Luận văn thạc sĩ phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người việt nam bằng kỹ thuật PCR RFLP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM MINH HUỆ PHÁT HIỆN MỘT LOẠI ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2011 PHẠM MINH HUỆ PHÁT HIỆN MỘT LOẠI ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHAN TUẤN NGHĨA Hà Nội-2011 Mục lục MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ty thể hệ gen ty thể người 1.1.1 Cấu trúc ty thể người 1.1.2 Chức ty thể người 1.1.3 Hệ gen ty thể người 1.2 Các loại đột biến hệ gen ty thể người bệnh liên quan .12 1.2.1 Đột biến điểm 12 1.2.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến tRNA rRNA .13 1.2.1.2 Các loại đột biến điểm phổ biến mRNA 14 1.2.2 Đột biến đoạn bp CCCCCTCTA 15 1.2.3 Các loại đột biến khác hệ gen ty thể 19 1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen ty thể 20 1.3.1 Lai DNA 20 1.3.2 PCR kết hợp RFLP (PCR-RFLP) 21 1.3.3 Xác định trình tự nucleotide 22 1.3.4 PCR định lượng 23 1.3.5 Một số phương pháp khác 25 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 Nguyên liệu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Tách DNA tổng số từ máu theo kit Qiagen 28 2.2.2 Tách plasmid theo phương pháp Sambrook Russell .28 2.2.3.Định lượng DNA phương pháp đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại 29 2.2.4 Điện di DNA gel agarose 29 2.2.5 Điện di DNA gel polyacrylamide 30 2.2.6 Nhân đoạn gen phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 30 2.2.7 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) 31 2.2.8 Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 32 2.2.9 Giải trình tự nucleotide máy tự động theo phương pháp Sanger 34 2.2.10 Phân tích số liệu phần mềm Genetyx 35 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Thu thập mẫu máu bệnh nhân tách chiết DNA tổng số 36 3.1.1 Một số đặc điểm mẫu phân tích 36 3.1.2 Tách chiết DNA mẫu 36 3.2 Phát đột biến A8344G đột biến đoạn bp PCR-RFLP 37 3.2.1 Nhân đoạn gen từ 8155-8366 PCR 37 3.2.2.Phát đột biến A8344G đột biến đoạn bp PCR-RFLP 38 3.2.3 Phân tích trình tự đoạn bp gen ty thể 41 3.3 Phân tích đột biến A3243A 46 3.3.1 Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G 47 3.3.2 Phát đột biến A3243G PCR-RFLP 48 Kết luận kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 59 PHỤ LỤC 62 Bảng chữ viết tắt Chữ viết tắt AID Amp APS bp CMV CoE COII CoQ CPEO CSF CytC dd H2O D-loop dNTP EBV EDTA EtBr ETC EtOH EV HVS HVS1 IPTG kb LB LHON MCS Tên tiếng Việt Bệnh điếc không hội chứng cảm ứng aminoglycoside Ampicillin Amonium persulphate Cặp base Coenzyme Cytochrome c oxidase II Coenzyme Q Hội chứng liệt mắt tiến triển kinh niên Dịch não tủy Cytochrome c Nước cất khử trùng loại ion Vòng chuyển vị Deoxynucleoside triphosphate Axit ethylen Diamine Tetraacetic Ethidium Bromide Chuỗi vận chuyển điện tử Ethanol Vùng siêu biến Isopropylthio-β-D Galactopyranoside Kilo base Môi trường Luria Betani Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber Trình tự nhân dịng đa điểm cắt Tên tiếng Anh Amino-glycoside-induced nonsyndronic deafness Ampicillin Amonium persulphate Base pair Cytomegalovirus Coenzyme Cytochrome c oxidase II Coenzyme Q Chronic progressive external ophthalmoplegia Cerebrospinal fluid Cytochrome c Deionnized distilled H2O Displacement loop Deoxynucleoside triphosphate Epstein-Barr virus Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Ethidium Bromide Electron transport chain Ethanol Enterovirus Hypervariable segment Herpes simplex virus type Isopropylthio-β-D Galactopyranoside Kilo base Luria Betani Leber herteditary optic neuropathy Multiple Cloning Sequence MELAS MERRF MIDD mtDNA MT-TL NAD+ NADH NARP NCR Ng OD PCR RFLP RLCH ROS SSCP T TAE TBE TEMED Th Ub v/p X-gal Hội chứng não ty thể, tăng acid lactic máu giả tai biến mạch Hội chứng động kinh giật với sợi đỏ nham nhở Bệnh tiểu đường điếc di truyền theo dòng mẹ DNA ty thể Gen mã hóa cho RNA vận chuyển leucine Nicotinamide-adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) Nicotinamide-adenine dinucleotide (dạng khử) Hội chứng gây liệt, điều hòa viêm võng mạc Vùng khơng mã hóa Ngày tuổi Mật độ quang học Phản ứng chuỗi polymerase Sự đa hình đoạn phân cắt giới hạn Rối loạn chuyển hóa Dạng oxy phản ứng Stranded Conformational Polymorphism Tuổi (Đệm) Tris-Acetate-EDTA (Đệm) Tris- Borate-EDTA N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine Tháng tuổi Ubiquinon Vòng/phút 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D galactopyranoside Mitochondrial Encephalopathy, Lactic acidosis, Stroke-like episodes Myoclonic epolepsy associated with ragged-red fibres Maternally inherited diabetes and deafness Mitochondrial DNA Mitochondrially encoded tRNA leucine Nicotinamide-adenine dinucleotide (Reduced) Nicotinamide-adenine dinucleotide Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos Non coding region Optical Density Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism Reactive oxygen species Sự đa hình cấu hình chuỗi đơn Tris-Acetate-EDTA Tris- Borate-EDTA N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine Ubiquinon 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D galactopyranoside Danh mục hình Hình 1: Các hình dạng khác ty thể Hình 2: Cấu trúc màng ty thể Hình 3: Sơ đồ minh hoạ chế lão hoá theo học thuyết ty thể .6 Hình 4: Sơ đồ minh họa chế sản sinh ROS ty thể Hình 5: Cấu trúc hệ gen ty thể người .10 Hình 6: Các loại đột biến điểm phổ biến mtDNA 13 Hình 7: Vị trí trình tự lặp lại bp mtDNA .16 Hình 8: Chu kỳ nhiệt PCR để nhân đoạn mtDNA (8155-8366) .31 Hình 9:Kết điện di sản phẩm DNA tổng số gel agarose 36 Hình 10: Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose .38 Hình 11: Kết điện di sản phẩm PCR gel polyacrylamide 38 Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR cắt BanII gel polyacrylamide 39 Hình 13: Kết điện di sản phẩm PCR số gia đình bệnh nhân cắt BanII gel polyacrylamide .40 Hình 14: Kết điện di sản phẩm PCR hai gia đình bệnh nhân gel polyacrylamide 41 Hình 15: Kết biến nạp hỗn hợp gắn sản phẩm PCR vector pGEM-T 41 vào E coli chủng DH5α 41 Hình 16: Kết điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc .42 Hình 17: Kết điện di sản phẩm tinh plasmid gel agarose 43 Hình 18: Kết so sánh trình tự đoạn gen bệnh nhân, mẹ bệnh nhân bố bệnh nhân gia đình III với trình tự chuẩn hệ gen ty thể cơng bố GenBank 44 Hình 19: Kết xác định trình tự đoạn gen đích gia đình III (A, B, C) 45 Hình 20: Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 47 Hình 21: Kết điện di sản phẩm PCR cắt HaeIII gel polyacrylamide 48 Hình 22: Kết điện di sản phẩm PCR cắt HaeIII gel polyacrylamide 50 Danh mục bảng Bảng 1: Một số mã di truyền DNA ty thể khác DNA nhân .11 Bảng 2: Một số hội chứng bệnh kèm theo đoạn bp 18 Bảng 3: Trình tự cặp mồi dùng PCR 27 Bảng 4: Thành phần gel điện di polyacrylamide .30 Bảng 5: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn mtDNA (8155-8366) 31 Bảng 6: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn BanII 32 Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn HeaIII 32 Bảng 8: Thành phần phản ứng gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 33 Bảng : Thành phần phản ứng PCR lần .34 Bảng 10: Danh sách bệnh nhân bị đột biến đoạn bp 46 Bảng 11: Hàm lượng axit lactic máu bệnh nhân bị đoạn bp .51 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Phạm Minh Huệ MỞ ĐẦU Ty thể quan tử tế bào nhân thực có vai trị tạo lượng dạng ATP cho hoạt động sống tế bào Ty thể có ̣gen riêng với DNA dạng mạch vịng , kích thước 16,5 kb, chư ́ a 37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển RNA ribosome ty thể Các gen ty thể di truyền từ mẹ sang Các protein gen ty thể mã hóa tham gia vào trình trao đổi chất tr ong ty thể cũ ng chuỗi vận chuyể n điên tử maǹ g củ a ty thể Ty thể là nơi xẩy quá triǹ h oxy hóa phosphoryl hóa và nhiề u quá triǹ h hóa sinh khác Các trình tạo dạng oxy phả n ứ ng (reactive oxygen species) nguyên nhân gây nên nhiều tổn thương cấu trúc DNA ty thể Tỷ lệ đột biến cao, có kiểu thừa kế khác số lớn tế bào đặc trưng DNA ty thể (mtDNA) Nghiên cứu đột biến mtDNA cách cho phép hiểu q trình tiến hóa người, cụ thể nguồn gốc, quan hệ họ hàng, khả giao phối với họ khác, di cư nhập cư tới vùng giới Một loạt loại hội chứng bệnh tật, có q trình già hóa ung thư, tượng chết theo chương trình tế bào (apoptosis) có nguyên nhân liên quan đến đột biến hệ gen ty thể Các đột biến hệ gen ty thể, cho dù đột biến điểm nucleotide, đứt đoạn hay đảo đoạn, thường xảy loại mô bào cần lượng cơ, tim, thận, tuyến nội tiết ảnh hưởng lớn đến chức chúng thể Năm 1988, đột biến gây bệnh hệ gen ty thể người biết đến ngày 270 đột biến gây bệnh hệ gen ty thể người phát Các đột biến mtDNA ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp ATP tế bào từ ảnh hưởng đến tất hệ thống quan Tuy nhiên, tế bào quan bị ảnh hưởng nhiều phận có mức tiêu thụ lượng cao não bộ, xương tim Nhiều đột biến mtDNA xuất nguyên nhân chủ yếu gây chức cơ, thần kinh Không phải tất phần genome ty thể phát triển mức độ đột biến, phần thay đổi thường xun mtDNA phần khơng mã hóa, phần nằm vùng điều khiển gọi D-loop (chứa hai vùng siêu biến HVR1 HVR2 Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Phạm Minh Huệ bp 1234567 198 111 87 Hình 22: Kết điện di sản phẩm PCR cắt HaeIII gel polyacrylamide Đường chạy 1: thang chuẩn DNA Low Range, 2: đối chứng âm (sản phẩm PCR không cắt HaeIII), 3: đối chứng dương, 4: Bệnh nhân Đ., 5: anh bệnh nhân Đ., 6: mẹ bệnh nhân Đ, 7: bố bệnh nhân Đ Sự tồn băng DNA có kích thước ban đầu 198 bp sản phẩm cắt mẫu bệnh nhân, anh mẹ bệnh nhân (hình 22) lý giải tượng heteroplasmy Cơ thể mang đột biến A3243G chứa đồng thời copy có đột biến copy khơng có đột biến nên sản phẩm PCR có chứa đoạn DNA mang đột biến đoạn DNA không mang đột biến Do đó, sản phẩm PCR-RFLP mẫu mẹ, anh trai bệnh nhân bệnh nhân có băng 198 bp Thêm nữa, dựa vào độ sáng băng DNA sản phẩm cắt bệnh nhân, anh mẹ bệnh nhân (hình 22) chúng tơi đưa nhận định rằng: tỉ lệ sản phẩm PCR bị cắt enzyme HaeIII mẹ bệnh nhân thấp so với hai người nhiều, điều cho thấy tỉ lệ ty thể mang đột biến A3243G/ty thể không mang đột biến mẹ bệnh nhân thấp hai người Nhận định phần giải thích bệnh nhân có biểu hội chứng MELAS rõ rệt, cịn mẹ bệnh nhân khơng có biểu bệnh Như vậy, thấy bệnh nhân Nguyễn Văn Đ mang đồng thời đột biến đoạn bp CCCCCTCTA đột biến MELAS A3243G Mất đoạn bp yếu tố nhạy cảm cho bệnh rối loạn đa yếu tố liên quan đến ty thể Dựa phương pháp chẩn đoán bệnh ty thể gồm có xét nghiệm lâm sàng, cận lâm sàng xét nghiệm phân tử Các xét nghiệm lâm sàng cận lâm sàng gồm có số lactate, nồng độ protein dịch não tủy (CSF), điện tâm đồ, điện cơ, sinh thiết cơ, xét nghiệm hóa sinh enzyme chuỗi hô hấp Xét nghiệm phân tử gồm kiểm tra tồn đột biến mtDNA Lớp Cao học K18 68 Khóa 2009-2011 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Phạm Minh Huệ Theo dẫn liệu Bệnh viện Nhi Trung ương cung cấp, thấy bệnh nhân đoạn bp phát thuộc nhóm có hàm lượng axit lactic máu cao (bảng 11) Bảng 11: Hàm lƣợng axit lactic máu bệnh nhân bị đoạn bp STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Họ tên bệnh nhân Hoàng Thị Như Q Nguyễn Văn Đ Nguyễn Đình Ng Trần An N Nguyễn Văn T Đỗ Trường P Trần Thanh B Trần Văn H Nguyễn Thị Phương Kh Nguyễn Thị Th Nguyễn Mạnh D Vũ Qúy M Đào Thái S Lê Doãn Xuân Tr Đinh Viêṭ N Lê mai L Phạm Thanh H Hà Việt Hoàng Nguyễn Thị Phương N Tuổi 13 Th 11 T Th 40 Ng 2,5 T 2T 4,5 Th 15 T 12 T Th 14 Th 10 Th 3, Th 17 Th 10 T 10 T 4T 4T 25 Th Ngƣời bình thƣờng Axit lactic máu 20,3 mmol/L 9,2 mmol/L 6,3 mmol/L 6,3 mmol/L 5,7 mmol/L 5,5 mmol/L 5,4 mmol/L 4,3 mmol/L 4,2 mmol/L 4,0 mmol/l 3,9 mmol/L 3,6 mmol/L 3,6 mmol/L 3,4 mmol/L 3,0 mmol/L 2,7 mmol/L 2,7 mmol/L 2,4 mmol/L 2,2 mmol/L 1,0 - 1,78 mmol/L Axit lactic hợp chất hữu sinh học, sản sinh từ q trình đường phân (glycolysis) Hầu hết quan, tổ chức thể trì hoạt động nhờ vào trình cung cấp lượng hiếu khí Tuy nhiên ty thể bị hỏng tế bào sử dụng tồn phần hay phần lượng từ nguồn oxy hóa glucose yếm khí sản sinh axit lactic khuếch tán vào máu Vì đột biến đoạn bp khơng thuộc vùng gen mã hóa cho RNA hay protein nào, nên nguyên nhân trực tiếp gây nên rối loạn chức Lớp Cao học K18 69 Khóa 2009-2011 ty thể Các rối loạn tăng axit lactic máu biểu bất bình thường thần kinh vận động (không nêu đây) bệnh nhân điều tra liên quan đến có mặt đột biến khác hệ gen ty thể mà chưa phát thấy nghiên cứu Tỷ lệ đột biến đoạn bp cao (32%) mức người bình thường nghiên cứu chúng tơi nói lên rằng, có liên quan định đoạn bp với khả bị đột biến khác hệ gen ty thể Kết luận kiến nghị Kết luận Đã thiết lập quy trình phân tích đột biến đoạn bp CCCCCTCTA nằm vùng khơng mã hóa gen mã hóa cho tRNA Lys vùng COII hệ gen ty thể người Đã điều tra có mặt đột biến đoạn bp CCCCCTCTA 72 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể phát thấy tần số đoạn bp bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể Việt Nam 32% đột biến di truyền từ mẹ sang Những bệnh nhân đoạn bp CCCCCTCTA có biểu rối loạn hoạt động ty thể, đặc trưng số lactate máu tăng cao có triệu chứng bệnh thần kinh Đã phát 01 bệnh nhân mang đột biến đoạn bp đồng thời mang đột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS, không phát thấy bệnh nhân số 72 bệnh nhân điều tra mang đột biến A8344G Kiến nghị Áp dụng quy trình phân tích đột biến đoạn bp CCCCCTCTA thiết lâ vơí số lươn g lơń kem ̀ theo xać điṇ h môt số đôt biến gen ty thể p mâu khác để tìm mối liên quan sư ̣ mấ t bp khả bị đột biến khác , làm đoan ̣ sở cho cać tư vấn sứ c khoẻ và điều tri Nghiên cứu tần số đoạn bp tôc ngươì Việt Nam nhằm xác định mối quan hệ di truyền tiến hóa di cư TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban, Lê Thanh Hịa, Nguyễn Văn Vũ, Hồng Minh Châu, Nguyễn Bích Nga, Đái Hằng Nga, Lê Kim Xuyến, Đồn Thanh Hương, Phạm Công Hoạt, Phan Xuân Đọc, Lê Trung Dũng, Lê Quang Huấn, Nguyễn Thanh Đạm, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Cơng Hồng (2003), “Bước đầu nghiên cứu ung thư vú bệnh nhân Việt Nam phương pháp sinh học phân tử sử dụng thị di truyền hệ gen ty thể vùng D-loop”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học, Huế 25-26/7/2003, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà nội, tr 825-829 Lê Quang Huấn, Trần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, Lê Trần Bình (2003), “Nghiên cứu giám định phả hệ kỹ thuật DNA”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học, Huế 25-26/7/2003, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà nội, tr 917-919 Trịnh Lê Phương, Chu Văn Mẫn Phan Tuấn Nghĩa (2009), “Phân ti ć h đột biến gen A3243G hội chứng MELAS phương pháp PCR-RFLP cải tiến”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Số 4: 6-9 Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, Nghiêm Đình Dũng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải (2006), “Xác định trình tự đoạn DNA từ vị trí 5805 đến vị trí 8414 hệ gen ty thể người Việt Nam”, Báo cáo kết nghiên cứu đề mục, Đề tài KC-0425, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội, tr.10-20 Phạm Hùng Vân (2009), PCR Real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học, Hồ Chí Minh Tài liệu Tiếng Anh Anderson S., Bankier A T., Barrel B G., de Bruijn M H L., Coulson A R., Drouin J., Eperson I C., Nierlich D P., Roe B A., Sanger F., Schreier P H., Smith A J H., Staden R., Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochrondrial genome”, Nature, 290, pp 457−465 Andreu A L., Bruno C., Dunne T C., Tanjik K., Shanske S., Sue C M., Krishna S., Hadjigeorgiou G M., Shtilbans A., Bonilla E., DiMauro S (1999), “A nonsense mutation (G15059A) in the cytochrome b gên in a patient with exercise intolerance and myoglobinuria”, Ann Neurol., 45, pp 127-130 Ballinger S.W., Schurr T.G., Torroni A., Gan Y Y., Hodge J A., Hassan K., Chen K H and Wallace D C (1992), “Southeast Asian mitochondrial DNA analysis reveals genetic continuity of ancient Mogoloid migrations”, Genetics, 130, pp 139-152 Barrietos A., Casademont J., Solans A., Moral P., Cardellach F., Urbano-Márquez A., Estivill X and Nunes V (1995), “The 9-bp deletion in region V of mitochondrial DNA: evidence of mutation recurrence”, Hum Genet, 96, pp 225228 10.Bouzisi M F., Schager H., Collombet J M., Carrier H., Flocard F., Quard S., Mousson B., Godinot C (1993), “Decreased expression of ubiquinolcytochrome c reductase subunits in patients exhibiting mitochondrial myopathy with progressive exercise intolerance”, Neuromuscul Disord., 3, pp 599-604 11.Clayton D A., Vinograd J (1967), “Circular dimerand catenate forms of mitochondrial DNA in human leukaemic leucocytes”, Nature, 216, pp 652−657 12.De Coo I F., Renier W O., Ruitenbeek W., TerLaak H J., Bakker M., Schagger H., Van Oost B A., Smeets H J (1999), “A 4-base pair deletion in the mitochondrial cytochrome b gene associated with parkinsonism/ Melas overlap syndrome”, Ann Neurol., 45, pp 130-133 13.DiMauro S., Hirano M., Kaufmann P., Tanji K., Sanno M., Shugu D C., Bonillia E., DeVivo D C (2002), “Clinical features and genetics of myoclonic epilepsy with ragged red fibers”, Adv Neurol., 89, pp 217-229 14.Du W D., Li W., Chen G., Cao H M., Tanga H., Tanga X., Jin Q., Sund Z., Zhao H., Zhoua W., Hea S., Lva Y., Zhao J., Zhanga X (2009), “Detection of known base substitution mutations in human mitochondrial DNA of MERRF and MELAS by biochip technology”, Biosen Bioelectron., 24, pp 2371–2376 15.Handoko H Y., Lum J K., Rismalia G., Kartapradja H., Sofro A S M and Marzuki S ( 2001), “Length Variations in the COII–tRNALys Intergenic Region of Mitochondrial DNA in Indonesian Populations”, Hum Biol., 73, pp 205–223 16.Hertzberg M., Mickleson K N P., Serjeantson S W., Prior J F., and Trent R J (1989), “An Asian-specific 9-bp Deletion of Mitochondrial DNA Is Frequently Found in Polynesians”, Am J Hum Genet., 44, pp 504-510 17.Ida H., Rennert O M., Iwasawa K., Kobayashi M., Eto Y (1999), “Clinical and genetic studies of Japanese homozygotes for the Gaucher disease L444P mutation”, Hum Genet., 105, pp 120–126 18.Ivanova R., Astrinidis A., Lepage V., Djoulah S., Wijnen E., Vu-Trieu A., Hors J and Charron D (1999), “Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population”, Eur J Immunogenet., 26, pp 417–422 19.Keightley J A., Anitori R., Burton M D., Quan F., Buist N R., Kennaway N G (2000), “Mitochondrial encephalomyopathy and complex III deficiency associated with a stop-codon mutation in the cytochrome b gene”, Am J Hum Genet., 67, pp 1400-1410 20.Kolesnikova O A., Entelis N S., Mireau H., Fox T D., Martin R P., Tarassov I A (2000), “Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the cytoplasm”, Science, 289, pp 1931 – 1933 21.Legros F., Chatzoglou E., Frachon P., Ogier De Baulny H., Laforet P., Jardel C., Godinot C., Lombes A (2001), “Functional characterization of novel mutations in the human cytochrome b gene”, Eur J Hum Genet., 9, pp 510-518 22.Liu C S., Cheng W L., Chen Y Y., Ma Y S., Pang C Y., and Wei Y H (2005), “High Prevalence of the COII/tRNALys Intergenic 9-bp deletion in Mitochondrial DNA of Taiwanese Patients with MELAS or MERRF Syndrome”, Ann NY Acad Sci., 1042, pp 82-87 23.Masoro E J and Austad S N (2006), Handbook of The Biology of Aging, 6th Edition, Academic Press, USA 24.Miller F J., Losenfeldt F L., Zhang C., Linnane A W and Nagley P (2003), “ Precise determination of mitochondrial DNA copy number in human skeletal and cardiac muscle by a PCR-based assay”, Nucleic Acids Re., 31, e61 25.Montero M., Alonso M., Albillos A., Cuchillo-Ibanez I., Olivares R., Villalobos C (2002), “Effect of inositol 1,4,5-triphosphate receptor stimulation on mitochondrial (Ca2+) and secretion in cromaffin cells”, Biochem J., 365, pp 451-459 26.Musumeci O., Andreu A L., Shanske S., Bresolin N., Comi G P., Rothstein R., Schon E A., and DiMauro S ( 2000), “Intragenic Inversion of mtDNA: A New Type of Pathogenic Mutation in a Patient with Mitochondrial Myopathy”, Am J Hum Genet., 66, pp 1900–1904 27.Nelson D L., Cox M M (2009), Lehninger Principles of biochemistry, Worth publishers, Inc 28.Nogueira C., Nunes J., Evangelista T., Fattori F., Tesa A., Pereira C., Santorelli F M., Vilarinho L (2007), “A new mtDNA-tRNAGlu mutation (14728T>C) presenting a late-onset mitochondrial encephalomyopathy”, Mitochondrion, 7, pp 396-398 29.Oota H., Kitano T., Jin F., Yuasa I., Wang L., Ueda S., Saitou N., Stoking M (2002), “Extreme mtDNA homoleneity in continental Asia populations”, Am J Phys Anthropol., 118, pp 146-153 30.Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J K., Markowitz S D., Trush M A., Kinzer K W., Vogelstein B (1988), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet., 20, pp 291-293 31.Redd A J., Takezaki N., Sherry S T., McGarvey S T., Sofro A S., Stoneking M (1995), “ Evolutionary history of the COII/tRNALys intergenic base pair deletion in human mitochondrial DNAs from the Pacific”, Mol Biol Evol., 12, pp 604– 615 32.Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory, New York 33.Schon E A., Rizzuto R., Moraes C T., Nakase H., Zeviani M., DiMauro S (1989), “A direct repeat is a hostpot for large-scale deletion of human mitochondrial DNA”, Science, 244, pp 346-349 34.Schuelke M., Krude H., Finckh B., Mayatepek E., Janssen A., Schmelz M., Trefz, Trijbels F., Smeitink J (2002), “Septo-optic dysplasia associated with a new mitochondrial cytochrome b mutation”, Ann Neurol., 51, pp 388-392 35.Singh R., Ellard S., Hattersley A., and Haries L W (2006), “Rapid and sensitive Real-time polymerase chain reation method for detection and quantification of A3243G mitochondrial point mutation”, J Mol Diagn., 8, pp 225-230 36.Sokolova V A., Vasilyev V B., (2002), “A Russian family of Slavic origin carrying mitochondrial DNA with a 9-bp deletion in region V and a long Cstretch in D-loop”, Elsevier Science, pp 479–483 37.Strand H., Ingebretsen O C., Nilssen Ø (2008), “Real-time detection and quantification of mitochondrial mutations with oligonucleotide primers containing locked nucleic acid”, Clin Chim Acta., 390, pp 126-133 38.Tanahashi C., Nakayama A., Yoshida M., Ito M., Mori N., Hashizume Y (2000), “MELAS with the mitochondrial DNA 3243 point mutation: a neuropathological study”, Acta Neuropathol., 99, pp 31-38 39.Thomas M G., Cook C E., Miller K., Waring M J and Hagelberg E (1998), “Molecular instability in the COII±tRNALys intergenic region of the human mitochondrial genome: multiple origins of the 9-bp deletion and heteroplasmy for expanded repeats”, Phil Trans R Soc Lond., 353, pp 955-965 40.Watkings W S., Bamshad M., Dixon M E., Rao B B., Naidu J M., Reddy P G., Prasad B V R., Das P K., Reddy P C., Gai P B., Bhanu A., Kusuma Y S., Lum J K., Fishcher P., and Jorde W S (1999), “Multiple Origins of the mtDNA 9-bp Deletion in Populations of South India”, Am J Phys Anthropol., 109, pp 147–158 41.Wibrand F., Ravn K., Schwartz M., Rosenberg T., Horn N., Vissing J (2001), “Multisystem disorder associated with a missense mutation in the mitochondrial cytochrome b gene”, Ann Neurol., 50, pp 540-543 42.Wrischnik L A., Higuichi R G., Stoneking M., Erlich H A., Arnheim N and Wilson A C (1987), “Length mutations in human mitochondrial DNA: direct sequencing of enzymatically amplified DNA”, Nucleic Acids Res., 15, pp 529542 43.Zhuo G., Feng G., Leng J., Yu L., Jiang Y (2010), “A 9-bp deletion homoplasmy in women with polycystic ovary syndrome revealed by mitochondrial genome – mutation screen”, Biochem Genet., 48, pp 157-163 Tài liệu từ trang web 44.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J01415.2 45.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=melas DiMauro S., Hirano M (2001) “MELAS”, GENE Reviews 46 https://notes.utk.edu/bio/bcmb421.nsf/f5b2cbf2a827c0198525624b00057d30/21 7c10a4beedc0298525651300613209?OpenDocument 47 http://genome.wellcome.ac.uk/doc_WTD020876.html Sykes B (2003) “Mitochondrial DNA and human history” 48 http://www.mitomap.org/mitoseq.html “A human mitochondrial genome database” PHỤ LỤC Danh sách bệnh nhân đƣợc sàng lọc đột biến đoạn bp TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Họ tên Bệnh nhân Bố mẹ Nguyêñ Minh L Đinh Viêṭ Ng Nguyêñ Như T Vũ Thành L Trịnh Phương Đ Trần Duy K Kiều Văn T Nguyêñ D Nguyêñ Đình Ng Nguyễn Đình Nh Đỗ Thị Gi Nguyêñ Văn T Nguyêñ Văn Hả i D Lê Đình Maṇ h Q Đặng Xuân Ph Triêụ Thi ̣Y Hoàng Thị Như Q Hoàng Văn T Nguyễn Thị H Nguyễn Thị Th Nguyễn Mạnh H Nguyễn Hồng Đ Nguyễn Vũ Q Kim Tuấn H Nguyễn Thu H Trịnh Hồng Ph Nguyễn Như Ng Hoàng Phương L Đồn Thị Vân A T̉i Th 10 T Th 14 T Th Th 3T Th Th 35 T 30 T 2.5 T Th 2T 5T 14 Th 1T 33 T 31 T Th 42 T 27 T 3T 12 T Th 3T 4T Th 15 T A260/A Nồng độ Ngày lấy 280 ng/µl mẫu 1,95 1,87 1,77 1,89 1,84 1,91 1,91 1,99 1,90 1,88 1,82 1,85 1,92 1,93 1,82 1,83 1,84 1,80 1,97 1,78 1,84 1,78 1,94 1,86 1,86 1,84 1,98 1,85 1,80 34,3 25,8 20,2 27,2 54,6 92 60,4 78,8 49,7 28,3 25,2 54,9 55,3 41,6 35,0 62,5 34,7 45,5 39,8 40,4 36,0 35,6 41,1 21,2 31,5 49,0 62,0 86,2 29,5 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 3.3.10 7.6.10 7.6.10 7.6.10 5.4.10 5.4.10 5.4.10 5.4.10 5.4.10 5.4.10 5.4.10 4.6.10 4.6.10 4.6.10 12.6.10 12.6.10 12.6.10 Ghi chú Bố Ng Mẹ Ng Bố Q Mẹ Q Bố Th Mẹ Th 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Nguyễn Thị T Nguyễn Kim H Nguyễn Thị H Bùi Anh Đ Lê mai L Bùi Thị D Lê Xuân S Lê Văn T Bùi Thanh T Trần Xuân B Nguyễn Hoàng A Nguyễn Thị Hồng H Cao Xuân H Trần Thanh B Trần An N Đinh Bá Ngọc Q Nguyễn Phương Th Hà Việt H Phạm Thị Tâm A Nguyễn Anh T Phạm Thị Huyền Tr Hoàng Ngọc Cẩm A Nguyễn Thị Phương N Nguyễn Hồng Q Phạm Nhật Q Lê Tuấn A Lê Duy H Nguyễn Thế M Nguyễn Duy A Vũ Qúy M Phạm Khắc T Phạm Thanh H Nguyễn Thụy Kh H Bùi Linh C Đỗ Trường Ph 5T Th 1T 3T 10 T 39 T 39 T 7,5 Th 3T 18 Th 18 T 18 Th 10 Th 4,5 Th 40 Ng 8T 4T 4T 8T 10 Th 12 T 30 Th 25 Th Th 6T Ng 12 T 5T Th 10 Th Th 4T Th Th 2T 1,84 1,96 1,95 1,92 1,79 1,81 1,93 1,87 1,87 1,82 1,80 1,84 1,99 1.82 1,75 1,87 1,97 1,85 1,87 1,87 1,83 1,87 1,86 1,93 1,85 1,82 2,01 1,83 1,87 1,82 1,93 1,90 1,90 1,84 1,87 33,8 38,6 21,2 38,0 26,9 40,9 52,4 60,4 40,8 51,6 24,7 55,0 41,4 33,6 56,5 62,6 23,2 34,9 45,5 58,1 26,8 43,2 35,4 76,5 25,0 32,7 18,0 30,2 52,5 27,4 43,5 23,7 62,6 43,0 35,3 12.6.10 12.6.10 12.6.10 12.6.10 12.6.10 12.6.10 12.6.10 14.9.10 14.9.10 14.9.10 14.9.10 14.9.10 1.8.11 14.9.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 21.12.10 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 29.4.11 Mẹ L Bố L 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 Phạm Thị Thu H Nguyễn Văn Đ Ngô Thị Ng Nguyễn Minh Đ Nguyễn Văn Đi Trần Văn H Phan Thị Thanh H Lê Doãn Xuân Tr Nguyễn Quỳnh Tr Nguyễn Mạnh D Vũ Thị Quỳnh C Nguyễn Thị Ph Kh Nguyễn Thành Đ Nguyễn Đức Th Lê Thị K Trần Đình Việt D Trần Quế Ph Bùi Minh A Nguyễn Thị Lan A Đào Thái S Nguyễn Hồng Quốc A Nông Tuấn A 14 T 11 T 47 T 49 T 20 T 15 T 6T 17 Th 17 Th 14 T Th 12 T 4T 38 T 35 T 2,5 Th 53 Ng 9T 2T 3,5 Th 5T 2T 1,88 1,85 1,82 1,79 1,85 1,86 1,95 1,91 1,87 1,80 1,92 1,95 1,86 1,87 1,84 1,99 1,89 1,80 1,86 1,89 1,79 1,85 79,7 65,9 24,8 34,3 26,8 34,5 41,5 42,1 25 47,9 36,7 40,0 21,7 34 23,9 46,5 43,2 44 30,5 40,0 31,5 41,0 29.4.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 3.6.11 1.8.11 1.8.11 1.8.11 1.8.11 mẹ Đ bố Đ anh Đ Em Kh Bố Kh Mẹ Kh PHỤ LỤC Danh sách bệnh nhân đƣợc xác định có đột biến đoạn 9bp TT Họ tên bệnh nhân Đinh Viêṭ N Giới tính Nam Tuổi Nguyêñ Đình N Nam Th Nguyêñ Văn T Nam 2,5 T 10 T Dân tộc Cân Đặc trƣng bệnh nặng 15,5kg Co giật, Động kinh Thiếu máu Kinh 8kg RLCH ty thể Động kinh cục Kinh kg Động kinh tồn thể Rối loạn chuyển hóa ty lạp Hoàng Thị Như Q Nữ 13 Th Kinh 10 kg thể, viêm não hoại tử bán cấp, bại não Hội chứng Leigh Bệnh chuyển hóa ty thể, chậm phát triển vận động, TK ngoại vi Động kinh, RLCH ty thể Nguyễn Thị T Nguyễn Kim H Nữ Nữ Th 3T Kinh kg Lê mai L Nữ 10 T Kinh 32 kg Nguyễn Hoàng A Nam 18 Th Viêm não chất trắng, viêm phổi, RLCH ty thể Co giật, động kinh Trần Thanh B Nam 4,5 Th Kinh 6,5 kg Co giật, động kinh, RLCH 10 Trần An N Nam 40 3,3 kg Suy giảm miễn dịch, động Nam ngày 4T 11 12 Hà Việt H Nữ 2T 13 Nguyễn Thị PhươngN Phạm Nhật Q Nam 5T 14 Vũ Qúy M Nam 10 Th 15 Phạm Thanh H Nữ 4T Kinh Kinh kinh Động kinh cục bộ, loạn dưỡng Kinh não chất trắng RLCH ty thể 14kg Co giật, RLCH ty thể Kinh Kinh 12 kg 11 kg Động kinh, dị tật vỏ não Hội chứng West Di chứng viêm não, RLCH ty thể Giật cơ-thất điều (HC Kinsborne) 16 Đỗ Trường P Nam 2T Kinh 13 kg Động kinh toàn thể, RLCH ty thể 17 Nguyễn Văn Đ Nam 11 T Kinh 18kg RLCH ty thể, Hội chứng Melas, viêm não 18 Trần Văn H Nam 15 T Kinh 42kg 19 Lê Doãn Xuân Tr Nam 17 Th 20 21 Nguyễn Mạnh D Nguyễn Thị Ph Kh Nam Nữ 14 T 12 T 22 Trần Đình Việt D Nam 23 Đào Thái S Nam Bệnh ty thể, di chứng viêm não, nhồi máu não 10kg Run-Rối loạn chuyển hóa, Hội chứng động kinh Động kinh cục bộ, Kinh 41 kg Suy giảm miễn dịch thể dịch Kinh 26,5kg Bệnh ty thể, bệnh hệ thống, RLCH MELAS Bệnh RLCH ty thể 4T 3,5 Th Kinh kg Động kinh toàn thể, Hội chứng West ...PHẠM MINH HUỆ PHÁT HIỆN MỘT LOẠI ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR- RFLP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA... 3.2 Phát đột biến A8344G đột biến đoạn bp PCR- RFLP 37 3.2.1 Nhân đoạn gen từ 8155-8366 PCR 37 3.2.2 .Phát đột biến A8344G đột biến đoạn bp PCR- RFLP 38 3.2.3 Phân tích trình tự đoạn bp gen ty. .. hệ tiến hóa, di truyền quần thể Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài: ? ?Phát loại đột biến gen ty thể người Việt Nam kỹ thuật PCRRFLP”, chúng tơi tập trung nghiên cứu đột biến đoạn bp CCCCCTCTA vùng