Luận văn thạc sĩ phát hiện mycobacterium tuberculosis kháng isoniazid rifampin và ethambutol bằng kỹ thuật real time PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS : Nguyễn Thái Sơn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nhiễm lao giới Việt Nam 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Việt Nam 1.2 Bệnh lao 1.2.1 Bệnh lao kháng thuốc chế kháng thuốc vi khuẩn lao .7 1.3 Vi khuẩn lao 11 1.3.1 Phân loại vi khuẩn lao 11 1.3.2 Hình thể vi khuẩn lao 12 1.3.3 Cấu trúc vi khuẩn lao .13 1.3.4 Đặc điểm sinh học nuôi cấy vi khuẩn lao 16 1.3.5 Cơ chế tác động isoniazid chế kháng isoniazid vi khuẩn lao 18 1.3.6 Cơ chế tác động Rifampin chế kháng Rifampin vi khuẩn lao 20 1.3.7 Cơ chế tác động ethambutol chế kháng ethambutol vi khuẩn lao 21 1.4 Các phương pháp xác định lao kháng thuốc 23 1.4.1 Phương pháp xác định kiểu hình 23 1.4.2 Các phương pháp nuôi cấy cải tiến .26 1.4.3 Một số phương pháp kiểu hình .28 1.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen .31 Chƣơng 2VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Vật liệu nghiên cứu 41 2.1.1 Vật liệu sinh học 41 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 42 2.1.3 Hóa chất sử dụng 43 2.2 Nội dung nghiên cứu 43 iii 2.3 Phương pháp nghiên cứu 44 2.3.1 Phương pháp thiết kế kiểm tra oligonucleotide (mồi mẫu dò) sở liệu IDT phần mềm sinh học chuyên dụng ClustalX Annhyb [3,6,8,10] 44 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu, xử lý bệnh phẩm .46 2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện phản ứng real-time PCR 48 2.3.4 Thiết lập quy trình chẩn đốn thực mẫu bệnh phẩm 53 Chƣơng 3KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .54 3.1 Đánh giá thông số oligonucleotide thiết kế 54 3.1.1 Trình tự vị trí oligonucleotide 54 3.1.2 Đặc tính oligonucleotide 56 3.1.3 Khả bắt cặp hệ mồi, mẫu dò ly thuyết .59 3.2 Đánh giá khả bắt cặp hệ mồi mẫu dò .66 3.3 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 68 3.3.1 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 68 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 69 3.3.3 Kháo sát nhiệt độ lai phản ứng 70 3.3.4 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 71 3.4 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 72 3.4.1 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 73 3.4.2 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 73 3.4.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 74 3.4.4 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 74 3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò (mẫu dò) .75 3.5.1 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 75 3.5.3 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 76 3.5.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 77 3.6 Khảo sát nồng độ Mg++ 77 3.6.1 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng .77 3.6.2 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng .78 3.6.3 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng .78 iv 3.6.4 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng .79 3.7 Khảo sát độ lặp lại phản ứng 79 3.7.1 Khảo sát độ lặp lại lần thí nghiệm 80 3.7.2 Khảo sát độ lặp lại phản ứng lần thí nghiệm khác 83 3.8 Khảo sát độ nhạy phản ứng 87 3.8.1 Phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid .87 3.8.2 Phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin .88 3.8.3 Phản ứng phản ứng 4- xác định đột biến kháng ethambuton 89 3.9 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng 90 3.9.1 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid 91 3.9.2 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin 91 3.9.3 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng - xác định đột biến kháng ethambutol .92 3.10 Quy trình phát đột biến kháng isoniazid, Rifampin ethambutol MTB.93 3.10.1 Thành phần phản ứng chu trình nhiệt .93 3.10.2 Quy trình xác định đột biến kháng isoniazid, Rifampin ethambutol 94 3.11 Ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm 94 3.11.1 Mẫu bệnh phẩm 94 3.11.2 Ứng dụng quy trình 50 mẫu bệnh phẩm lao 95 3.11.3 Xác định độ đồng thuận phương pháp real time PCR với phương pháp kháng sinh đồ 97 CHƢƠNG 4KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .101 4.1 Kết luận 101 4.2 Kiến nghị 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFB : Acid Fast Bacilli AMK : amikacin BCG : Bacillus Calmette-Guérin CPM : Capreomycin CTCLQG : Chương trình chống lao quốc gia DNA : Deoxyribonucleic acid DR : Trình tự lặp lại trực tiếp (Directed Repeat) EMB : Ethambutol ETH : Ethionamide FQs : Fluoroquinolones INH : Isoniazid KM : Kanamycin MDR-TB : Lao kháng đa thuốc (multidrug-resistant TB) MIC : Minimum inhibitory concentration MIRU-VNTR : Mycobacterial Interspered Repetitive Units of Variable Number of Tandem Repead MTB : Mycobacterium tuberculosis MTBC : M tuberculosis complex PCR : Polymerase Chain Reaction PZA : Pyrazinamide RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RIF : rifampin RNA : ribonucleic acid SM : Streptomycin ST : spoligotyping TB : Tuberculosis WHO : Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) XDR-TB : Lao đa kháng thuốc mở rộng (extensively drug resistant TB) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí gen liên quan đến kháng thuốc MTB (Multidrug-resistance) 11 [11,12,26,28] 11 Bảng 1.2 Nồng độ đánh giá loại thuốc kháng sinh 25 phương pháp tỷ lệ[5] .25 Bảng 2.1 : Trình tự vị trí mồi mẫu dò sử dụng đề tài 42 Bảng 3.1 : Bảng thông số kỹ thuật mồi mẫu dò 57 Bảng 3.2: Kiểm tra lượng liên kết hetero-dimer phản ứng – xác định đột biến gen katG vị tí 315 .58 Bảng 3.3: Kiểm tra lượng liên kết hetero-dimer phản ứng 2- xác định đột biến gen rpoB vị trí 516 58 Bảng 3.4: Kiểm tra lượng liên kết hetero-dimer phản ứng 3- xác định đột biến gen emb306 (A→G) 58 Bảng 3.5 : Kiểm tra lượng liên kết hetero –dimer phản ứng – xác định đột biến gen emb306 (G→A) 58 Bảng 3.6: Bảng kết thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 69 Bảng 3.7 : Bảng thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 70 Bảng 3.8: Kết thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 71 Bảng 3.9: Bảng thông số kết khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 72 Bảng 3.10: Bảng chi tiết kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 80 Bảng 3.11: Bảng chi tiết kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 81 Bảng 3.12: Bảng chi tiết kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 82 Bảng 3.13: Bảng chi tiết kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 82 Bảng 3.14: Hệ số biến thiên lần thí nghiệm phản ứng .83 Bảng 3.15: Hệ số biên thiên lần thí nghiệm phản ứng .84 Bảng 3.16: Hệ số biến thiên lần thí nghiệm phản ứng .85 Bảng 3.17: Hệ số biến thiên lần thí nghiệm phản ứng .86 Bảng 3.18: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng 87 Bảng 3.19: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng 88 Bảng 3.20: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng 90 Bảng 3.21 : Bảng thành phần phản ứng 93 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ phân bố lao toàn giới [47] Hình 1.2 : Sơ đồ thống kê số ca nhiễm lao bình thường lao kháng thuốc Việt Nam[47] Hình 1.3 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao [33] 10 Hình 1.4 Vi khuẩn lao nhuộm soi phương pháp Ziehl – Neelsen[50] 13 Hình 1.5 Mơ hình hóa cấu trúc màng vi khuẩn lao[51] 13 Hình 1.6 Các ống MGIT cho kết dương tính âm tính 28 Hình 1.7 Thử nghiệm khử nitrate với chủng nhạy kháng thuốc 30 (GC: growth control) .30 Hình 1.8 : Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự phương pháp dideoxynucleotid .33 Hình 1.9 Sản phẩm phản ứng MAS-PCR đoạn gen rpoB .36 Hình 1.10 Sản phẩm phản ứng MAS-PCR đoạn gen KatG .37 Hình 2.1 : Sơ đồ quy trình tách chiết DNA vi khuẩn lao từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng Hình 2.2 : giai đoạn phản ứng Real-time PCR .49 Hình 3.1 : Kết kiểm tra hệ mồi mẫu dò phản ứng1 phần mềm Annhyb 54 Hình 3.2 : Kết kiểm tra hệ mồi mẫu dò phản ứng phần mềm Annhyb 55 Hình 3.3: Kết kiểm tra hệ mồi mẫu dò phản ứng phần mềm Annhyb 55 Hình 3.4: Kết kiểm tra hệ mồi mẫu dò phản ứng phần mềm Annhyb56 Hình 3.5 : Khả đặc hiệu mồi katG-315F gen katG MTB công cụ ClustalX Blast (NCBI) 59 Hình 3.6: Khả đặc hiệu mồi katG-315R gen katG MTB công cụ ClustalX Blast (NCBI) 60 Hình 3.7: Khả đặc hiệu Mẫu dò katG 315 gen katG MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 61 Hình 3.8: Khả đặc hiệu mồi xuôi rpoB-516F gen rpoB MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 62 48 Hình 3.9 : Khả đặc hiệu mồi ngược rpoB-516R gen rpoB MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 62 Hình 3.10 :Khả đặc hiệu Mẫu dò rpoB-516 gen rpoB MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 63 Hình 3.11: Khả đặc hiệu mồi xuôi emb 306F1 gen emb MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 63 Hình 3.12: Khả đặc hiệu mồi xuôi emb 306R12 gen emb MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 64 Hình 3.14: Khả đặc hiệu mồi xuôi emb 306-F345 gen emb MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) .65 Hình 3.15: Khả đặc hiệu mồi ngược emb 306-R3 gen emb MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 65 Hình 3.16: Khả đặc hiệu Mẫu dò 306-345 gen emb MTB công cụ ClustalX Blast(NCBI) 66 Hình 3.14c Kết khảo sát khả khuếch đại hệ mồi mẫu dò nhằm phát đột biến 67 Hình 3.14a Kết khảo sát khả khuếch đại hệ mồi mẫu dò nhằm phát đột biến katG/315/AGCACC .67 Hình 3.14b Kết khảo sát khả khuếch đại hệ mồi mẫu dò nhằm phát đột biến rpoB/516/GACGTC .67 Hình 3.15: Hình ảnh khảo sát nhiệt độ bắt cặp phản ứng 68 Hình 3.16: Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng 70 Hình 3.17: Bảng thơng số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 70 Hình 3.18: Kết khảo sát nhiệt độ lai phản ứng .71 Hình 3.19: Kết khảo sát nồng độ mồi phản ứng phát đột biến kháng Isoniazid gen katG 73 Hình 3.20 : Kết khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng Rifampin gen rpoB 73 Hình 3.21: Kết khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng ethambutol gen emb(ATG-GTG) 74 Hình 3.22: Kết khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng Ethambutol gen emb(ATG-ATA) 74 Hình 3.23 : Kết khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 75 Hình 3.24 : Kết khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 76 Hình 3.25: Kết khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng .76 Hình 3.26 : Kết khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 77 Hình 3.27 : Kết khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 77 Hình 3.28: Kết khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 78 Hình 3.29: Kết khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 78 Hình 3.30: Kết khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 79 Hình 3.31: Kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 80 Hình 3.31: Kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 81 Hình 3.32: Kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 81 Hình 3.34: kết khảo sát độ lặp lại phản ứng 82 Hình 3.34 : Độ lặp lại lần thí nghiệm phản ứng 83 Hình 3.36: Độ lặp lại lần thí nghiệm phản ứng 85 Hình 3.37: Độ lặp lại lần thí nhiệm phản ứng 86 Hình 3.38: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng .87 Hình 3.39: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng 88 Hình 3.40: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng 89 Hình 3.42: Kết khảo sát độ đặc hiệu phản ứng 91 Hình 3.43: Kết khảo sát độ đặc hiệu phản ứng 92 Hình 3.44: Quy trình xác định đột biến kháng thuốc lao 94 3.11.2 Ứng dụng quy trình 50 mẫu bệnh phẩm lao Kết kháng thuốc Kháng isoniazid STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Mã số mẫu VA11112 VA21112 VA31112 VA41112 VA51112 VA61112 VA11212 VA21212 VA31212 VA41212 VA51212 VA10113 VA20113 VA30113 VA40113 VA50113 VA60113 VA70113 VA10213 VA20213 VA30213 VA40213 VA50213 VA60213 Kết định Kết tính Kháng MTB sinh đồ (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Kháng Rifampin Kết Kết real- time Kháng sinh PCR đồ (+) (+) (+) (+) (+) (+) Kết Kháng sinh đồ Kết realtime PCR Kháng ethambutol (ATG-ATA) Kết Kháng sinh đồ Kết realtime PCR (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Kết realtime PCR Kháng ethambutol (ATG-GTG) (+) (+) 25 VA70213 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 VA80213 VA90213 VA10313 VA20313 VA30313 VA40313 VA50313 VA10413 VA20413 VA30413 VA40413 VA50413 VA60413 VA59413 VA60413 VA70413 VA80413 VA10513 VA20513 VA30513 VA40513 VA50513 VA60513 VA70513 VA80513 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Kết Real-time PCR bệnh phẩm: Chúng tơi áp dụng quy trình vừa xây dựng lên 50 mẫu bệnh phẩm đàm biết nhiễm khuẩn lao Kết cho thấy có 11 trường hợp xuất đột biến codon 315 katG, trường hợp xuất đột biến codon 516 rpoB, trường hợp xuất đột biến codon 306 emb kiểu ATG-GTG trường hợp hợp đột biến codon 306 emb kiểu ATG-ATA Có trường hợp xuất đa đột biến, có trường hợp mẫu xuất đột biến codon 315 katG codon 516 rpoB, trường hợp lại mang đột biến codon 516 rpoB codon 306 emb 3.11.3 Xác định độ đồng thuận phƣơng pháp real time PCR với phƣơng pháp kháng sinh đồ Để xác định đồ đồng thuận phương pháp real-time PCR phương pháp kháng sinh đồ chẩn đốn lao kháng thuốc chúng tơi thơng qua hệ số kappa Hệ số kappa sử dụng để đánh giá phần trăm đồng thuận hai phương pháp dùng chẩn đoán bệnh sau loại bỏ yếu tố may rủi Giá trị hệ số kappa Kết đồng thuận hai phương pháp