Nghiên cứu hoá học một số hoạt chất có tác dụng chống oxy hoá và chống nhiễm khuẩn từ cây hy thiêm và cây bòn bọt

1 đại học quốc gia hà nội trờng đại học khoa học tự nhiên Lê thị kiều nhi Nghiên cứu hóa học số hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa chống nhiễm khuẩn từ hy thiêm (siegesbeckia orientalis l.) bòn bọt (glochidion eriocarpum champ.) Việt Nam Chuyên ngành: Hoá hữu Mà số: 1.04.02 ln ¸n tiÕn sÜ hãa häc Ngêi híng dÉn Khoa học: GS TSKH Phan Tống Sơn TS Nguyễn Văn Đậu Hà Nội - 2001 Đặt vấn đề Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới châu á, có khí hậu nhiệt đới gió mùa Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 15-270C, lợng ma lớn (trung bình 1200-2800mm), độ ẩm tơng đối cao (trên 80%) [5] Điều kiện khí hậu thuận lợi cho phát triển loài thực vật nói chung dợc liệu nói riêng Theo số liệu gần đây, hệ thực vật Việt Nam đà có khoảng 10.500 loài đợc thống kê [8], có khoảng 3.200 loài đợc sử dụng y học dân tộc [4] Theo dự đoán nhà khoa học, hệ thực vật Việt Nam có lẽ gồm khoảng 12.000 loài, nh÷ng hƯ thùc vËt phong phó nhÊt thÕ giíi [8] Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đà đóng vai trò quan trọng đời sống ngời Chúng đợc dùng làm thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hơng liệu mỹ phẩm Đặc biệt lĩnh vực làm thuốc, nguồn dợc liệu thiên nhiên phong phú đa dạng đà cung cấp cho ngành dợc nớc khối lợng nguyên liệu lớn để chữa bệnh nh xuất có giá trị kinh tế cao Về lâu dài, phát triển dợc phẩm mới, sản phẩm thiên nhiên có vai trò quan trọng, nhiều chất chất dẫn đờng cho việc tổng hợp dợc phẩm mới, dùng làm chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lý dợc lý học ngời Trong thập kỷ qua việc nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học loài cỏ nớc ta có nhiều hạn chế, cha đáp ứng đợc yêu cầu điều tra để nhằm định hớng sử dụng phát triển nguồn tài nguyên thực vật cách hợp lý có hiệu Tuy nhiên, nhà khoa học nghiên cứu, tìm kiếm loài có giá trị làm thuốc chữa bệnh hàng ngày, hàng giờ, nguồn tài nguyên bị nhanh chóng số lợng tính đa dạng sinh häc Mét nhãm chuyªn gia vỊ thùc vËt häc cđa Quỹ Quốc tế Bảo vệ thiên nhiên (WWB) đà dự đoán có khoảng 60.000 loài thực vật (khoảng 1/4 tổng số loài giới nay) bị tuyệt chủng vào năm 2050, xu hớng tác động vào thiên nhiên nh tiếp tục Đến đà có 18.000 loài đợc đa vào "Sách đỏ " nhiều nớc để có biện pháp bảo vệ đặc biệt [8] Việt Nam đà xuất "Sách đỏ Việt Nam", Phần thực vật, với 356 loài thực vật thuộc loại quý cần đợc bảo vệ [12] Sự nhanh chóng tính đa dạng sinh học (gồm thực vật, động vật vi sinh vật) thực thảm hoạ loài ngời Xu chung nhân loại trở lại sử dụng sản phẩm từ thiên nhiên Vì vậy, việc điều tra thuốc khảo sát chúng mặt hoá thực vật có ý nghĩa to lớn Nhiều hoạt tính sinh học quí báu hợp chất quen biết từ lâu lại đợc phát Trong nhiều cỏ phổ biến bình thờng ngời ta đă tìm đợc hoạt chất có giá trị Nhiều thuốc thuốc dân gian đợc truyền từ đời sang đời khác, đợc làm sáng tỏ chế tác dụng chữa bệnh nhờ kết nghiên cứu hoá thực vật hoạt tính sinh học Nhờ mà chúng đợc sử dụng cách hợp lý hơn, có hiệu Luận án nằm hớng có nhiệm vụ nghiên cứu thành phần hoá học bớc đầu khảo sát số hoạt tính sinh học số chế phẩm thu đợc từ số loài nớc ta, đà đợc sử dụng lâu đời phổ biến nhân dân để chữa bệnh Để thực nhiệm vụ đề chọn đối tợng để nghiên cứu luận án hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ., Euphorbiaceae).Đây hai mọc hoang dại phổ biến nớc ta đợc y học dân gian sử dụng có hiệu để chữa số bệnh viêm nhiễm nh mụn nhọt, lở ngứa, vết rắn cắn, bỏng, tiêu chảy, lỵ, viêm khớp, , bệnh có liên quan tới chủng vi khuẩn có khả gây bệnh, nh thờng liên quan tới sản sinh nhiều gốc tự tổ chức (mô, tế bào , , ) Những nội dung luận án là: *Tìm phơng pháp thích hợp để thu nhận phân đoạn giàu polyphenol (bao gồm flavonoit) tecpenoit cao (di - tritecpenoit) lớp hoạt chất đợc quan tâm * Phân tách hỗn hợp polyphenol tecpenoit cao nhằm phân lập hợp chất tinh khiết * Khảo sát cấu trúc hợp chất nhận đợc * Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật khả chống oxi hoá in vitro số phần chiết hợp chất tinh khiết nhận đợc Các kết nghiên cứu nhằm góp phần nâng cao hiểu biết hoá thực vật hai loài thuốc dân gian đợc nghiên cứu tạo sở khoa học cho việc ứng dụng thực tiễn hai loài Chơng tổng quan 1.1 Tổng quan loài đợc nghiên cứu luận án 1.1.1 Cây hy thiªm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) 1.1.1.1 Thùc vËt häc [8], [14] Theo Phạm Hoàng Hộ [8] có hai loài Siegesbeckia (Asteraceae) mäc ë níc ta: Siegesbeckia integrifolia Gagn (Hy thiêm nguyên) Siegesbeckia orientalis L (Hy thiêm) Cho ®Õn chØ cã c©y Siegesbeckia orientalis L., tøc Hy thiêm (các tên gọi khác: cỏ đĩ, cứt lợn, cúc dính, chó đẻ, cỏ bà a, v.v ), đợc y học dân gian dùng để chữa bệnh Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) cỏ sống năm, cao chừng 40cm đến 1m, có nhiều cành, có lông tuyến Lá mọc đối cuống ngắn, hình ba cạnh hay thuôn hình trám, đầu nhọn, phía cuống thót lại, mép có ca, mặt dới có lông, dài 4-10cm, rộng 3-6cm Cụm hoa hình đầu, màu vàng, cuống có lông tuyến dính Có hai loại bắc không nhau: bắc hình thìa dài 9-10mm, mọc toả thành hình sao, có lông dính, bắc dài 5mm hợp thành tổng bao Quả bế, màu đen, hình trứng Cây hoa vào tháng - 5, đậu vào tháng - 10 Thu hái trớc hoa, đem phơi khô dùng làm thuốc nớc ta, nguồn hy thiêm phong phú mọc khắp nơi, rải rác từ miền núi, trung du đến vùng đồng bằng, trừ Tây Nguyên 1.1.1.2 Nghiên cứu hoá học loài Siegesbeckia Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) số loài Siegesbeckia khác đợc phân bố rộng rÃi vùng nhiệt đới giới thuốc đợc dùng y học dân gian số nớc nh Trung Quốc, Nhật Bản, bán đảo Triều Tiên, Việt Nam, , nên đà đợc quan tâm nghiên cứu hoá học J Pudles, A Diara E Lederer [74] ph©n lËp tõ Siegesbeckia orientalis cđa Madagaskar mét -D-glucozit, C26H44O8, đề nghị đặt tên cho chất darutozit Chất đà đợc Auffray [Auffray, Bull Soc Med de l’Il Maurice (1988), x [74],[100] ph©n lËp đợc từ S orientalis gọi tên darutin Darutozit ngậm phân tử C2H5OH có đnc 2500C (kết tinh từ etanol tuyệt đối) có đnc 2300C ngậm mét ph©n tư H2 O (kÕt tinh tõ 50% etanol) Khi bị thuỷ phân emulsin men elateraza darutozit cho glucozơ ditecpen ancol ba vòng có ba nhãm hidroxi, 20 34 C H O , ®nc 1681700C (kÕt tinh tõ benzen råi etanol) J Pudles, A Diara E Lederer [74] gọi tên ditecpen ancol lµ darutigenol J Pudles, A Diara vµ céng sù [100], [101] đà khảo sát chủ yếu phơng pháp hoá học đa cấu trúc darutigenol OH 17 CH CH OH 20 H HO H HO 19 16 14 H 18 1b C 11 OH 15 H CH2OH Darutigenol sau ®ã đà đợc tìm thấy dới dạng aglycon thiên nhiên, Palafoxia arida [43] Cấu trúc darutigenol đợc khẳng định thêm phổ khối lợng cộng hởng từ proton [43] Trong công trình nghiên cứu nêu trên, cấu hình C-15 darutigenol cha xác định Vấn đề đà đợc E Wenkert cộng [89] giải dựa vào khảo sát phổ cộng hởng từ hạt nhân 13 C; darutigenol có cấu hình C(15)R đợc biểu diễn công thức 1b Dựa chuyển dịch tÝn hiÖu cacbon, J H Kim, K D Han, K Yamasaki O Tanaka [55] đà chứng minh đợc darutozit liên kết D- glucozyl phải định vị nhãm 3-equatorial hidroxi cđa aglycon darutigenol vµ nhãm hidroxi nµy có cấu hình R, nhóm hidroxi C-15 nh Diara ngời khác [101] đà dự doán Vậy cấu trúc darutozit phải đợc biểu diƠn bëi c«ng thøc HOH2C OH C 15 H CH2OH GlcO HOH2C H O2C C CH2 Me CH2 O O Glc= -D-glucopyranozyl Trong mét b»ng ph¸t minh, P Fabre [33] đà đa quy trình chiÕt darutozit tõ Siegesbeckia orientalis b»ng butanol S S Suh J S Shin [83] đà phân lập đợc từ Siegesbeckia orientalis Triều Tiên phytosterol stigmasterol -sitosterol Từ toàn Siegesbeckia orientalis khô, T H Yang cộng [96] đà phân lập đợc 3, 7-dimetylquercetin hai tecpenoit không rõ cấu trúc 3,7-dimetylquercetin chất flavonoit đợc phân lËp tõ S orientalis Tõ S orientalis K S Rybalko cộng [75] đà phân lập đợc sesquitecpen lacton đặt tên cho orientin Cũng theo tác giả orientin có cấu trúc cha đợc xác định dứt khoát R N Baruah cộng 18],[19], đà phân lập đợc từ S orientalis ba lacton míi thc nhãm melampolid vµ chøng minh cÊu tróc chúng, chất orientalid 4, lacton vµ O R=OH, R'= 14 CHO OR" OR' 10 , R"= Ac O 13 R=H, , R"= Ac R'= 11 15 CH2R O 12 O O R=OH, R'= , R"= Me R N Baruah vµ cộng {18} đà phân lập đợc darutigenol (1b) từ phân đoạn phân cực phần chiÕt S orientalis C Zdero, F Bohlmann vµ céng sù [98] đà phân lập đợc từ phần mặt đất S orientalis đợc thu hái úc chín germacranolid 7a-7e 8a-8d, melampolid 9a-9c, ent-pimaren 10a-10c, bên cạnh nhiều chất đà biết khác Mới D Guo cộng [37] phân lập từ phần mặt đất S orientalis axit cacboxylic thuộc dÃy kauran đặt tên cho chúng axit siegesesteric (axit ent-17-axetoxy-18-isobutyryloxy-16-kauran-19-oic) vµ axit siegesetheric (axit ent-17-etoxy -16-(-)-kauran-19-oic) J Xiong vµ cộng [91] đà phân lập đợc từ Siegesbeckia orientalis hai ditecpenoit mới, đợc đặt tên orientalin A (ent-15-axetoxi -2,16,19trihidroxipimar-8(14)-en) vµ orientalin B (ent-16-axetoxi -2,15,19- trihidroxipimar-8(14)-en) R OR 10 O R OR R 14 13 R 11 15 O 7a 7b iBu Meacr R1 R2 R3 OH OH Meacr = Methacryl = Me Me O O 7c iBu H CH2OH 7d iBu H CHO 7e iBu OH CH2OH R1 R2 R3 8a H iBu H 8b OH iBu H O 8c OH H H 8d H iBu OH CH2=C CO CH3 17 14 CHO 10 12 11 R OR 13 X R 15 OH R2 H8 14 16 OH H 9a R1 15 10 5 OH 13 20 1819 11 O 9b OAc OH iBu iBu 12 O 9c H iBu X R 10a OH, H H 10b =O H 10c =O OH Mét loµi Siegesbeckia khác đợc quan tâm nghiên cứu nhiều hoá học hoạt tính sinh học, Siegesbeckia pubescens Makino Nhật Bản phần mặt đất đợc gọi "Kiren" đợc dùng để chữa bệnh liệt chi [107] làm vị thuốc có hoạt tính chống oxi hoá [82] bán đảo Triều Tiên, đợc dùng y học dân gian để chữa bệnh cao huyết áp [53] Trung Quốc Siegesbeckia pubescens đợc dùng nh số loài Siegesbeckia khác y học cổ truyền để chữa viêm khớp, thấp khớp, cao huyết áp, sốt rét, suy nhợc thần kinh rắn cắn [92] L.K.Woo cộng [90] đà chứng minh có mặt ancaloit Siegesbeckia pubescens Từ Siegesbeckia pubescens, F.Yamamoto cộng [94] đà phân lập đợc melampolid 11 đợc dùng làm thuốc giảm đau thuốc chống viêm CH=O 1OAc 9OR R = (E)- , (Z)- MeCH : CMeCO CH2OH O CH2 O 11 L.Canonica, B.Rindone, C.Scolastico, K.D.Han J.H.Kim [25] đà phân lập ®ỵc tõ Siegesbeckia pubescens mét hỵp chÊt C20H34O4, ®nc 192- 1930C, vµ cho r»ng chÊt nµy cã cÊu tróc cđa mét dÉn xt daruten (pimaran) víi c¸c nhãm hidroxi ë C-6, C-15, C-16 vµ C-18 (cịng xem [39], [41]) T.Murakami cộng [107] đà phân lập lại hợp chất ditecpenoit L.Canonica cộng [25] với đnc 190-1920C đà đặt tên cho chất kirenol T.Murakami cộng [107] đà thiÕu sãt cđa cÊu tróc L.Canonica vµ céng sù [25] đà gán cho chất Bằng nghiên cứu chuyển hoá dựa kiện phổ H NMR, cấu trúc kirenol đà đợc xác định pimar-8(14)-en-2,15,16,19-tetraol (12) [107] B3 Mặc dù B3 cho mét vƯt ph©n tÝch TLC víi silica gel, nhng qua phân tích HPLC với cột pha ngợc (ODS analytical) đà thấy B3 hỗn hợp nhiều chÊt, víi chđ u lµ hai chÊt cã thêi gian lu gần với (21,8 27 phút) (xem Phần phụ lục) B3 đà đợc phân tách điều chế b»ng HPLC trªn cét Protosil 120-15 C18 AQ 15,0 m, với pha động hỗn hợp axetonitril-nớc detector diode array cho hai hợp phần (xem Phần phụ lục) Khảo sát phổ hai chất (xem Phần phụ lục) cho thấy chúng flavonol glycozit (max 215, 275, 357 nm) mà phần đờng rhamnozơ [1H-NMR, , ppm: 7,50 7,80 (các H aromat thuộc vòng C); 6,60 6,90 (các H aromat thuộc vòng A); 4,50 (H- anome -rhamnozơ); 3,00 4,00 (các H rhamnozơ)] (xem Phần phụ lục) Tuy nhiên, để xác định cấu trúc hai chất cần có thêm thông tin bổ sung khác B4 B4 đợc kết tinh lại clorofoc: metanol (9:1, v/v) dới dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; đnc 211 - 2150C Phổ IR B4 (xem Phần phụ lục) có dải đặc trng cho ancol (3359 cm-1, br), este cña axit benzoic (1716 cm -1, C = 0; 1600 1450 cm-1 (nhân phenyl)), nối đôi cacbon - cacbon (1670cm-1) Các đặc điểm sắc ký cột sắc ký lớp mỏng đà cho phép dự đoán B4 tritecpen glycozit Phản ứng thuỷ phân B4 dung dịch axit clohidric etanol đà cho aglycon B4 sản phẩm vô định hình, phổ IR dải đặc trng cho ancol (3368 cm-1, br) dải cacbonyl este axit benzoic (1716 cm-1) Phần đờng nhận đợc qua thuỷ phân B4 hỗn hợp glucozơ arabinozơ, điều đợc chứng minh sắc ký giấy xenlulozơ, với hệ dung môi n-butanol-etanol nớc (4:1:5) thuốc anilin-diphenylamin-axit photphoric axeton [109] Phản ứng peaxetyl hoá B4 nh ph¶n øng peaxetyl aglycon cđa B4 b»ng anhydrit axetic pyridin cho dẫn xuất peaxetyl tơng ứng; phổ IR sản phẩm dải hấp thụ nhóm hidroxyl không xuất hiện; bên cạnh dải hấp thụ cacbonyl nhóm benzoyl (1716 cm -1) xuất thêm dải hấp thụ nhóm axetyl (1736 cm-1) Dựa khảo sát phổ 1D NMR (1H NMR, 13C NMR, DEPT) vµ 2D NMR (1H-1H COSY, HMQC, HMBC), so s¸nh víi c¸c oleanan tritecpenoit đà đợc công bố tài liệu tham khảo, nh [79], [80], đà đề nghị cÊu tróc cho B4 lµ 3 [O--D-glucopyranosyl-(13)-O--Larabinopyranosyl) oxy]-22-benzoyloxy-olean-12-en-16-28-diol (41) ( chi tiết phổ NMR: xem chơng ) Trên phỉ EI MS cđa B4 xt hiƯn c¸c pic ion m¶nh ë m/z 370, m/z 369, m/z 368, cã thĨ kết phá mảnh Diels-Alder đảo (m/z 370), tợng thờng gặp hợp chất không no kiểu dÃy oleanan [93], phân cắt tiếp hai nguyên tử hidro OC CH2OH OH O m/z 370 Theo nghiên cứu tài liệu chúng tôi, 41 dẫn xuất oleanan mới, đợc phân lập lần 30 29 20 25 O 5" 6"' 5"' '1"' HO CH2 HO O 4" 1" O 3"' 2"'H HO 4" HO 115 108 23 O 3" 12 11 26 2" H 19 H 21 22 18 OCO 1728 13 16 CH 2OH 14 27 1' 2' 3' 4' 6' 5' OH 24 H OH OH B4 (41) 4.2.6 Kết luận Đà khảo sát định tính thành phần polyphenol phận khác bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.,Euphorbiaceae) mọc Vĩnh Phú Bắc Thái Bằng cách sử dụng kết hợp phơng pháp sắc ký (MPLC, FC, CC), đÃ) phân lập đợc từ cành non axit galic, etyl galat hai flavonol rhamnozit Đây lần polyphenol đợc phân lập từ loài Glochidion eriocarpum Champ Đà phân lập đợc dẫn xuất tritecpenoit có khung oleanan đề xuất cấu trúc cho chất dựa khảo sát phổ 4.3 Khảo sát số hoạt tÝnh sinh häc Trong y häc d©n gian cđa ViƯt Nam hy thiêm đợc dùng phổ biến từ lâu đời để chữa bệnh nh viêm khớp, lở ngứa, mụn nhọt Theo kinh nghiệm dân gian, bòn bọt dùng chữa rắn cắn, điều trị tiêu chảy, chữa lỵ Bệnh viện Vĩnh Yên Viện Bỏng Quốc gia đà dùng cao bòn bọt chữa bỏng có hiệu cao Những tác dụng chữa bệnh hai đợc nghiên cứu luận án gợi việc nên khảo sát hoạt tính, kháng khuẩn, kháng nấm tác dụng chống oxy hoá số sản phẩm nh hợp chất từ hai 4.3.1 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Chúng đà thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết số chất tinh khiết từ hy thiêm bòn bọt với 11 chủng vi sinh vật ®iĨn h×nh, gåm chđng vi khn gram (+): Bacillus pumilus NCTC 8241, Bacillus cereus ATCC 9946, Bacillus subtilis ATCC 6633, Sarcina lutea ATCC 9341, Staphylococcus aureus ATCC 12228; chđng vi khn gram ©m (-): Salmonella typhi DT 220, Shigella flexneri DT 112, Pseudomonas aeruginosa VM 201, Proteus mirabilis BV 108, Escherichia coli DT 119 B 14, vµ mét chđng vi nÊm Candida albicans ATCC 10231 4.3.1.1 Ph¬ng pháp thử Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mẫu thử đợc xác định kỹ thuật khuếch tán môi trờng đặc theo Bauer Kirby [67], [86] Các mẫu chất dạng rắn đợc hoà tan dung môi thích hợp (etanol, axeton, ) với nồng độ cho trớc Các dung dịch thử đợc tẩm vào khoanh giấy sắc ký N05 có đờng kính mm đến bÃo hoà, để bay dung môi nhiệt độ phòng thí nghiệm Các khoanh giấy tẩm chất thử đợc đặt mặt đĩa thạch dinh dỡng ®· trén nhị dÞch vi sinh vËt cã 106-107 tÕ bào/ml với tỷ lệ 1% so với môi trờng Kết đợc xác định đờng kính vùng ức chế phát triển vi sinh vật (vòng vô khuẩn) sau 18-24 nuôi cấy 370C vi khuẩn, 280C vi nấm Môi trờng dinh dỡng để nuôi cấy vi sinh vật môi trờng Muller-Hiltơn, môi trờng Sabouraud 4.3.1.2 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm sản phẩm từ hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.,Asteraceae) Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết etanol (tức O0), PE (tức O1), EtOAc(tức O2), n-butanol (tức O3)) từ hy thiêm số hợp chất tinh khiết phân lập đợc từ phần chiết đợc thử nồng độ mg/ml (hàm lợng trung bình 360 g chất/khoanh giấy), tổ Vi nấm Kháng sinh, trờng Đại học Dợc Hà Nội Kết đợc nêu bảng 4.9 Bảng 4.9 - Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết hợp chất từ hy thiêm Chủng vi khuẩn Đờng kính vòng vô khuẩn (mm) O0 O1 O2 O3 H1 H2 H3 Sta aureus Sar lutea 12,55 10,45 10,75 10,5 8,58 11,7 8,4 9,05 8,1 10,7 8,05 11,35 8,15 9,65 Bac cereus 14,9 13,25 10,95 11,15 10.5 9,15 8,8 Bac subtilis 10,1 11,5 10,35 8,1 9,05 8,3 8,35 Bac pumilus 9,05 14,5 17,00 9,3 9,2 9,8 8.55 Sh flexneri 0 0 0 S typhi 0 0 0 E coli 0 0 0 Pr mirabilis 0 0 0 Ps aeruginosa 0 0 0 Ca albicans 0 0 0 Các kết thử cho thấy phần chiết hợp chất tinh khiết H1, H2, H3 nhận đợc từ hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Arteraceae) có tác dụng ức chế chủng vi khuẩn gram (+) tác dụng ®èi víi c¸c chđng vi khn gram (-) cịng nh tác dụng kháng nấm Candida albicans Khả kháng sản phẩm hy thiêm đối víi chđng vi khn Staphylococcus aureus lµ chđng vi khn gây mủ vết thơng, vết bỏng, gây nhiễm trùng mủ da quan nội tạng, nguyên nhân khiến cho y học dân gian đà dùng để chữa lở ngứa, mụn nhọt, vết rắn cắn 4.3.1.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm sản phẩm từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.) Các phần chiết từ bòn bọt (E0, E1, E2 E3) số hợp chất phân lập đợc từ phần chiết (B2 B4) đà đợc thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nồng độ 5mg/ml (hàm lợng trung bình 450 g chất/khoanh giấy) tổ Vi nấm-Kháng sinh, trờng Đại học Dợc Hà Nội Kết đợc nêu bảng 4.10 Bảng 4.10 - Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết hợp chất từ bòn bọt E0 Đờng kính vòng vô khuẩn (mm) E1 E2 E3 B2 11,5 10,5 10,0 11,5 Sar lutea 0 0 0 Bac cereus 0 0 0 Bac subtilis 0 0 0 Bac pumilus 12,5 13,0 10,5 Sh flexneri 14,5 15,2 11 11,5 S typhi 0 0 0 E coli 0 0 0 Pr mirabilis 0 0 0 Ps aeruginosa 8,5 8,3 8,2 15,0 Ca albicans 16,2 8,5 18,5 13 19,5 Chñng vi khuÈn Sta aureus B4 Qua kết ta nhận thấy số phần chiết số hợp chất phân lập đợc từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.) có tác dụng rõ đối vói chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri đặc biệt đối víi Pseudomonsas aeruginosa –trùc khn mđ xanh Theo [7] th× Pseudomonas aeruginosa nguyên gây nhiễm khn hut báng vµ tû lƯ nhiƠm khn hut báng Pseudomonas aeruginosa gây 66,7% Ngày việc sử dụng thuốc kháng sinh rộng rÃi, không hợp lý nhiễm trùng bệnh viện đà làm tăng chủng kháng thuốc Cho đến Pseudomonas aeruginosa đà kháng lại hầu hết thuốc kháng sinh thờng dùng (với tỷ lệ cao, 62-97%) số loại thuốc kháng sinh có hiệu lực cao đợc sử dụng T¸c dơng øc chÕ kh¸ tèt víi Pseudomonas aeruginosa cđa phần chiết E0, E1, E2 chất B2 từ bòn bọt (xem bảng 4.10) sở để giải thích cho tác dụng chữa bỏng có hiệu tốt cao bòn bọt Điều gợi mở hớng sử dụng bòn bọt để chữa số bệnh gây bëi vi khn Pseudomonas aeruginosa, mét chđng vi khn kh¸ng kh¸ng sinh víi tû lƯ cao hiƯn Cịng qua kết ta nhận thấy phần chiết E0, E1, E2 đặc biệt B2 có tác dụng ức chế mạnh nấm Candida albicans 4.3.2 Thử hoạt tính chống oxy hoá Tia tử ngoại, xạ ion hoá, nhiều chất gây ô nhiễm khí chất độc ozon, , nguồn gốc biến đổi phân tử oxy peroxy hóa lipit (nguồn gốc tự ngoại sinh) Đồng thời có gốc tự nội sinh tế bào hệ miễn dịch tế bào nơi bị viêm sinh Các gốc tự nhiều đóng vai trò chủ yếu nhiều bệnh Độc tính gốc tự trình bệnh tim mạch hô hấp, nhiễm độc, ung th, bệnh hệ miễn dịch số trình viêm, đà đợc chứng minh Khả chất chống gốc tự chống sù peroxy ho¸ lipid (POL) cã nguån gèc néi sinh bị vợt qua số trạng thái bệnh lý, khả bị giảm thiểu tuổi già nên điều hợp lý dùng chất chống oxy hoá bệnh có liên quan đến gốc tự [1] Vì việc đánh giá hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) chế phẩm, hoạt chất, đóng góp nhằm làm sáng tỏ chế chữa số bệnh thuốc đà đợc sử dụng 4.3.2.1 Phơng pháp thử Quá trình POL xảy phản ứng dạng oxy hoạt động, chủ yếu gốc hydroxyl (ÃOH) oxy đơn bội (1O2 ), với chất hữu thể, chủ yếu axit béo cha no có nhiều nối đôi tổ chức màng (LH) Sản phẩm trình POL dien liên hợp, malonyl diandehit (MDA), ankan nh etan, pentan, Xác định lợng sản phẩm trình POL hình thành nhiều hay giúp đánh giá trình peroxy hoá mạnh hay yếu suy đợc tơng quan dạng oxy hoạt động chất chống oxy hoá thể đà tăng hay giảm Để xác định sản phẩm trình POL, dựa vào việc đo lợng dien liên hợp hình thành, lợng ankan, MDA sử dụng phơng pháp xác định lợng MDA hình thành trình POL để đánh giá khả chống oxy hoá mẫu thử HTCO chế phẩm (phần chiết, hợp chất tinh khiết) đợc đánh giá tỷ lệ phần trăm MDA giảm ë mÉu thư cã chøa chÕ phÈm so s¸nh với mẫu chứng không chứa chế phẩm Để xác định HTCO in vitro thông qua việc định lợng MDA hình thành trình POL tiến hành theo phơng pháp C G Blogodarov cộng [110] Nguyên tắc phơng pháp dùng gốc axit oleic Tween 80 để làm chất oxy hoá chuyển thành MDA có mặt muối sắt (II), axit ascobic oxy không khí MDA hình thành tác dụng với axit thiobacbituric tạo phức màu hồng, có hấp thụ cực đại max=532 nm Theo định luật Bughe-Lamber- Bia D = c.l. Trong đó: c: Nồng độ dung dịch mẫu (M/l) D: Mật độ quang l: Chiều dày cuvet (cm) : Hệ số tắt phân tử (M1 l cm1) Nh vậy, dựa vào biến đổi mật ®é quang cđa mÉu thư mµ ta cã thĨ nhËn định cách định tính biến đổi nồng độ MDA từ dẫn đến nhận ®Þnh vỊ HTCO cđa mÉu thư 4.3.2.2 Thư HTCO cđa sản phẩm từ hy thiêm Để đánh giá sơ HTCO phần chiết số hợp chất phân lập đợc từ hy thiêm tiến hành thử HTCO phần chiết etanol (tức O0) hy thiêm theo nồng độ khác phần chiết hỗn hợp ủ Mỗi số liệu trung bình cộng ba lần thí nghiệm Kết đợc nêu bảng 4.11 Bảng 4.11 - HTCO phần chiết etanol hy thiêm (tức O0) Mẫu Nồng độ mẫu hỗn hợp ủ (mg/ml) MËt ®é quang (D) HTCO (%) Chøng 0,1918 0,05 0,1840 0,10 0,1755 0,20 0,1029 46 0,40 0,0904 53 0,80 0,0714 63 O0 Tõ c¸c sè liƯu thực nghiệm thu đợc bảng 4.10, ta biểu diễn mối liên hệ HTCO nồng độ mẫu thử O0 hỗn hợp ủ hình 4.15 HTCO (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Nång ®é mÉu (mg/ml) Hình 4.15 - Sự thay đổi HTCO theo nồng độ chất thử hỗn hợp ủ phần chiết etanol hy thiêm (O0) Qua kết nhận thấy nồng độ 0,2 mg/ml chất thử hỗn hợp ủ, phần chiết etanol hy thiêm đà có HTCO rõ rệt Trong giới hạn nồng độ thí nghiệm đà chọn ,HTCO tăng theo nång ®é chÊt thư nhng tõ nång ®é 0,2 mg/ml tăng không nhiều so với tăng nồng độ chất thử Để thử HTCO phần chiết số hợp chất tách từ phần chiết hy thiêm, chọn nồng độ 0,2 mg/ml chất thử hỗn hợp ủ để thử HTCO mẫu Kết đợc nêu bảng 4.12 Mỗi số liệu kết trung bình cộng lần thí nghiệm Bảng 4.12 - HTCO phần chiết hợp chất từ hy thiêm Mẫu Mật độ quang (D) HTCO (%) Chøng 0,2099 O1 0,0985 53 O2 0,1099 48 O3 0,1060 50 H1 0,0719 66 H2 0,2036 H3 0,0940 56 Nh nồng độ phần chiÕt PE (O1), phÇn chiÕt EtOAc (O2), phÇn chiÕt n-Bu (O3), H1 H3 có HTCO rõ rệt, đặc biƯt lµ H1 (axit cafeic) ) vµ H3 (rutin) Víi H2 (ditecpen glycozit) hầu nh HTCO Điều phù hợp với nhận định chung polyphenol (flavonoit) thờng có hoạt tính chống oxy hoá cao Kết thử với H3 (rutin) đáng lu ý vµ cho thÊy ngoµi tÝnh chÊt vitamin P (xem trang 88), rutin thể tác dụng chống oxy hoá tốt 3.4.2.3 Thử HTCO sản phẩm từ bòn bọt Kết thử HTCO phần chiết etanol bòn bọt đợc nêu bảng 4.13 biểu diễn hình 4.16 Bảng 4.13 - HTCO phần chiết etanol bòn bọt (tức E0) Mẫu Nồng độ mẫu hỗn hợp ủ (mg/ml) MËt ®é quang (D) HTCO (%) Chøng 0,3630 E0 0,10 0,3320 0,20 0,3199 12 0,40 0,3057 16 0,80 0,2748 24 1,6 0,1999 45 HTCO (%) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 0 0,5 1,5 Nồng độ mẫu (mg/ml) Hình 4.16- Sù thay ®ỉi HTCO theo nång ®é cđa chÊt thư hỗn hợp ủ phần chiết etanol bòn bọt (E0) Qua kết ta nhận thấy giới hạn nồng độ thí nghiệm, tăng nồng độ mẫu thử hỗn hợp ủ HTCO tăng lên HTCO phần chiết etanol bòn bọt biểu rõ nồng độ chất thử hỗn hợp ủ 0,8 mg/ml Chúng chọn nồng độ để thử HTCO phần chiết số hợp chất đợc tách từ phần chiết Kết nêu bảng 4.14 Bảng 4.14- HTCO phần chiết hợp chất từ bòn bọt Mẫu Mật độ quang (D) HTCO(%) Chứng 0,2389 E1 0,1747 27 E2 0,1266 47 E3 0,1684 30 B1 0,1171 51 B2 0,1068 55 B4 0,1624 32 Khi thử HTCO phần chiết (E1, E2, E3 ) hợp chất tách từ phần chiết (B1, B2 B4) bòn bọt nồng độ 0,8mg/ml hỗn hợp ủ nhận thÊy B1 (este cña axit galic), B2 (axit galic) cã HTCO rõ rệt 4.3.3 Kết luận Các kết thử tác dụng kháng vi sinh vật phần chiết số hợp chất phân lập đợc từ hy thiêm đà cho thấy sản phẩm có tác dụng ức chế tốt chủng vi khuẩn gram (+), tác dụng chủng vi khuẩn gram(-) vi nấm Candida albicans Cây bòn bọt có khả kháng khuẩn tốt Đặc biệt khả kháng mạnh bòn bọt chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (tức trực khuẩn mủ xanh) đáng lu ý, Pseudomonas aeruginosa đà kháng lại hầu hết kh¸ng sinh thêng dïng víi tû lƯ cao (62-97 %), đà kháng lại kháng sinh có hiƯu lùc cao nh Morfloxacin vµ Cefotaxim víi tû lƯ đáng kể (trên 20%) Cây bòn bọt có tác dụng kháng nấm Candida albicans mạnh Tác dụng kháng khuẩn bòn bọt nguyên nhân khiến có tác dụng chữa bỏng tốt, cịng nh cã mét sè t¸c dơng chèng nhiƠm khn khác, khiến cho y học dân gian đà dùng điều trị tiêu chảy chữa lỵ Cả hai có hoạt tính chống oxy hoá rõ rệt Trong giới hạn nồng độ nghiên cứu, HTCO tăng theo tăng nồng độ chất thử Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chống oxy hoá hai nghiên cứu đà góp phần lý giải hoạt tính sinh học hai kết luận Qua thời gian thực luận án, đà thu đợc kết chủ yếu sau đây: Đà khảo sát thành phần polyphenol (flavonoit) tecpenoit cao hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) mọc Việt Nam Kết đà lần phân lập đợc axit cafeic, rutin, -sitosterol, stigmasterol hỗn hợp tritecpen glucozit từ Siegesbeckia orientalis L nói chung darutozit từ loài mọc Việt Nam Bằng phơng pháp HPLC đà xác định đợc hàm lợng rutin phần mặt đất hy thiêm 1,85.10-2% so với lợng mẫu thực vật khô Đà khảo sát cấu trúc darutozit phơng pháp phổ 2D NMR (H,H- COSY, HMQC), từ kết đà góp phần khẳng định cấu trúc darutozit gán tín hiệu 1H 13C cách phù hợp Đà lần phân lập từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ., Euphorbiaceae) hợp chất polyphenol axit galic, etyl galat hai flavonol rhamnozit Đà phân lập đợc dẫn xuất tritecpenoit có khung oleanan đề xuất cấu trúc cho chất dựa khảo sát phổ Đà bớc đầu khảo sát số tác dụng sinh học hy thiêm Các phần chiết hợp chất H1, H2, H3 phân lập đợc từ hy thiêm có tác dụng ức chế chủng vi khuẩn gram (+) tác dụng chủng vi khuẩn gram (-) nh tác dụng kháng nấm Candida albicans Các khảo sát cho thấy hy thiêm có tác dụng chống oxy hoá rõ rệt Đà bớc đầu khảo sát số tác dụng sinh học bòn bọt Các phần chiết hợp chất B1 phân lập đợc từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.) có tác dụng rõ đối vói chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri đặc biệt Pseudomonas aeruginosa trực khuẩn mủ xanh Cây bòn bọt có tác dụng kháng nấm Candida albicans mạnh Các khảo sát cho thấy bòn bọt có tác dụng chống oxy hoá rõ rệt Các kết nghiên cứu đà góp phần hiểu biết hoá thực vật hai loài thuốc dân gian đợc nghiên cứu tạo sở cho việc ứng dụng thực tiễn hai loài ... tù ë vị trí 3,4 có tác dụng tốt nâng cao tính bền vững thành mạch Rutin chất tiêu biểu tác dụng Từ nhiều năm công trình nghiên cứu hoạt chất kháng khuẩn, chống viêm thực vật, có polyphenol, đÃ... với phản ứng sinh hoá cây, với hoà tan chất di chuyển chúng qua màng sinh học nh với hô hấp quang hợp thực vật Một số flavonoit có tác dụng ức chế enzym chất độc Chúng có tác dụng ức chế kích... nhân, tỷ lệ đạt 80% Tác dụng giảm đau so với tác dụng tiêu viêm Gần Nguyễn Hải Nam đà thử hoạt tính gây độc tế bào số sản phẩm từ hy thiêm số dòng tế bào ung th [68] 1.1.2 Cây bòn bät (Glochidion