòng Chỉ nhị rời hay dính nhau Bao phấn thẳng hay lắc lư Bộ nhụy: 3 lá noãn tạo thành bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa nhiều noãn, đính noãn trung trụ; 1 vòi nhụy, đầu nhụy chia

3 thùy Quả thông thường là nang nứt lưng Hạt có nội nhũ [27]

Chi Crinum có khoảng 130 loài ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùngnóng Ở Việt Nam, chi Crinum có 6 loài được trồng làm cảnh và làm thuốc:Crinum amabile Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl.,Crinum giganteum Andr., Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F [27]

Crinum asiaticum L.

Crinum amabile Donn.

Crinum defixum Ker Gawl

Crinum latifolium L.

Crinum giganteum Andr

Crinum moorei Hook.f.

Cây thân thảo lưu niên, cao 1m Lá mọc từ gốc, nhiều dài 1m, rộng 5-10 cm Cụm hoa hình tán, mang 6-12 hoa Hoa có ống mảnh, màu lục, các phiến hoa giống nhau, hẹp, dài, 6 nhị có chỉ nhị đỏ, bao phấn vàng Quả mọng hình gần tròn, đường kính 3-5 cm, thường chỉ chứa 1 hạt.

Hành tròn, đường kính đến 15cm, phía trên có một cái cổ dài 30 đến 40; bao bởi nhiều lá hình ngọn giáo, dày, màu xanh lục, dài khoảng 1m và rộng 0,10m Hoa có ống hình trụ màu đỏ tươi, dài 10cm, có các phiến cuốn ngoài tập hợp 20 - 30 đóa thành tán ở đầu của một cán hoa dẹp, mọc từ rễ, dài 60cm đến 1m Cây có hành tròn, đường kính 5 - 6cm, vẩy có màu nâu, thân giả cao Lá hình dải dài 30 - 60cm, rộng 2 - 3cm, đầu nhọn Cán hoa mảnh, màu mận quân, tán gồm 5 - 6 hoa bao bởi những hoa màu xanh xanh Lá dài và cánh hoa hình dải, dài 5 - 6cm, màu lục nhạt, mặt ngoài ửng hồng hay tím, ống hoa màu đỏ; chỉ nhị đỏ; bầu hình trứng ngược có vòi nhụy mảnh.

Loại cỏ, thân hành, đường kính 10-15 cm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài 10-15 cm Có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80-100 cm, rộng 5-8 cm, hai bên mép lá lượn song Hoa mọc thành tán gồm 6-18 hoa, trên một cán hoa dài 30-60 cm cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ.

Hành to, đường kính đến 15cm, với cổ dài Lá hình dải dài 1m và rộng 10 - 12cm Cán hoa ở bên, dẹp, cao đến 1m, mang 5 hay 6 hoa màu trắng có vệt xanh ở ngoài, vòi các phiến thuôn, tù, lợp, dài đến 10cm Chỉ nhị màu trắng; bao phấn màu xanh đậm.

Hành lớn, hình trứng, mang ở phần trên một cổ cao 30cm Lá lớn, trải ra, hình kiếm, tù, dài 60cm đến 1m và rộng 8 - 10cm, đầu nhọn dài, gốc tù thành bẹ, mép lá nhăn.Cán hoa to vượt quá lá, mang 6 - 8 hoa thành tán rộng Hoa có ống màu xanh nhạt, dài 10cm, có các phiến rộng, thuôn, màu trắng, thường tô màu hồng.

1.3 Loài crinum latifolium L.

1.3.1 Mô tả thực vật

Hình 1.1: Cây Trinh Nữ Hoàng Cung [20]

TNHC còn được gọi là Hoàng Cung Trinh Nữ, Tỏi lơi lá rộng, Náng lá rộng Được nhiều nhà thực vật học Việt nam mô tả rất chi tiết.

Thân hành, hình cầu, phía ngoài có áo mỏng, phía trên có thân giả ngắn 7-10 cm, do

các bẹ lá ôm sát nhau làm thành.

Hình 1.2: Thân cây Trinh Nữ Hoàng Cung [29]

Phiến lá dạng bản, kích thước 60-90 màu xanh nhạt, nạc, mặt trên hơi lõm xuống

thành hình máng, mép lượn sóng, gân giữa lồi lên ở mặt dưới, gân bên song song, chóp nhọn, gốc dạng bẹ.

Hình 1.3: Phiến lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung [31]

Cụm hoa dạng tán, có 10-20 hoa; cuống cụm dài 60-90 cm, chiều ngang 1,5-2,0 cm,

màu xanh, gốc tím nhạt

Hình 1.4: Cụm hoa cây Trinh Nữ Hoàng Cung [30]

Hoa đều, lưỡng tính Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, mỏng, kích thước 7,5-10,0 cm,

lưỡng tính, màu tím hồng, đứng thẳng; cuống hoa ngắn Bao hoa dài 15-20 cm, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống dài 9-10 cm, thẳng đứng hoặc cong lên, phần trên 6 thùy, hình mũi giáo, giữa lưng có 1 dải màu tím hồng, đậm hơn, nhạt dần ra phía mép, chóp nhọn ngắn, có mũi màu hồng Nhị 6, rời nhau; chỉ nhị dài 6-7 cm, dạng sợi, màu trắng, thẳng đứng hoặc choãi ra, đính ở họng ống bao hoa; bao phấn màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, 2 ô, hình dải, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe dọc Bầu hạ, hình thoi, 3 ô, mỗi ô 5-6 noãn; vòi nhụy dài 15-18 cm, dạng sợi, dài, mảnh, phía trên màu tím thẫm nhạt dần xuống phía dưới; đầu nhụy nhỏ, dạng cầu

Hình 1.5: Hoa cây Trinh Nữ Hoàng Cung [30]

Quả nang, hình cầu, đường kính 4-5 cm

Hình 1.6: Quả Trinh Nữ Hoàng Cung [30]

1.3.2 Phân bố - Sinh thái

Cây Trinh nữ hoàng cung được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái lan, Trung Quốc, Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào Ở Việt Nam, cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Nam - Đà Nẵng trở vào Mùa hoa quả: tháng 8-9 Là loại cây ưa ẩm, sáng hoặc một phần bóng mát Sinh trưởng và phát triển ở khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới Mỗi năm cây cho 6-8 lá mới và đẻ thêm 3-5 hành con Cây ra hoa hàng năm vào khoảng tháng 6-8 Bộ phận dùng chủ yếu là lá và thân hành Cây TNHC đã được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp cấy mô [26]

Hình 1.7.(1) Cây với thân hành và lá (2) Cụm hoa (3) Một phần bao hoa và bộ nhị; (4) Bộ nhụy [27]

Nhuộm vi phẩu tiến hành tuần tự như sau: (1) Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15-30 phút, rửa bằng nước cất nhiều lần (2) Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1%-3% trong 2 phút để tẩy Javel còn sót lại Rửa bằng nước cất (3) Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat (nếu thấy lát cắt chưa thật trắng và trong) khoảng 10-15 phút nữa Rửa lại bằng nước cất (4) Ngâm vào dung dịch lục iod từ 5-10 giây Rửa lại bằng nước cất (5) Ngâm tiếp vào dung dịch son phèn khoảng 15-30 phút Rửa lại bằng nước cất đến khi dung dịch rửa hết màu Vi phẩu chuẩn bị xong soi bằng nước.

Kết quả: phần gân lá có tiết diện lõm ở mặt trên và lồi ở mặt dưới Có 2 lớp tế bào xếp dãy ở 2 mặt gân lá Kế đến là lớp mô mềm đạo.Bó libe-gỗ ở trung tâm gân xếp hình vòng cung là libe-gỗ.

Hình 1.8 Cấu tạo vi phẫu và sơ đồ cấu tạo lá Trinh nữ hoàng cung

Hình 1.9 Mép lá với 2 lớp tế bào

Hình 1.10 Sơ đồ cấu tạo chi tiết lá Trinh nữ hoàng cung Kết quả bóc tách biểu bì lá:

Hình 1.11: Mảnh biểu bì mang lỗ khí có cấu tạo đặc trưng của lớp 1 lá mầm 1.3.3.2 Vi phẩu rễ

Tiến hành tương tự như cách chuẩn bị vi phẫu lá Kết quả: vi phẫu rễ có tiết diện tròn Bên ngoài lớp biểu bì là lớp cutin dày Mô mềm đặc gồm 1 lớp tế bào xếp kế đó, tiếp theo là lớp mô mềm khuyết xếp xen kẽ Bên trong nội bì và trụ bì là các bó libe gỗ xếp gần sát nhau tạo một vòng kín Libe gồm từng đám tế bào nhỏ màu hồng, xếp lộn xộn, tr ên bó gỗ gồm 4 đến 5 mạch gỗ hướng tâm

Hình 1.12 Cấu tạo vi phẫu và sơ đồ cấu tạo rễ 1.3.3.3 Khảo sát bột dược liệu

Phương pháp thử: Nhỏ 1-2 giọt nước nhỏ lên lam Lấy một lượng bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho vào giọt nước đó, khuấy kỹ Đậy lamelle lên trên lam, dùng ngón tay di nhẹ trên lam cho bột phân tán đều Dùng giấy lọc thấm nhanh nước thừa ở mép lamelle

Kết quả: bột lá dược liệu trinh nữ hoàng cung màu nâu, mùi hắc vị chát đắng, soi kính hiển vi thấy có nhiều mảnh mô mềm, có thể chứa tinh thể calci oxalat hình kim, nhiều mạch xoắn, mảnh biểu bì mang lỗ khí, mảnh mô mềm.

Hình 1.14 Mảnh biểu bì mang lỗ khí Hình 1.15 Mảnh mô mềm

Hình 1.16 Mạch xoắn Hình 1.17 Tinh thể calci oxalat hình kim

Hình 1.18: Tinh thể canxi oxalat hình khối

CHƯƠNG II THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Thành phần hóa học của loài TNHC được khảo sát từ năm 1982 do nhóm tác giả nước ngoài như Ghosal S.- một nhà khoa học người Ấn Độ, thực hiện TNHC cũng được nghiên cứu tại nhiều quốc gia phương Tây và được công bố trên nhiều tạp chí khoa học uy tín Đơn cử như Kobayash S năm 1984 Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bắt đầu nghiên cứu về cây Trinh nữ hoàng cung năm 1990 [1]

Hình 2.2 Các alkaloid khung Crinin

Thành phần và hàm lượng Alkaloid thay đổi đáng kể theo thời kỳ sinh trưởng, thời kỳ trước và sau khi ra hoa

Đã có 12 Alkaloid được phân lập từ cây TNHC trồng ở Việt Nam, trong đó có 12 Alkaloid từ dịch chiết lá và thân hành Alkaloid thuộc khung crinin chiếm số lượng nhiều nhất, gồm 7 Alkaloid: 6-hydroxybuphanidrin; ambelin; crinin; powellin; crinamidin; 6-hydroxycrinamidin; 6-hydroxyundulatin; khung lycorin có pratorinin; lycorin; hippadin; lycorin-1-OAc; khung augustamin có augustamin.

Có 4 Alkaloid từ dịch chiết lá, trong đó 6-hydroxycrinamidin là hợp chất Alkaloid đầu tiên được công bố (năm 1998) [2]

2.2 Flavonoid

Flavonoid của Trinh Nữ Hoàng Cung: so với nhóm Alkaloid thì Flavonoid có số

lượng các hợp chất được công bố ít hơn, gồm 7 Flavonoid sau: [12]

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của các hợp chất Flavonoid trong cây TNHC.

(1) 4',7-dihydroxyflavan, (2) 2',4',7trihydroxydihydrochalcon, (3)

methoxyflavan, (4) 7-hydroxy-8-methoxyflavanon, (5) 4',7-dihydroxy-3'-vinyloxyflavan, (6) 5,6,3'-trihydroxy-7,8,4'-trimethoxyflavon, (7) Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl

2.3 Các nhóm hợp chất khác

Nhóm cacbohydrat: glucan A và B; lectin (methyl -α-mannopyranosid) đều được

phân lập từ dịch chiết thân hành [12]

Coumarin: từ dịch chiết methanol, với hợp chất coumarin

4-senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin Hiện tại thành phần này chưa được phát hiện trong các loài crinum khác [12]

Nhóm acid hữu cơ: para-hydroxycinnamic methyl ester và 2,5-dihydroxycinnamic

ethyl ester từ dịch chiết lá tươi [12]

CHƯƠNG III TÁC DỤNG DƯỢC LÝ3.1 Chống oxy hóa

Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết trong nước TNHC được đánh giá bằng cách sử

trực tiếp của các chất chống oxy hóa phá hủy chuỗi dựa trên cơ chế chuyển nguyên tử hydro TNHC cho thấy khả năng dọn dẹp gốc tự do mạnh trong ống nghiệm, với giá trị ORAC là 1610 ± 150 µmol TE /g Giá trị ORAC này cao hơn đáng kể so với các loại thảo mộc khác Trong một nghiên cứu của Liao H: phân tích chiết xuất từ nước của 45 loại thảo mộc được sử dụng trong y học Trung Quốc cho thấy một phạm vi hoạt động rất rộng trong thử nghiệm ORAC (40-1990 µmol TE/ g), trong đó chỉ có hai

chất chiết xuất từ thảo dược (Spatholobus suberectus: 1990 µmol TE /g; Sanguisorbaofficinalis: 1940 mmol TE/ g) cho thấy giá trị ORAC dịch chiết TNHC được phân tích

trong nghiên cứu này cao hơn [9]

3.2 Hoạt tính chống viêm

Dịch chiết nước TNHC có tác dụng chống viêm mạnh trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC: Peripheral blood mononuclear cells) kích thích mitogen bằng cách chống lại sự hoạt hóa enzym IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) và tiết neopterin, điều này dẫn đến tác động điều hòa của TNHC trên các tế bào T hoạt hóa và sản xuất IFN-γ Dịch chiết TNHC cũng ức chế sự thoái hóa tryptophan qua trung gian IDO và giảm sản xuất neopterin Sự ức chế sự hình thành IFN-γ cho thấy dịch chiết nước TNHC có khả năng chống oxy hóa (như vitamin C và E, resveratrol, rượu hoặc chiết xuất từ cacao, trà xanh hoặc đậu đen), thể hiện tác dụng ức chế mạnh mẽ lên PBMC dạng kích thích [19], [17]

3.3 Khả năng chống tăng sinh tế bào

Dịch chiết nước của lá TNHC hỗ trợ điều trị ung thư tuyến tiền liệt của người PC3 (Prostate Cancer Cell Line),LNCaP (Lymph Node Carcinoma of the Prostate), và tăng sản tuyến tiền liệt BPH (Benign prostatic hyperplasia) Dịch chiết nước TNHC, ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào và phụ thuộc liều sau 72 giờ nuôi cấy Song song đó, đánh giá mức độ ức chế tăng trưởng của các tế bào sau khi điều trị các tế bào với cisplatin được sử dụng như một chuẩn dương tính Dòng tế bào nhạy cảm nhất bị ảnh hưởng

(Inhibitory Concentration) 2120 ± 41 µg / ml (~ 10,6 µg/ ml alkaloid toàn phần; 0,6 µg/ ml crinamidin) sau khi xử lý bằng dịch chiết TNHC và với IC50 2,3 ± 0,3 nM sau khi điều trị bằng cisplatin.

Sự tăng trưởng của các tế bào PC3 và LNCaP bị ức chế bởi dịch chiết TNHC ở liều IC50 4540 ± 791 µg / ml (~ 22,7 µg/ ml alkaloid toàn phần; 1,3 µg/ ml crinamidin) và 2344 ± 148 µg/ ml (~ 11,7 µg/ ml alkaloid toàn phần; 0,7 µg/ ml crinamidin) Cisplatin có tác dụng chống tăng sinh mạnh trên các tế bào PC3 và LNCaP ở liều IC50

lần lượt là 6,3 ± 0,8 nM và 5,5 ± 0,9 nM.

Dịch chiết lá TNHC có tác dụng đối với PBMC và ức chế sự gia tăng của các tế bào tuyến tiền liệt Các hợp chất chống oxy hóa (được biểu diễn bằng giá trị ORAC cao) và/ hoặc các alkaloid cụ thể có thể đóng vai trò quan trọng trong tác dụng này Phân tích hóa thực vật của loài Crinum cho thấy hơn 170 hợp chất khác nhau, hầu hết trong số đó là alkaloid của loại Amaryllidaceae, thể hiện một loạt các hoạt động sinh học như giảm đau, chống khối u và tác dụng kháng virus [5] Sự có mặt của các alkaloid, đặc biệt là loại crinan như crinamin, crinamidin, crinafolin và crinafolidin, cũng được phát hiện trong dịch chiết nước từ lá TNHC [15] Dịch chiết được sử dụng trong nghiên cứu này đã được chuẩn hóa để chứa 0,3 µg crinamidin/ mg cao chiết Kết quả thu được cho thấy sự tham gia của các loại alkaloid như crinan, vì chúng đã được chứng minh có hoạt tính chống ung thư bằng cách gây độc tế bào và đồng thời biểu hiện độc tính thấp cho các tế bào khỏe mạnh như các tế bào máu nhân đơn [8] N1-type cytokin IFN-γ kích hoạt IDO trong các đại thực bào cũng như trong các tế bào khác như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư đại trực tràng, tuyến tụy và cổ tử cung, một số đã được chứng minh là thể hiện rõ ràng IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase)[18] Mặc dù IFN-γ sản xuất và kích hoạt IDO nhằm mục đích ức chế sự phát triển của các tế bào ác tính và chủ yếu góp phần vào việc loại bỏ khối u IDO cũng làm tăng sự tăng sinh tế bào T và do đó tăng đáp ứng miễn dịch Vì vậy, bên cạnh vai trò trong kháng khuẩn, IDO đóng vai trò quan trọng đáp ứng miễn dịch chống ung thư [16] Tuy nhiên, khía cạnh ức chế miễn dịch này của IDO có thể cho phép các tế bào khối u vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch Qua đó, hoạt động IDO có thể góp phần vào sự phát triển của suy giảm miễn dịch - một lý do chính cho sự tiến triển của bệnh và tử

Một tác dụng có lợi của IDO ức chế sự phát triển khối u bởi các chất ức chế cụ thể được thể hiện trong các mô hình động vật khác nhau Friberg et al đã chứng minh tác dụng tăng cường của chất ức chế phân tử nhỏ 1-MT (1-Methyl tryptophan) đối với hoạt tính tế bào T in vitro Chất 1-MT làm chậm sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi ở chuột [6].

Uyttenhove et al. chứng minh biểu hiện ectopic của IDO bởi các tế bào khối u của chuột miễn dịch thúc đẩy sự phát triển khối u ở chuột chưa miễn dịch, một phần có thể được đảo ngược bằng cách xử lý hệ thống với 1-MT Sử dụng chuyển gen ung thư vú ở chuột, Muller et al cũng chỉ ra rằng chất ức chế phân tử 1-MT làm chậm phát triển khối u Trong khí đó, khi điều trị phối hợp với 1-MT và paclitaxel hoặc hóa trị liệu khác lại gây ra sự trở lại nhanh chóng các khối u ở những con chuột đã kiệt sức Các chất ức chế IDO khác như MTH-trp (Methylthiohydantoin-tryptophan) hoặc brassinin phytoalexin cũng có tác dụng tương tự với hoạt tính chống ung thư [4] Tóm lại, tác dụng ức chế mạnh mẽ của dịch chiết TNHC trên hoạt động IDO trong PBMC, là minh chứng cho hoạt động chống ung thư của TNHC Ngoài ra, tác dụng ức chế trên các tế bào u tuyến tiền liệt đã được chứng minh Một cách tổng quát, cả hai tác dụng, ức chế sự tăng trưởng tế bào khối u và phục hồi chức năng miễn dịch, có thể đóng góp vào các tác dụng có lợi của TNHC trong điều trị u tuyến tiền liệt.

3.4 Ức chế phân bào

Các kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy cao MeOH của thân, rễ và cao chiết alkaloid toàn phần của TNHC đều có tác dụng ức chế phân bào Trong mô hình gây u báng sacom và ung thư đùi ở chuột nhắt, các loại cao này đã hạn chế sự phát triển của khối u và di căn tế bào Một số alkaloid trong cây có hoạt tính sinh học như lycorin ức chế protein và DNA của tế bào chuột, đồng thời ức chế u báng sacom cấy ở chuột Trong thử nghiệm, Lycorin làm giảm khả năng sống của tế bào u, làm ngừng sự phát triển của virus bại liệt, đó là ức chế các tiền chất cần thiết cho sự sinh trưởng của virus gây bệnh bại liệt.[12]

3.5 Chống ung thư

G.S Ghosal nhà khoa học Ấn Độ cũng đã phân tích thành phần hóa học của cây TNHC giai đoạn 1984 – 1989 thấy có một số dẫn chất alkaloid có tác dụng chống ung thư.

ông công bố tìm được một số dẫn chất alkaloid có tác dụng chống ung thư Đến năm 1989 ông còn phân lập được từ dịch chiết ở cán hoa TNHC thêm 2 alkaloid mới có nhân pyrrolophennanthridin là epilycorin và epipancrassidin Một số nhà khoa học Nhật Bản cũng tìm thấy như chất Kobayashi Shigenru, Tomoda và Masashi cùng một số alkaloid khác ở cây TNHC Y học hiện đại đã phát hiện trong TNHC Việt Nam có chứa những hoạt chất sinh học với khả năng ngăn chặn sự phát triển của tế bào u và kích thích tế bào lympho T hoạt động và phát triển Đồng thời phát hiện TNHC có hoạt chất hỗ trợ trị liệu chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung và hoạt chất ức chế sự tăng trưởng của tễ bào ung thư như crinafolidin, crinafolin, paratorimin [7]

CHƯƠNG IV SƠ LƯỢC VỀ BỆNH U XƠ TỬ CUNG

U xơ tử cung (UXTC) là khối u lành tính ở tử cung, thường gặp ở phụ nữ trong độ tuổi hoạt động sinh dục UXTC còn được gọi là u xơ và cơ tử cung hay u cơ tử cung vì cấu tạo từ tổ chức liên kết và cơ trơn của tử cung Đã có nhiều giả thiết về cơ chế sinh bệnh của UXTC, giả thiết về cường estrogen được nhiều tác giả ủng hộ [32]

4.1 Tỷ lệ và yếu tố thuận lợi

Khó xác định được tỷ lệ UXTC vì nhiều khi khối u đường kính nhỏ không được phát hiện trên lâm sàng Tuổi xuất hiện thường từ 30-50 tuổi, độ tuổi trong thời kỳ hoạt động sinh dục Chưa thấy ahr hưởng của số lần có thai và đẻ, tuy nhiên nhiều tác giả nêu đẻ ít và vô sinh cũng là nguyên nhân thuận lợi Các thuốc estrogen – progestin như thuốc tránh thai với estrogen liều thấp hầu như không ảnh hưởng đến tỷ lệ xuất hiện của UXTC Yếu tố di truyền trong gia đình không rõ [32]

4.2 Nguyên nhân

Giả thuyết về nguyên nhân phát sinh UXTC được nêu: [32]

Thuyết về virus: virus u nhú ở người (Human papilloma virus HPV) có thể gây ra khối

u tổ chức liên kết ở chuột thực nghiệm.

Thuyết về nội tiết: UXTC hay xuất hiện vào thời kỳ hoạt động sinh dục, điều này gợi ý UXTC có mối liên quan đến nội tiết.

- Cường estrogen tương đối: estrogen kích thích sự tổng hợp protein ở tử cung Trong khi có thai, estrogen làm tăng actomyosin gây quá sản tế bào Bằng thực nghiệm, một số tác giả đã nhận thấy estrogen liều cao gây ra khối u tử cung Tuy nhiên, nghiên cứu nội tiết ở những phụ nữ UXTC cho thấy nồng độ estrogen không cao.

- Cơ chế trong đó estradiol kích thích sự phát triển của UXTC chưa được sáng tỏ, có thể do rối loạn sự tổng hợp tại chỗ của estrogen hoặc kháng estrogen và cathecol estrogen, các chất này là sản phẩm của sự chuyển hóa estradiol 17β, ức chế và kìm hãm khối u.

- Vai trò của progesteron được coi như kháng estrogen, bằng cách làm tăng tổng hợp các cathecol estrogen (REDDY 1981) sự giảm nồng độ progesteron làm giảm tổng hợp cathecol estrogen.

- Vai trò của nội tiết tăng trưởng: ở những phụ nữ có UXTC người ta thấy nồng độ

hormon tăng trưởn đồng vận với estradiol có thể làm tăng thể tích tử cung (chuột cái đã được cắt bỏ tuyến yên và buồng trứng) (Graltalora, 1959).

4.3 Triệu chứng

Hầu hết khối u mới hình thành đều không mang lại những biến đổi bất thường gì trong cơ thể, chính bởi vậy, khi có các triệu chứng u xơ tử cung, chị em đi khám thì thường khối u đã phát triển quá lớn Thông thường, khi có các dấu hiệu sau đây bạn cần nghĩ ngay đến khả năng mình bị u xơ tử cung:

- Bụng to ra, cảm giác trằn nặng bụng dưới hoặc đau vùng hạ vị.

- Có hiện tượng rong kinh, kinh ra nhiều, rong huyết dài ngày, cơ thể mất máu gây mệt mỏi, xanh xao.

- Đi tiểu nhiều lần, khó tiểu, bí tiểu (khối u to đè lên bàng quang), bị táo bón, đi đại tiện đau (khối u đè lên trực tràng), khối u đè lên ruột gây rối loạn tiêu hóa.

4.4 Hướng điều trị

Về cơ bản, các khối u xơ là hoàn toàn lành tính, tuy nhiên cách thức điều trị tùy thuộc vào kích cỡ của khối u, nếu khối u lớn thường phẫu thuật, khối u kích thước nhỏ thường được chỉ định uống thuốc để làm nhỏ dần và đào thải ra khỏi cơ thể, bên cạnh đó bệnh nhân cũng có thể sử dụng các bài thuốc Đông y, thuốc Nam để làm teo nhỏ dần tiến tới loại bỏ được những khối u đã hình thành Ngoài ra, những bệnh nhân đã một lần xuất hiện khối u sẽ thường có nguy cơ tái phát cao, việc sử dụng các bài thuốc Đông y, thuốc Nam để phòng ngừa là điều vô cùng cần thiết.

Theo y học hiện đại, trong cây TNHC có chứa những hoạt chất sinh học với khả năng ngăn chặn sự phát triển của tế bào u và kích thích tế bào lympho T hoạt động và phát triển.

Trong tất cả các loài thảo dược chỉ thấy có cây TNHC mới có hoạt chất tác dụng hỗ trợ trị liệu chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung và hoạt chất ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư (antitumor) như crinafolidin, crinafolin, paratorimin Trong khi có tới 12 loại giống cây TNHC đều thuộc họ náng Crinum, nhưng tác dụng cũng khác nhau, ví dụ: Trinh nữ hoàng cung Campuchia ngoài tác dụng giống TNHC Việt Nam nhưng lại có thêm tác dụng tránh thai Các kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy cao methanol của thân, rễ và cao chiết alkaloid toàn phần của TNHC đều có tác

hợp chất chứa cao TNHC đã hạn chế sự phát triển của khối u và di căn tế bào Một số alkaloid trong cây có hoạt tính sinh học như Lycorin ức chế protein và DNA của tế bào chuột, đồng thời ức chế u báng cấy ở chuột

Trong thử nghiệm, Lycorin làm giảm khả năng sống của tế bào u, làm ngừng sự phát triển của virus bại liệt, đó là ức chế các tiền chất cần thiết cho sự sinh trưởng của virus gây bệnh bại liệt; phòng và hỗ trợ điều trị trị u xơ tử cung, u xơ tiền liệt tuyến, u vú; ngăn chặn phát triển tế bào khối u ung thư; thuốc có độ an toàn cao, không có tác dụng phụ, không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận và các chức năng sống khác của cơ thể.

CHƯƠNG V KINH NGHIỆM SỬ DỤNG

Từ xa xưa, cây Trinh nữ hoàng cung đã được biết đến như một cây thuốc quý của phụ nữ và dùng nó để chữa các chứng như: rối loạn chu kì kinh nguyệt, u xơ tử cung, u nang buồng trứng Ngoài ra còn được sử dụng trong điều trị các bệnh như: u xơ tuyến tiền liệt, viêm họng hạt, viêm loét dạ dày Sau đây là các cách sử dụng Trinh nữ hoàng cung trong dân gian.

5.1 Điều trị u tuyến tiền liệt, u nang buồng trứng, u xơ tử cung, u vú, viêmloét dạ dày

Dùng 30-40 g lá khô rửa sạch, thái nhỏ Sắc với 1 lít nước đến khi nào còn 1/2 lít nước chia đều uống 2 lần/ngày sau khi ăn Hoặc: lá Trinh nữ hoàng cung (20g), Nga truật (20g), Xuyên điền thất (10g), Lá đu đủ khô (50g).

Thuốc được uống thành 3 đợt, mỗi đợt khoảng 30 ngày, nghỉ 7 ngày rồi uống đợt tiếp theo

Điều trị các khối u như u da, u nội tạng, hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung, ung thư đại tràng, u vú.

5.2 Chữa u xơ tiền liệt tuyến

Dùng lá tươi: Dùng 3 lá tươi cây TNHC, dài khoảng 5 tấc, rửa sạch, thái nhỏ Sắc với 2 chén nước đến khi nào còn nửa chén, uống ngày 3 lần sau khi ăn.

Dùng lá khô: Lá khô sau khi phơi trần qua nước sôi, để ráo nước Mỗi ngày dùng 200g sắc với 2 bát nước cho đến khi còn nửa bát, chia làm 3 lần uống trong ngày, sau khi ăn

Ngoài ra, để phòng và chữa bệnh yếu sinh lý do tác động của thuốc, bệnh nhân u tuyến tiền liệt thêm cây đinh lăng vào vị thuốc.

Cách dùng: Lá tươi (50g) hoặc lá khô (200g) lá đinh lăng sắc chung với lá cây TNHC Lưu ý, nên đổ nước ngập dược liệu Sắc cùng với 2 bát nước đến khi nào còn nửa bát, chia 3 lần uống trong ngày, sau khi ăn [28]

Theo TS.DS Nguyễn Thị Ngọc Trâm, trong dân gian, người ta dùng nước sắc của lá Trinh nữ hoàng cung để trị u xơ tử cung, u nang buồng trứng và u xơ tiền liệt tuyến Cách dùng: mỗi ngày uống nước sắc của 3 lá Trinh nữ hoàng cung hái tươi, xắt nhỏ ngắn 1 - 2 cm, sao khô màu hơi vàng, uống luôn trong 7 ngày rồi nghỉ 7 ngày, uống 7 ngày Tổng cộng 3 đợt uống 7 x 3 x 3 = 63 lá, xen kẽ giữa 2 đợt nghỉ uống một đợt 7 ngày [22]

5.3 Điều trị viêm họng hạt

Dùng 30-40 g lá khô rửa sạch, thái nhỏ Sắc với 1 lít nước đến khi nào còn 1/2 lít nước chia đều uống 2 lần/ngày sau khi ăn Hoặc,

Lá TNHC 1/3 lá tươi, rễ cây dằng xay 3g Hai loại này rửa sạch, thêm vào hạt muối nhai ngậm hàng ngày [23]

5.4 Tăng sức đề kháng cho bệnh nhân ung thư

Các nghiên cứu của bác sỹ Đông Y đã chỉ ra rằng sử dụng TNHC chung với cây xạ đen sẽ mang lại hiệu quả điều trị ung thư tuyệt vời Tinh chất trong TNHC và Xạ đen giúp ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư, làm giảm đau, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể Thành phần: TNHC (40 g), Xạ đen (40 g).

Cách dùng: đun sắc với 1,5 lít nước, uống trong ngày, sử dụng thường xuyên từ 2 tới 6 tháng [21]

5.5 Các bài thuốc của tiến sĩ Võ Văn Chi

Suy nhược thần kinh, mất ngủ: TNHC 15 g dùng riêng hoặc phối hợp với cúc bạc

đầu 15 g, chua me đất 30 g Sắc uống.

Viêm phế quản mạn tính: TNHC 30g, rễ lá cây cẩm 16 g Tất cả đem sắc nước, chia

thành 2 lần uống trong ngày.

Đau ngang thắt lưng, nhức mỏi gân xương: 20-30g rễ trinh nữ rang lên, tẩm rượu

rồi sao vàng, sắc uống Cũng có thể phối hợp thêm với rễ cúc tần và bưởi bung, mỗi vị

Chữa AIDS, sốt nhẹ, toàn thân không khoan khoái, da nổi mẩn đỏ, chảy nước:

TNHC, trắc bách tiệp, hoàng bá, rau sam, thảo quyết minh, thạch lựu bì, các vị đều bằng nhau Đem nấu tất cả, chắt lấy nước đặc tắm hoặc rửa Bên cạnh đó dùng 2 g hùng hoàng tán bột trộn với lòng trắng trứng gà để bôi vào chỗ đau [25]

5.6 Một số kinh nghiệm khác [23]

Chỉ dùng lá TNHC có hai dạng: lá khô và lá tươi với liều lượng như sau:

Lá tươi: 3 lá tươi dài khoảng 5 tấc Sau khi rửa sạch, thái nhỏ và sắc với 2 chén nước Sắc đến khi nào còn nửa chén Chia làm 3 lần, uống hàng ngày sau khi ăn.

Lá khô: Dùng 200g lá khô sắc với 2 chén nước Sắc đến khi nào còn nửa chén chia uống 3 lần trong ngày, sau khi ăn.

Thuốc được uống thành từng đợt, mỗi đợt khoảng 20 – 25 ngày, nghỉ 10 ngày rồi uống đợt tiếp theo Hoặc có thể uống một đợt duy nhất liên tục 64 ngày đối với nam và 49 ngày đối với nữ.

Tác dụng: Chữa các bệnh u tuyến tiền liệt, u nang buồng trứng, u xơ tử cung, viêm họng, mụn nhọt, u vú, viêm loét dạ dày.

CHƯƠNG VI CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG TRINH NỮ HOÀNGCUNG

6.1 Các quy trình chiết cao cồn, alkaloid từ TNHC

6.1.1 Chiết cao cồn, phân đoạn alkaloid bằng phương pháp ngấm kiệt

- Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng dung môi khoảng 12 giờ Cho dung môi

ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ Rút dịch chiết đến khi âm tính với TT Dragendorff và TT FeCl3 1% Tỷ lệ dung môi/dược liệu là (10 : 1) Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc [13]

- Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng NH3 25% đến pH 9-10 Lắc với CHCl3 đến khi âm tính với TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid [13]

6.1.2 Chiết alcaloid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp

- Chiết alcaloid bằng phương pháp SFE: thiết bị là hệ thống chiết bằng lưu chất CO2

do Đài loan sản xuất với ba bình chiết lắp song song, thể tích 20 lít/bình Điều kiện SFE: áp suất 200 bar, nhiệt độ 50 oC, thời gian chiết 2 giờ, 15% cồn 96% Dịch SFE

được thu hồi dung môi (cao L-SFE) Cao L-SFE được hòa tan với HCl 1% Dịch acidđược chiết alcaloid AL-SFE [10]

- Chiết alcaloid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau khi chiết SFE được tiếp tục

chiết ngấm kiệt với cồn 70% Dịch chiết cồn được chiết alkaloid AL-NK [10] 6.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC

- Các PĐ alkaloid được chiết từ các bộ phận của cây TNHC, sau đó tách PĐ bằng

VLC và phân lập các hợp chất bằng CC [10]

- Sử dụng chất hấp phụ là silica gel tẩm đệm pH 9 đối với mẫu phân lập alkaloid.

- Kết quả: phân lập được các hợp chất từ các cao TNHC Trong đó: một alcaloid mới

được công bố lần đầu tiên, cấu trúc được xác định là 6 - ethoxyundulatin; 9 hợp chất

đã được công bố trước đây từ TNHC: hippadin, augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, 6-hydroxybuphanidrin, 6-hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin và astragalin.

6.3 Thiết lập chất đối chiếu

Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC

Các nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin;

- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết bằng HPLC:

Điều kiện phân tích: cột: C8 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 m); nhiệt độ cột: 40 oC; detector PDA; tốc độ dòng 1 ml/phút.

- Mẫu thử: nguyên liệu CĐC được pha 100 μg/ml trong pha động.g/ml trong pha động.

- Thành phần pha động của mỗi chất được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 6.1 Thành phần pha động của các quy trình xác định độ tinh khiết của cácnguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC.

Tên chất khảo sátThành phần và tỷ lệ pha động

Crinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 :

Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các CĐC

trong khoảng nồng độ khảo sát (R2 > 0,998).

- Độ chính xác: Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.2 RSD % độ tinh khiết sắc

ký của các pic chính < 2% Như vậy, các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các

CĐC đạt yêu cầu về độ chính xác.

Bảng 6.2 Kết quả độ tinh khiết sắc ký (%) của các CĐC bằng HPLC.

Tên chất đối chiếu Độ tinh khiết sắc ký (%) Crinamidin 98,71% (RSD% = 0,02)