Luận văn thạc sĩ nghiên cứu sự phân bố các hợp chất ENT KAURAN DITECPENOIT trong cây khổ sâm bắc bộ croton tonkinesis gagnep euphorbiaceae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HOÀI THANH NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CÁC HỢP CHẤT ENT-KAURAN DITECPENOIT TRONG CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ (CROTON TONKINENSIS GAGNEP., EUPHORBIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HOÀI THANH NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CÁC HỢP CHẤT ENT-KAURAN DITECPENOIT TRONG CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ (CROTON TONKINENSIS GAGNEP., EUPHORBIACEAE) Chuyên ngành : Hóa học hữu Mã số 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Phan Minh Giang Hà Nội - 2011 Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CROTON (HỌ EUPHORBIACEAE) .8 1.2 CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ (CROTON TONKINENSIS GAGNEP.) .10 1.2.1 Thực vật học 10 1.2.2 Tác dụng dƣợc lý Khổ sâm Bắc Bộ [1, 4] 11 1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 11 1.3.1 Các ent-kauran ditecpenoit từ chi Croton .11 1.3.2 Các kauran ditecpenoit từ Khổ sâm Bắc Bộ 12 1.3.3 Các flavonoit 17 1.3.4 Các ancaloit 18 1.3.5 Các thành phần hóa học khác 20 1.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ .21 1.4.1 Tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét .21 1.4.2 Tác dụng kháng vi sinh vật 21 1.4.3 Tác dụng chống viêm 22 1.4.4 Tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thƣ 22 Chƣơng 2:NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN .25 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Phƣơng pháp chiết phân tách hợp chất từ nguyên liệu thực vật .25 2.2.2 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách phân lập sắc ký 26 2.2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc (các phƣơng pháp phổ) 27 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM 28 3.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 28 3.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 28 3.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KHỔ SÂM 29 Luận văn Thạc sĩ 2011 Nguyễn Thị Hồi Cao học Hóa Thanh K20 3.4 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 30 3.4.1 Phân tích phần chiết n-hexan (CTH) 30 3.4.2 Phân tích phần chiết điclometan (CTD) 31 3.4.3 Phân tích phần chiết etyl axetat (CTE) 33 3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 33 3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (CTH) 33 3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (CTD) 35 3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (CTE) 36 3.5.4 Phân tách phần chiết nƣớc (CTW1) 36 3.6 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 38 3.7 PHÂN TÍCH HPLC MẪU CHIẾT MEOH CÀNH NHỎ CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 42 3.7.1 Nguyên liệu 42 3.7.2 Chuẩn bị mẫu phân tích: điều chế phần chiết metanol 42 3.7.3 Điều kiện phân tích sắc ký HPLC 42 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .43 4.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KHỔ SÂM 43 4.3 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÀNH KHỔ SÂM BẮC BỘ .46 4.3.1 Phân tách phần chiết n-hexan (CTH) 46 4.3.2 Phân tách phần chiết điclometan (CTD) 46 4.3.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (CTE) 46 4.3.4 Phân tách phần chiết nƣớc (CTW) 47 4.4 CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 44 4.5 PHÂN TÍCH HPLC MẪU CHIẾT MEOH CÀNH NHỎ CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 52 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Luận văn Thạc sĩ 2011 Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 LỜI MỞ ĐẦU Vốn đất nƣớc đƣợc thiên nhiên ƣu đãi, nằm vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có thảm thực vật vô phong phú đa dạng với 12.000 loài thực vật bậc cao Từ nhiều kỷ nay, thực vật không nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho ngƣời mà phƣơng thuốc chữa bệnh quý Trên đƣờng phát triển thuốc chữa bệnh cać hóa chất có nguồn gốc thiên nhiên vân chố ng nhiêm đó ng gó p maṇ h và o cá c h vƣc lin khuẩ n , chống viêm, điề u chỉnh miên điều tri ḅ ao gồm chống ung thƣ , dic̣ h và các bêṇ h thần kinh Giƣã nhƣñ g năm 2000 - 2005 tiếp tục có 20 thuốc mơí là hợp chất thiên nhiên hoăc dân phƣơng phaṕ saǹ g loc xuất tƣ̀ thiên nhiên đã đƣơc thƣơng mại hóa Viêc áp dụng các hoaṭ tính sinh hoc nhanh nghiên cứu hóa dƣợc y sinh đặt thách thƣ́ c các nhà hóa hoc nghiên cƣ́ u các quy triǹ h phân lập nhanh , hiêu hợp chất thiên nhiên quả cać hơp chất thiên nhiên tƣ̀ cać nguồn thƣ̣ c vâṭ , vi nấm , sinh vâṭ biển… các chuyển hóa hóa hoc cấu trúc gốc, ví dụ nhƣ đƣờng biomimetic, để tạo xuất mơí chứa dân phần cấu trúc định cho hoạt tính sinh học Một đƣờng nhanh đến hợp chất có tác dụng sinh học dựa kiến thức dƣợc lý học dân tộc Cây Khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học Croton tonkinensis Gagnep, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) thuốc phổ biến y học dân gian Việt Nam, đặc biệt bệnh chống nhiễm trùng, viêm loét hoành tá tràng, đau dày… Cây Khổ sâm Bắc Bộ đƣợc nghiên cứu, đánh giá tác dụng dƣợc lý ký sinh trùng sốt rét, vi sinh vật mơ hình kháng viêm chống ung thƣ in vitro Các nghiên cứu sâu nhà khoa học Việt Nam phát đƣợc nhóm hợp chất ent-kauran ditecpenoit từ Luận văn Thạc sĩ 2011 Nguyễn Thị Hồi Cao học Hóa Thanh K20 Khổ sâm Bắc Bộ định cho hoạt tính Các hợp chất thiên nhiên đƣợc biết đến xuất hạn chế vào loài phận cụ thể thực vật nguồn gốc sinh tổng hợp chúng Tiếp theo nghiên cứu thành phần từ Luận văn Thạc sĩ 2011 Khổ sâm Bắc Bộ mở rộng nghiên cứu phân lập hợp chất từ cành Khổ sâm Bắc Bộ qua đánh giá đƣợc xác phân bố hàm lƣợng ent-kauran ditecpenoit Khổ sâm Bắc Bộ Luận văn nghiên cứu qui trình chiết, phân tách phân lập sắc ký để đánh giá phân bố hợp chất ent-kauran ditecpenoit thành phần khác cành Khổ sâm Bắc Bộ xác định cấu trúc hợp chất Một phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đƣợc phát triển để định lƣợng hoạt chất ent-kauran ditecpenoit cành Khổ sâm Bắc Bộ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CROTON (HỌ EUPHORBIACEAE) Chi Croton L thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có khoảng 700 lồi, gặp phổ biến vùng nhiệt đới, gặp vùng ơn đới vùng hàn đới Ở châu Á có khoảng 50 lồi, riêng Đơng Dƣơng có 40 loài [7] Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ chi Croton L có 18 lồi [3], cịn Nguyễn Nghĩa Thìn [16] thống kê đƣợc 41 lồi, có tới 21 loài đặc trƣng hệ thực vật nƣớc ta Một số loài thuộc chi Croton Việt Nam: Croton argygratus Blume.: Bạc Croton cascarilloidis Raeusch.: Cù đèn bạc, Khai đen Croton oblongifolius Roxb.: Cù đèn Croton delpyi Gagnep.: Cù đèn Delpy Croton caudatus Geiseler.: Cù đèn đuôi Croton maieuticus Gagnep.: Cù đèn hộ sản Croton crassifolius Geiseler.: Cù đèn lông, Ba vỏ Croton glandulous L.: Cù đèn lông cứng Croton poilanei Gagnep.: Cù đèn cƣa Croton roxburghianum Bal.: Cù đèn Roxburgh Croton thorelii Gagnep.: Cù đèn Thorel Croton potabilis Croiz.: Cù đèn tả Croton tiglium L.: Ba đậu Mần để Có nhiều lồi thuộc chi Croton L đƣợc sử dụng y học dân gian nhiều dân tộc, khu vực Trung Nam Mỹ nhƣ Đông Nam Á Croton cajicara Benth mọc nhiều vùng Amazon, đƣợc dùng để điều trị bệnh tiểu đƣờng, làm giảm cholesterol máu, rối loạn tiêu hóa, loạn gan giảm cân [52] Croton celtidifolius Baill đƣợc tìm thấy miền nam Brazil, vỏ đƣợc dùng để chữa bệnh viêm, loét [52] Croton eluteria Bennett đƣợc ngƣời dân Equađo dùng chữa bệnh cao huyết áp, kiết lỵ, sốt rét, đau dày [7] Croton lechleri mọc Equađo Peru đƣợc dùng để chữa vết thƣơng, cầm máu [7] Croton malambo Karst phía tây Venezuela phía bắc Colombia đƣợc dùng y học cổ truyền để điều trị bệnh tiểu đƣờng tiêu chảy, bệnh thấp khớp, loét dày, chống viêm [52] Croton draco có nguồn gốc Mexico, đƣợc sử dụng chữa bệnh ho, cảm cúm, tiêu chảy, viêm loét dày, chữa lành vết cắt, lở loét, mụn chống nhiễm trùng sau nhổ [52] Croton oblongifolius Roxb phát triển Ấn Độ Thái Lan, đƣợc dùng nhƣ thuốc bổ, chữa rối loạn tiêu hóa, bệnh lỵ Ngồi ra, y học cổ truyền Thái cịn sử dụng kết hợp với Croton sublyratus để điều trị loét dày ung thƣ dày [52] Croton sublyratus đƣợc sử dụng để chữa bệnh giun sán điều trị bệnh da [52] Ở Việt Nam, Croton crassifolim Tây Nguyên đƣợc dùng để điều trị bệnh đƣờng ruột [16], Croton tonkinensis trị bệnh sốt rét, bệnh đƣờng ruột [3, 13] Bên cạnh đƣợc dùng làm thuốc y học dân gian, ngƣời ta biết số thuộc chi Croton chứa độc tố Ở Madagasca có Croton hovarum loại độc, đƣợc thổ dân sử dụng đánh bắt cá, tẩm tên độc săn bắn Ở Việt Nam có Croton tiglium (cây Ba đậu) độc, dùng làm thuốc trừ sâu thảo mộc [7] 1.2 CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ (CROTON TONKINENSIS GAGNEP.) 1.2.1 Thực vật học Cây Khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học Croton tonkinensis Gagnep thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [1, 3] Cây mọc hoang dại nhiều nơi miền Bắc Việt Nam nên đƣợc gọi với nhiều tên khác nhƣ Cổ sâm, Sâm nam, vùng Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc nhân dân gọi Kẻ Hình 1: Cây Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Khổ sâm Bắc Bộ nhỏ, cao độ 0,7-1 m Lá mọc cách hay gần nhƣ mọc đối, có mọc thành vịng giả gồm 3-6 Lá hình mũi mác, mép nguyên dài 5-10 cm, rộng 1-3 cm Cả hai mặt có lơng hình khiên óng ánh (kiểu lơng nhót) nhƣng mặt dƣới nhiều mặt Khi phơi khơ mặt dƣới có màu trắng bạc, mặt có màu nâu đen Cụm hoa mọc kẽ hay đầu cành, lƣỡng tính chất đƣợc phân lập từ Saxifraga montana [29] Đây lần hợp chất đƣợc phân lập từ chi Croton 4.5PHÂN TÍCH HPLC MẪU CHIẾT MEOH CÀNH NHỎ CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ Sử dụng phƣơng pháp định tính định lƣợng HPLC [14] để phân tích định lƣợng chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat (II) mẫu chiết MeOH cành nhỏ Khổ sâm Bắc Bộ Phân tích định lƣợng HPLC đƣợc thực ba lần cho mẫu phân tích λ 240 nm Sắc ký đồ HPLC mẫu MeOH cành nhỏ Khổ sâm Bắc Bộ đƣợc đƣa Hình Sắc ký đồ HPLC chất ent-7βhydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat (II) đƣợc đƣa Hình Nồng độ chất (II) dung dịch đƣợc xác định Bảng Nồng độ chất II dung dịch đƣợc xác định (Bảng 6) Bảng 6: Nồng độ chất II dung dịch STT Nồng độ (μg/ml) 44,54 42,70 44,03 Trung bình 43,76 Do hàm lƣợng chất II cành nhỏ Khổ sâm Bắc Bộ đƣợc xác định là: (43,76 μg/ml  20 ml)/2,9865 = 293,05 μg/g Hình 3: Sắc ký đồ RP-HPLC mẫu chiết MeOH cành nhỏ Khổ sâm Bắc Bộ (DAD: λ = 210 nm 240 nm) DAD1 A, Sig=210,8 Ref=560,100 (PTS-2010\53STA202.D) II mAU 500 mAU 10 15 20 DAD1 B, Sig=240,8 Ref=560,100 (PTS-2010\53STA202.D) 25 30 35 40 45 25 30 35 40 45 25 30 35 40 45 II 1000 0 mAU 10 15 20 DAD1 C, Sig=254,8 Ref=560,100 (PTS-2010\53STA202.D) II 10 15 20 DAD1 D, Sig=360,8 Ref=560,100 (PTS-2010\53STA202.D) II 500 0 mAU -20 10 15 20 25 30 35 40 Hình 4: Sắc ký đồ RP-HPLC chất II (ở thời gian lƣu 23,907 phút) (DAD1 A: λ = 210 nm, DAD1 B: λ = 240 nm, DAD1 C: λ = 254 nm, DAD1 D: λ = 360 nm) 45 KẾT LUẬN Luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu phân bố hợp chất ent-kauran ditecpenoit Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)” thực nghiên cứu phân lập sắc ký xác định cấu trúc hợp chất ent-kauran ditecpenoit thành phần khác có cành Khổ sâm Bắc Bộ thu đƣợc kết nghiên cứu sau: Đã xây dựng đƣợc quy trình chiết để phân bố hợp chất hữu từ cành nhỏ Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) theo độ phân cực tăng dần vào phần chiết n-hexan (CTH, hiệu suất chiết 1,25 % so với lƣợng nguyên liệu khô), điclometan (CTD, 0,47%), etyl axetat (CTE, 0,05%) nƣớc (CTW, 0,63%) Đã phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) phần chiết nhận đƣợc để xác định điều kiện sắc ký định tính phần chiết hệ dung mơi thích hợp cho phân tách sắc ký cột phần chiết Bằng kỹ thuật sắc ký điều chế phân lập đƣợc hợp chất từ phần chiết (CTH, CTD, CTE CTW) cành nhỏ Khổ sâm Bắc Bộ Đã xác định đƣợc cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập chủ yếu phƣơng pháp phổ (EI-MS, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT HMBC) Trong số thành phần đƣợc phân lập có hai ent-kauran ditecpenoit ent7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat (chất II) ent-1α-acetoxy-7β,14αdihydroxykaur-16-en-15-on (chất VII) Các hợp chất khác β-sitosterol (chất I), asperglaucid (chất III), β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (chất IV), acid acetyl aleuritonic (chất V), acid stearic (chất VI) acid glucosyringic (chất VIII) βsitosterol đƣợc nhận dạng phƣơng pháp sắc ký (TLC co-TLC) với chất chuẩn Các hợp chất dipeptid asperglaucid (III), acid stearic (VI) glucosid acid glucosyringic (VIII) chất lần đƣợc phân lập từ chi Croton Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Các hợp chất ent- kauran ditecpenoit (II VII) acid acetyl aleuritonic (III) đƣợc phân lập từ Khổ sâm Bắc Bộ Luận văn áp dụng phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) định lƣợng để xác định nồng độ hợp chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur16-en-18-yl acetat (II), ent-kauran ditecpenoit thành phần cành Khổ sâm Bắc Bộ Hàm lƣợng chất II đƣợc xác định cành nhỏ Khổ sâm Bắc Bộ 293,05 g/g TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học TP Hồ Chí Minh, 622-623, 1447 Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn (2011), “Hoạt tính gây độc tế bào ent-kauran diterpenoid từ thuốc khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Dược học, 51 (419), 24-27 Phạm Hoàng Hộ (1991), Cây cỏ Việt Nam, Mekong Printing Đỗ Tất Lợi (1996), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 1026-1027 Phạm Hồng Minh, Phạm Hồng Ngọc, Chu Đình Kính (2001), “Nghiên cứu thành phần hóa học khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep.)”, Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hóa học hữu tồn quốc lần thứ hai, Hà Nội, Việt Nam Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2002), “Phân lập nhận dạng số hợp chất triterpenoid khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep.)”, Tạp chí Dược học, 42 (12), 8-9 Phạm Thị Hồng Minh (2003): “Về thành phần hóa học hoạt chất Khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep.) họ Euphorbiaceae”, Luận án Tiến sĩ, Hà Nội Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2003), “ent-(16S)-7β-hidroxy18-axetoxykauran-15-on-một kauran-ditecpen mới, phân lập từ khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep.)”, Tạp chí Hóa học, 41(2), 104-109 Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Trần Quang Hƣng, Chu Đình Kính (2004), “Phát berbin ancaloit khổ sâm cho (Crtoton tonkinensis Gagnep., họ Euphorbiaceae)”, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học, (1), 38-42 10 Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Lan, Phạm Hữu Điền, Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Hoàng Ngọc (2007), “Nghiên cứu thành phần alkaloid khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep.) thu hái Ninh Bình”, Tuyển tập cơng trình Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hóa học hữu tồn quốc lần thứ tư, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội, 455-459 11 Phạm Hoàng Ngọc, Phạm Thị Hồng Minh (1996), “Phân lập alcaloid khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep.), Tạp chí Dược học, 36 (7), 15-17 12 Phạm Hoàng Ngọc, Lê Mai Hƣơng, Phạm Thị Hồng Minh, Đỗ Hữu Nghị, Chu Đình Kính (2004), “Góp phần nghiên cứu số tác dụng sinh học khả gây độc tế bào chất phân lập đƣợc từ khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep.) Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 44 (337), 25-27 13 Trƣơng Văn Nhƣ (1992), “Nghiên cứu Khổ sâm cho (Croton tonkinensis) đánh giá tác dụng kí sinh trùng sốt rét phƣơng pháp thực nghiệm”, Luận văn PTS khoa học y dược, Hà Nội 14 Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn (2011), “Xác định hoạt chất ent-kauran ditecpenoit Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí Dược học, 51 (8), 29-33 15 Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hƣớng, Phan Minh Giang, Taylor W C (1999), “Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ Khổ sâm cho Croton tonkinensis Gagnep., họ Euphorbiaceae”, Tạp chí Hóa Học, 37 (4), 1-2 16 Phan Tống Sơn, Lê Huyền Trâm, Phan Minh Giang (2002), “Đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Hóa học, 40, 53-57 17 Nguyễn Nghĩa Thìn (1995), “Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae Juss) hệ thực vật Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 17 (4), 7-30 18 Bế Thị Thuấn, Trƣơng Văn Nhƣ, Nguyễn Duy Khang (1991), “Góp phần nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch chiết khổ sâm số vi khuẩn”, Tạp chí Dược học, 31 (1), 16-17 19 Bế Thị Thuấn, Trƣơng Văn Nhƣ (1991), “Nghiên cứu thành phần hóa học khổ sâm thăm dò tác dụng ký sinh trùng sốt rét thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 31 (5), 11-12 20 Phƣơng Thiện Thƣơng, Đào Trọng Tuấn, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi (2011), “Tổng quan nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Khổ sâm cho lá”, Tạp chí Dược liệu, 16 (1+2), 9-19 Tiếng Anh 21 Bandara B M R., Wimalasiri W R (1988), “Diterpene alcohol from Croton lacciferus”, Phytochemistry, 27 (1), 225-226 22 Bandara B M R., Wimalasiri W R., Macleod K Macleod (1988), “Entkauranes and oleananes from Croton lacciferus”, Phytochemistry, 27 (3), 869-871 23 Carpenter R C., Sotheeswaran S., Urais M., Sultabawa C., Ternai B (1980), “13C-NMR studies of some lupone and taraxerane triterpens”, Magnetic Resonance in Chemistry, 14, 462-465 24 Chen W., Yang X D., Zhao J F., Yang J H., Zhang H B., Li Z Y., Li L (2006), “Three new, 1-oxygenated ent-8,9-secokaurane diterpenes from Croton kongensis”, Helvetica Chimica Acta, 89, 537-541 25 Dao T T., Le T V T., Nguyen P H., Pham T T, Pham T H M, Woo E R., Lee K Y., Oh W K (2010), “SIRT1 inhibitory diterpenoids from the Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis”, Planta Med., 76, 1011-1014 26 Dao T T., Lee K Y., Jeong H M., Nguyen P H., Tran T L., Phuong T T., Nguyen B T., Oh W K (2011), “Ent-kaurane diterpenoids from Croton tonkinensis stimulate osteoblast differentiation”, J Nat Prod., http://dx.doi.org/10.1021/np200667fl 27 Demuner A J., L C de A Barbosa, J C Nascimento, Vieira J J., M S dos Santo (2003), Isolamento e avaliaỗóo da actividade nematicida de constituintes quớmicos de Mucuna cinerea Contra Medoidogyne incognita E Heterodera glycines”, Quim Nova, 26 (3), 335-339 28 Kuo P C., Shen Y C., Yang M L., Wang S H., T D Thang, N X Dung, P C Chiang, K H Lee, E J Lee and T S Wu (2007), “Crotonkinis Α and B and related diterpenoids from Croton tonkinensis as antiinflammatory and antitumor agents”, J Nat Prod., 70, 1906-1909 29 Liu J X., Di D L., Shi Y P (2008), “Diversity of chemical constituents from Saxifraga montana H.”, J Chinese Chemical Society, 55, 663670 30 Lu H., Hu J., Zhang L X., Tan R X (1999), “Bioactive constituents from Pteris multifida”, Planta Med., 65, 586-587 31 Luna E., Mai A., Calvanese V., Altucci L., Neiva P L., et al Salermide (2009), “Α Sirtuin inhibitor with a strong cancer-specific proapototic effeect”, Oncogene, 28, 781-791 32 Morales A., Perez P., Mendoza R., Compagnone R., Suarez A I., F., Arvelo, Ramirez J L., Castro I G (2005), “Cytotoxic and propoptotic activity of ent-16β,17α-dihydroxykaurane on human mammary carcinoma cell line MCF-7”, Cancer Letters, 218, 109-116 33 Murillo R M., Jakupovic J., Rivera J., Castro V H (2001), “Diterpens and other constituents from Croton draco (Euphorbiaceae)”, Revista de Biologia Tropical, 49 (1), 259-264 34 Ngamrojnavanich N., Sirimongkon S., Roengsumran S., Petsom A., Kamimura H (2003), “Inhibition of Na +, K+-ATPase activity by (-)ent-kaur-16-en-19-oic acid and its derivatives”, Planta Med., 69, 555556 35 Peres L P., Monache F D., Guzes A B., Pizzolah M G., Yunes R A (1997), “Chemical composition and antimicrobial activity of Croton urucuranar Barkon., Euphorbiaceae’’ J Ethnopharm., 56, 223-226 36 Pettit G R (1996), “Progress in the discovery of biosynthetic anticancer drugs”, J Nat Prod., 59 (8), 812-821 37 Pham T H M., Pham H N., D N Quang, Hashimoto T., Takaoka S., Asakawa Y (2003), “Α novel ent-kaurane diterpenoid from the Croton tonkinensis Gagnep.”, Chem Pharm Bull., 51 (5), 590-591 38 Pham T H M., Pham H N., Taylor W C., Nguyen M C (2004), “Α new ent-kaurane diterpenoid from Croton tonkinensis leaves”, Fitoterapia, 75, 552-556 39 Phan T S., Phan M G., Taylor W C (2000), “An ent-kaurane diterpenoid from Croton tonkinensis”, Australian Journal of Chemistry, 53, 10031005 40 Phan M G., Phan T S, Taylor W C (2000), “Α new diterpenoid with antimalarial activity from Croton tonkinensis Gagnep of Viet Nam”, The tenth Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and other Natural Products (ASOMPS X), Dhaka, Bangladesh, 18-23/11/2000, Oral presentation, OP 97, Symposium paper, 162 41 Phan M G., Jin H Z., Phan T S., Lee J H., Hong Y S., Lee J J (2003), “Ent-kaurane diterpenoids from Croton tonkinensis inhibit LPSinduced NF-κB activation and NO production”, J Nat Prod., 66, 1217-1220 42 Phan M G., Lee J J., Taylor W C., Phan T S (2003), “Chemical constituents and theurapeutic potential of the Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis Gagnep (Euphorbiaceae)”, The eleventh Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and other Natural Products (ASOMPS XI), Kunming, China, 26-30/10/2003, Oral presentation, Symposium paper, 162-164 43 Phan M G., Lee J J., Taylor W C., Phan T S (2003), “Chemical constituents and biological activity of Croton tonkinensis Gagnep (Euphorbiaceae)”, Proceedings of the 8th Eurasia conference on chemical sciences (EuAsC2S-8), Ha Noi, Viet Nam, 21-24/10/2003, 350 44 Phan M G., Jin H Z., Lee J J (2003), “ent-Kaurane diterpenoids from Croton tonkinensis inhibit LPS-induced transcription factor NF-κB activation and NO production”, Proceedings of the 52th Annual convention of the Pharmaceutical Society of Korea, Daegu, Korea, 17-18/4/2003, Proceedings paper 120 45 Phan M G., Phan T S., Lee J J., Otsuka H (2004), “ Ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep.”, The 51th (year 2004) Annual Meeting of the Japanese Society of Pharmacognosy, Kobe, Japan, 9-10/9/2004, Poster presentation, Proceedings paper, 105 46 Phan M G., Phan T S (2004), “Two long chain alkyl alcohols from the leaves of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae”, Tạp chí Hóa học, 42 (1), 132 47 Phan M G., Lee J J., Phan T S (2004), “Flavonoid glucosides from the leaves of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae”, Tạp chí Hóa học, 42 (1), 125-128 48 Phan M G., Phan T S., Lee J J., Otsuka H (2004), “Four ent-kauranetype diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep.”, Chem Pharm Bull., 52 (7), 879-882 49 Phan M G., Phan T S., Hamada Y., Otsuka H (2005), “Cytotoxic diterpenoids from Vietnamese medical plant Croton tonkinensis Gagnep.”, Chem Pharm Bull., 53 (3), 296-300 50 Phan M G., Phan T S., Matsunami K., Otsuka H (2006), “Antistaphylococal activity of ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis”, J Nat Med., 60, 93-95 51 Phuong T T., Dao T T., Pham T H M., Nguyen P H., Le T V T., Lee K Y., Oh W K (2009), “Crotonkinensins Α and B, diterpenoids from the Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis”, J Nat Prod., 72, 2040-2042 52 Salatino A., Salatino M L F., Negri G (2007), “Traditional uses, chemistry and pharmacology of Croton species (Euphorbiaceae)”, Journal of the Brazilian Chemical Society, 18 (1), http://dx.doi.org/10.1590/S0103-50532007000100002 53 Viswanadh G S., Ramaiah P A., Loatsch H., Maskey R (2006), “Chemical constituents of the heart wood and bark of Homonoia riparia”, J Trop Med Plants, (2), 267-273 54 Yang X D., Chen W., Zhao J F., Yang L J., Zhang H B., Li L (2009), “Ent-kaurane diterpenes and phenolic compounds from Croton kongensis (Euphorbiaceae)”, Biochemical Systematic and Ecology, 37, 237-240 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN .3 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CROTON (HỌ EUPHORBIACEAE) .3 1.2 CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ (CROTON TONKINENSIS GAGNEP.) 1.2.1 Thực vật học 1.2.2 Tác dụng dƣợc lý Khổ sâm Bắc Bộ [1, 4] 1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 1.3.1 Các ent-kauran ditecpenoit từ chi Croton .6 1.3.2 Các kauran ditecpenoit từ Khổ sâm Bắc Bộ .7 1.3.3 Các flavonoit 12 1.3.4 Các ancaloit 13 1.3.5 Các thành phần hóa học khác 15 1.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ .16 1.4.1 Tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét .16 1.4.2 Tác dụng kháng vi sinh vật 16 1.4.3 Tác dụng chống viêm 17 1.4.4 Tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thƣ 17 Chƣơng 2:NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN .20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Phƣơng pháp chiết phân tách hợp chất từ nguyên liệu thực vật .20 2.2.2 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách phân lập sắc ký 21 2.2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc (các phƣơng pháp phổ) 22 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM .23 3.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 23 3.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 23 3.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KHỔ SÂM 24 3.4 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 25 3.4.1 Phân tích phần chiết n-hexan (CTH) 25 3.4.2 Phân tích phần chiết điclometan (CTD) .26 3.4.3 Phân tích phần chiết etyl axetat (CTE) 28 3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 28 3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (CTH) 28 3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (CTD) .30 3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (CTE) .31 3.5.4 Phân tách phần chiết nƣớc (CTW1) 31 3.6 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 33 3.7 PHÂN TÍCH HPLC MẪU CHIẾT MEOH CÀNH NHỎ CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 37 3.7.1 Nguyên liệu 37 3.7.2 Chuẩn bị mẫu phân tích: điều chế phần chiết metanol 37 3.7.3 Điều kiện phân tích sắc ký HPLC 37 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .38 4.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KHỔ SÂM 38 4.3 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÀNH KHỔ SÂM BẮC BỘ .41 4.3.1 Phân tách phần chiết n-hexan (CTH) 41 4.3.2 Phân tách phần chiết điclometan (CTD) 41 4.3.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (CTE) 41 4.3.4 Phân tách phần chiết nƣớc (CTW) 42 4.4 CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 44 4.5 PHÂN TÍCH HPLC MẪU CHIẾT MEOH CÀNH NHỎ CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 52 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 MỤC LỤC 64 ... THANH NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CÁC HỢP CHẤT ENT- KAURAN DITECPENOIT TRONG CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ (CROTON TONKINENSIS GAGNEP. , EUPHORBIACEAE) Chuyên ngành : Hóa học hữu Mã số 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA... tổng hợp chúng Tiếp theo nghiên cứu thành phần từ Luận văn Thạc sĩ 2011 Khổ sâm Bắc Bộ mở rộng nghiên cứu phân lập hợp chất từ cành Khổ sâm Bắc Bộ qua đánh giá đƣợc xác phân bố hàm lƣợng ent- kauran. .. ent- kauran ditecpenoit Khổ sâm Bắc Bộ Luận văn nghiên cứu qui trình chiết, phân tách phân lập sắc ký để đánh giá phân bố hợp chất ent- kauran ditecpenoit thành phần khác cành Khổ sâm Bắc Bộ xác định