Nghiên Cứu Hoá Học Một Số Hoạt Chất Có Tác Dụng Chống Oxy Hoá Và Chống Nhiễm Khuẩn Từ Cây Hy Thiêm

1 đại học quốc gia hà nội trường đại học khoa học tự nhiên Lê thị kiều nhi Nghiên cứu hóa học số hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa chống nhiễm khuẩn từ hy thiêm (siegesbeckia orientalis l.) bòn bọt (glochidion eriocarpum champ.) Việt Nam Chuyên ngành: Hoá hữu Mà số: 1.04.02 ln ¸n tiÕn sÜ hãa häc Ng­êi h­íng dÉn Khoa học: GS TSKH Phan Tống Sơn TS Nguyễn Văn Đậu Hà Nội - 2001 Đặt vấn đề Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới châu á, có khí hậu nhiệt đới gió mùa Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 15-270C, lượng mưa lớn (trung bình 1200-2800mm), độ ẩm tương đối cao (trên 80%) [5] Điều kiện khí hậu thuận lợi cho phát triển loài thực vật nói chung dược liệu nói riêng Theo số liệu gần đây, hệ thực vật Việt Nam đà có khoảng 10.500 loài thống kê [8], có khoảng 3.200 loài sư dơng y häc d©n téc [4] Theo dù đoán nhà khoa học, hệ thực vật Việt Nam có lẽ gồm khoảng 12.000 loài, nh÷ng hƯ thùc vËt phong phó nhÊt thÕ giíi [8] Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đà đóng vai trò quan trọng đời sống người Chúng dùng làm thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hương liệu mỹ phẩm Đặc biệt lĩnh vực làm thuốc, nguồn dược liệu thiên nhiên phong phú đa dạng đà cung cấp cho ngành dược nước khối lượng nguyên liệu lớn để chữa bệnh xuất có giá trị kinh tế cao Về lâu dài, phát triển dược phẩm mới, sản phẩm thiên nhiên có vai trò quan trọng, nhiều chất chất dẫn đường cho việc tổng hợp dược phẩm mới, dùng làm chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lý dược lý học người Trong thập kỷ qua việc nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học loài cỏ nước ta có nhiều hạn chế, chưa đáp ứng yêu cầu điều tra để nhằm định hướng sử dụng phát triển nguồn tài nguyên thực vật cách hợp lý có hiệu Tuy nhiên, nhà khoa học nghiên cứu, tìm kiếm loài có giá trị làm thuốc chữa bệnh hàng ngày, hàng giờ, nguồn tài nguyên bị nhanh chóng số lượng tính đa dạng sinh học Một nhóm chuyên gia thực vật học Quỹ Quốc tế Bảo vệ thiên nhiên (WWB) đà dự đoán có khoảng 60.000 loài thực vật (khoảng 1/4 tổng số loài giới nay) bị tuyệt chủng vào năm 2050, xu hướng tác động vào thiên nhiên tiếp tục Đến đà có 18.000 loài đưa vào "Sách đỏ " nhiều nước để có biện pháp bảo vệ đặc biệt [8] Việt Nam đà xuất "Sách đỏ Việt Nam", Phần thực vật, với 356 loài thực vật thuộc loại quý cần bảo vệ [12] Sự nhanh chóng tính đa dạng sinh học (gồm thực vật, động vật vi sinh vật) thực thảm hoạ loài người Xu chung nhân loại trở lại sử dụng sản phẩm từ thiên nhiên Vì vậy, việc điều tra thuốc khảo sát chúng mặt hoá thực vật có ý nghĩa to lớn Nhiều hoạt tính sinh học quí báu hợp chất quen biết từ lâu lại phát Trong nhiều cỏ phổ biến bình thường người ta đă tìm hoạt chất có giá trị Nhiều thuốc thuốc dân gian truyền từ đời sang đời khác, làm sáng tỏ chế tác dụng chữa bệnh nhờ kết nghiên cứu hoá thực vật hoạt tính sinh học Nhờ mà chúng sử dụng cách hợp lý hơn, có hiệu Luận án nằm hướng có nhiệm vụ nghiên cứu thành phần hoá học bước đầu khảo sát số hoạt tính sinh học số chế phẩm thu từ số loài nước ta, đà sử dụng lâu đời phổ biến nhân dân để chữa bệnh Để thực nhiệm vụ đề chọn đối tượng để nghiên cứu luận án hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ., Euphorbiaceae).Đây hai mọc hoang dại phổ biến nước ta y học dân gian sử dụng có hiệu để chữa mét sè bƯnh viªm nhiƠm nh­ mơn nhät, lë ngøa, vết rắn cắn, bỏng, tiêu chảy, lỵ, viêm khớp, , bệnh có liên quan tới chủng vi khuẩn có khả gây bệnh, thường liên quan tới sản sinh nhiều gốc tự tổ chức (mô, tế bào , , ) Những nội dung luận án là: *Tìm phương pháp thích hợp để thu nhận phân đoạn giàu polyphenol (bao gồm flavonoit) tecpenoit cao (di - tritecpenoit) lớp hoạt chất quan tâm * Phân tách hỗn hợp polyphenol tecpenoit cao nhằm phân lập hợp chất tinh khiết * Khảo sát cấu trúc hợp chất nhận * Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật khả chống oxi hoá in vitro số phần chiết hợp chất tinh khiết nhận Các kết nghiên cứu nhằm góp phần nâng cao hiểu biết hoá thực vật hai loài thuốc dân gian nghiên cứu tạo sở khoa häc cho viƯc øng dơng thùc tiƠn cđa hai loài Chương tổng quan 1.1 Tổng quan loài nghiên cứu luận án 1.1.1 Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) 1.1.1.1 Thực vật học [8], [14] Theo Phạm Hoàng Hộ [8] cã hai loµi Siegesbeckia (Asteraceae) mäc ë n­íc ta: Siegesbeckia integrifolia Gagn (Hy thiêm nguyên) Siegesbeckia orientalis L (Hy thiêm) Cho đến có Siegesbeckia orientalis L., tức Hy thiêm (các tên gọi khác: cỏ đĩ, cứt lợn, cúc dính, chó đẻ, cỏ bà a, v.v ), y học dân gian dùng để chữa bệnh Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) cỏ sống năm, cao chừng 40cm đến 1m, có nhiều cành, có lông tuyến Lá mọc đối cuống ngắn, hình ba cạnh hay thuôn hình trám, đầu nhọn, phía cuống thót lại, mép có cưa, mặt có lông, dài 4-10cm, rộng 3-6cm Cụm hoa hình đầu, màu vàng, cuống có lông tuyến dính Có hai loại bắc không nhau: bắc hình thìa dài 9-10mm, mọc toả thành hình sao, có lông dính, bắc dài 5mm hợp thành tổng bao Quả bế, màu đen, hình trứng Cây hoa vào tháng - 5, đậu vào tháng - 10 Thu hái trước hoa, đem phơi khô dùng làm thuốc nước ta, nguồn hy thiêm phong phú mọc khắp nơi, rải rác từ miền núi, trung du đến vùng đồng bằng, trừ Tây Nguyên 1.1.1.2 Nghiên cứu hoá học loài Siegesbeckia Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) số loài Siegesbeckia khác phân bố rộng rÃi vùng nhiệt đới giới thuốc dùng y häc d©n gian cđa mét sè n­íc nh­ Trung Qc, Nhật Bản, bán đảo Triều Tiên, Việt Nam, , nên đà quan tâm nghiên cứu hoá học J Pudles, A Diara E Lederer [74] phân lập từ Siegesbeckia orientalis Madagaskar -D-glucozit, C26H44O8, đề nghị đặt tên cho chất darutozit Chất ®· ®­ỵc Auffray [Auffray, Bull Soc Med de l’Il Maurice (1988), x [74],[100] phân lập từ S orientalis gọi tên darutin Darutozit ngậm phân tử C2H5OH có đnc 2500C (kết tinh từ etanol tuyệt đối) có đnc 2300C ngậm phân tử H2O (kết tinh từ 50% etanol) Khi bị thuỷ phân emulsin men elateraza darutozit cho glucozơ ditecpen ancol ba vòng có ba nhóm hidroxi, C20H34O3, đnc 168-1700C (kết tinh tõ benzen råi etanol) J Pudles, A Diara vµ E Lederer [74] gọi tên ditecpen ancol darutigenol J Pudles, A Diara cộng [100], [101] đà khảo sát chủ yếu phương pháp hoá học đưa cấu trúc darutigenol OH 17 CH 20 CH2OH HO HO H 14 H CH2OH a H 19 15 16 C 11 H a OH 18 1b Darutigenol sau ®ã cịng đà tìm thấy dạng aglycon thiên nhiên, Palafoxia arida [43] Cấu trúc darutigenol khẳng định thêm phổ khối lượng cộng hưởng từ proton [43] Trong công trình nghiên cứu nêu trên, cấu hình C-15 darutigenol chưa xác định Vấn đề đà E Wenkert cộng [89] giải dựa vào khảo sát phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C; darutigenol có cấu hình C(15)R biểu diễn công thức 1b Dựa chuyển dịch tín hiÖu cacbon, J H Kim, K D Han, K Yamasaki O Tanaka [55] đà chứng minh darutozit liên kết -Dglucozyl phải định vị nhóm 3-equatorial hidroxi cđa aglycon darutigenol vµ nhãm hidroxi nµy cã cÊu hình R, nhóm hidroxi C-15 Diara người khác [101] đà dự doán Vậy cấu trúc darutozit phải biểu diễn c«ng thøc HOH2C OH 15 C H CH2OH HOH2C GlcO O 2C C CH2 O CH2 Me H O Glc= -D-glucopyranozyl Trong mét b»ng ph¸t minh, P Fabre [33] đà đưa quy trình chiết darutozit tõ Siegesbeckia orientalis b»ng butanol S S Suh vµ J S Shin [83] đà phân lập từ Siegesbeckia orientalis Triều Tiên phytosterol stigmasterol -sitosterol Từ toàn Siegesbeckia orientalis khô, T H Yang cộng [96] đà phân lập 3, 7-dimetylquercetin hai tecpenoit không rõ cấu trúc 3,7-dimetylquercetin chất flavonoit phân lËp tõ S orientalis Tõ S orientalis K S Rybalko cộng [75] đà phân lập sesquitecpen lacton đặt tên cho orientin Cũng theo tác giả orientin có cấu trúc chưa xác định dứt khoát R N Baruah cộng 18],[19], đà phân lập từ S orientalis ba lacton míi thc nhãm melampolid vµ chøng minh cÊu tróc chúng, chất orientalid 4, lacton vµ O R=OH, 14 , R"= Ac R'= CHO OR" 10 OR' 13 O R=H, , R"= Ac R'= 11 15 CH2R 12 O O O R=OH, R'= , R"= Me R N Baruah vµ cộng {18} đà phân lập darutigenol (1b) từ phân đoạn phân cực phần chiÕt S orientalis C Zdero, F Bohlmann vµ céng sù [98] đà phân lập từ phần mặt đất S orientalis thu hái úc chín germacranolid 7a-7e 8a-8d, melampolid 9a-9c, ent-pimaren 10a-10c, bên cạnh nhiều chất đà biết khác Mới D Guo cộng [37] phân lập từ phần mặt đất S orientalis axit cacboxylic thuộc dÃy kauran đặt tên cho chúng axit siegesesteric (axit ent-17-axetoxy-18-isobutyryloxy-16-kauran-19-oic) vµ axit siegesetheric (axit ent-17-etoxy -16-(-)-kauran-19-oic) J Xiong cộng [91] đà phân lập từ Siegesbeckia orientalis hai ditecpenoit mới, đặt tên orientalin A (ent-15-axetoxi -2,16,19trihidroxipimar-8(14)-en) vµ orientalin B (ent-16-axetoxi -2,15,19- trihidroxipimar-8(14)-en) R R 14 R 3 OR OR 10 O R 13 11 15 R1 R2 R3 7a iBu OH Me O 7b Meacr OH Me O O 7c iBu H CH2OH 7d iBu H CHO 7e iBu OH CH2OH R1 R2 R3 8a H iBu H 8b OH iBu H O 8c OH H H 8d H iBu OH CH2=C CO CH3 Meacr = Methacryl = 17 14 12 CHO 10 X OR R1 R2 H 15 14 16 OH H 11 O O 9a 9b OAc OH iBu iBu 9c H iBu OH 12 15 10 13 13 20 R OH 11 R 18 X R 19 10a OH, H H 10b =O H 10c =O OH Một loài Siegesbeckia khác quan tâm nghiên cứu nhiều hoá học hoạt tính sinh học, Siegesbeckia pubescens Makino 10 Nhật Bản phần mặt đất gọi "Kiren" dùng để chữa bệnh liệt chi [107] làm vị thuốc có hoạt tính chống oxi hoá [82] bán đảo Triều Tiên, dùng y học dân gian để chữa bệnh cao huyết áp [53] Trung Quốc Siegesbeckia pubescens dùng số loài Siegesbeckia khác y học cổ truyền để chữa viêm khớp, thấp khớp, cao huyết áp, sốt rét, suy nhược thần kinh rắn cắn [92] L.K.Woo cộng [90] đà chứng minh có mặt ancaloit Siegesbeckia pubescens Tõ Siegesbeckia pubescens, F.Yamamoto vµ céng [94] đà phân lập melampolid 11 dùng làm thuốc giảm đau thuốc chống viªm CH=O OAc OR R = (E)- , (Z)- MeCH : CMeCO CH2 CH2OH O O 11 L.Canonica, B.Rindone, C.Scolastico, K.D.Han J.H.Kim [25] đà phân lập từ Siegesbeckia pubescens hợp chất C20H34O4, đnc 1921930C, cho chất nµy cã cÊu tróc cđa mét dÉn xt daruten (pimaran) với nhóm hidroxi C-6, C-15, C-16 C-18 (cũng xem [39], [41]) T.Murakami cộng [107] đà phân lập lại hợp chất ditecpenoit L.Canonica cộng [25] với đnc 190-1920C đà đặt tên cho chÊt nµy lµ kirenol T.Murakami vµ céng sù [107] đà thiếu sót cấu trúc L.Canonica cộng [25] đà gán cho chất Bằng nghiên cứu chuyển hoá dựa kiện phổ 1H NMR, cấu trúc kirenol đà xác định pimar-8(14)-en-2,15,16,19-tetraol (12) [107] 106 B3 Mặc dù B3 cho vệt ph©n tÝch TLC víi silica gel, nh­ng qua ph©n tÝch HPLC với cột pha ngược (ODS analytical) đà thấy B3 hỗn hợp nhiều chất, với chủ yếu hai chÊt cã thêi gian l­u rÊt gÇn víi (21,8 27 phút) (xem Phần phụ lục) B3 đà phân tách điều chế HPLC cột Protosil 120-15 C18 AQ 15,0 m, với pha động hỗn hợp axetonitril-nước detector diode array cho hai hợp phần (xem Phần phụ lục) Khảo sát phổ hai chất (xem Phần phụ lục) cho thấy chúng flavonol glycozit (max 215, 275, 357 nm) mà phần đường rhamnozơ [1H-NMR, , ppm: 7,50 7,80 (các H aromat thuộc vòng C); 6,60 6,90 (các H aromat thuộc vòng A); 4,50 (Hanome -rhamnozơ); 3,00 4,00 (các H rhamnozơ)] (xem Phần phụ lục) Tuy nhiên, để xác định cấu trúc hai chất cần có thêm thông tin bổ sung khác B4 B4 kết tinh l¹i clorofoc: metanol (9:1, v/v) d­íi d¹ng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; đnc 211 - 2150C Phổ IR B4 (xem Phần phụ lục) có dải đặc trưng cho ancol (3359 cm-1, br), este axit benzoic (1716 cm-1, C = 0; 1600 vµ 1450 cm-1 (nhân phenyl)), nối đôi cacbon - cacbon (1670cm-1) Các đặc điểm sắc ký cột sắc ký lớp mỏng đà cho phép dự đoán B4 tritecpen glycozit Phản ứng thuỷ phân B4 dung dịch axit clohidric etanol đà cho aglycon B4 sản phẩm vô định hình, phổ IR dải đặc trưng cho ancol (3368 cm-1, br) dải cacbonyl este 107 axit benzoic (1716 cm-1) Phần đường nhận qua thuỷ phân B4 hỗn hợp glucozơ arabinozơ, điều chứng minh sắc ký giấy xenlulozơ, với hệ dung môi n-butanol-etanol nước (4:1:5) thuốc anilin-diphenylamin-axit photphoric axeton [109] Phản ứng peaxetyl hoá B4 phản ứng peaxetyl aglycon B4 anhydrit axetic pyridin cho dẫn xuất peaxetyl tương ứng; phổ IR sản phẩm dải hấp thụ nhóm hidroxyl không xuất hiện; bên cạnh dải hấp thụ cacbonyl nhóm benzoyl (1716 cm-1) xuất thêm dải hấp thụ nhóm axetyl (1736 cm-1) Dựa khảo s¸t c¸c phỉ 1D NMR (1H NMR, 13C NMR, DEPT) 2D NMR (1H-1H COSY, HMQC, HMBC), so sánh với oleanan tritecpenoit đà công bố tài liệu tham khảo, [79], [80], đà đề nghị cấu trúc cho B4 [O--D-glucopyranosyl-(13)-O--Larabinopyranosyl) oxy]-22-benzoyloxy-olean-12-en-16-28-diol (41) ( vỊ chi tiÕt phỉ NMR: xem ch­¬ng ) Trªn phỉ EI MS cđa B4 xt hiƯn pic ion mảnh m/z 370, m/z 369, m/z 368, kết phá mảnh Diels-Alder đảo (m/z 370), tượng thường gặp hợp chất không no kiểu dÃy oleanan [93], phân cắt tiếp hai nguyên tử hidro OCO a CH2OH a OH m/z 370 108 Theo nghiên cứu tài liệu chúng tôi, 41 dẫn xuất oleanan mới, phân lập lần 30 29 20 19 12 11 26 25 14 10 6"' 5" HO CH2 5"' HO 4"' O 1"' 3"' 2"' a HO HO 4" 3" O H OH O 1" 2" O H OH 23 13 H 27 18 H 17 16 15 21 22 28 OCO CH2OH OH 2' 3' 1' 6' 4' 5' a 24 B4 (41) 4.2.6 Kết luận Đà khảo sát định tính thành phần polyphenol phận khác bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.,Euphorbiaceae) mọc Vĩnh Phú Bắc Thái Bằng cách sử dụng kết hợp phương pháp sắc ký (MPLC, FC, CC), đÃ) phân lập từ cành non axit galic, etyl galat hai flavonol rhamnozit Đây lần polyphenol phân lập từ loài Glochidion eriocarpum Champ Đà phân lập dẫn xuất tritecpenoit có khung oleanan đề xuất cấu trúc cho chất dựa khảo sát phổ 109 4.3 Khảo sát số hoạt tính sinh học Trong y học dân gian Việt Nam hy thiêm dùng phổ biến từ lâu đời để chữa bệnh viêm khớp, lở ngứa, mụn nhọt Theo kinh nghiệm dân gian, bòn bọt dùng chữa rắn cắn, điều trị tiêu chảy, chữa lỵ Bệnh viện Vĩnh Yên Viện Bỏng Quốc gia đà dùng cao bòn bọt chữa bỏng có hiệu cao Những tác dụng chữa bệnh hai nghiên cứu luận án gợi việc nên khảo sát hoạt tính, kháng khuẩn, kháng nấm tác dụng chống oxy hoá số sản phẩm hợp chất từ hai 4.3.1 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Chúng đà thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết số chất tinh khiết từ hy thiêm bòn bọt với 11 chủng vi sinh vật điển hình, gồm chủng vi khuẩn gram (+): Bacillus pumilus NCTC 8241, Bacillus cereus ATCC 9946, Bacillus subtilis ATCC 6633, Sarcina lutea ATCC 9341, Staphylococcus aureus ATCC 12228; chđng vi khn gram ©m (-): Salmonella typhi DT 220, Shigella flexneri DT 112, Pseudomonas aeruginosa VM 201, Proteus mirabilis BV 108, Escherichia coli DT 119 B 14, vµ mét chñng vi nÊm Candida albicans ATCC 10231 4.3.1.1 Phương pháp thử Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mẫu thử xác định kỹ thuật khuếch tán môi trường đặc theo Bauer Kirby [67],[86] Các mẫu chất dạng rắn hoà tan dung môi thích hợp (etanol, axeton, ) với nồng độ cho trước Các dung dịch thử tẩm vào khoanh giấy sắc ký N05 có đường kính mm đến bÃo hoà, để bay dung môi nhiệt độ phòng thí nghiệm Các khoanh giấy tẩm chất thử đặt mặt đĩa thạch dinh dưỡng ®· trén nhị dÞch vi sinh vËt cã 106-107 tÕ bào/ml với tỷ lệ 1% so với môi trường Kết xác định đường kính vùng ức chế 110 phát triển vi sinh vật (vòng vô khuẩn) sau 18-24 nuôi cấy 370C vi khuẩn, 280C vi nấm Môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật môi trường Muller-Hiltơn, môi trường Sabouraud 4.3.1.2 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm sản phẩm từ hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.,Asteraceae) Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết etanol (tức O0), PE (tức O1), EtOAc(tức O2), n-butanol (tức O3)) từ hy thiêm số hợp chất tinh khiết phân lập từ phần chiết thử nồng độ mg/ml (hàm lượng trung bình 360 g chất/khoanh giấy), tổ Vi nấm Kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội Kết nêu bảng 4.9 Bảng 4.9 - Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết hợp chất từ hy thiêm Chủng vi khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) O0 O1 O2 O3 H1 H2 H3 Sta aureus Sar lutea Bac cereus Bac subtilis Bac pumilus Sh flexneri 12,55 10,45 14,9 10,1 9,05 10,75 10,5 13,25 11,5 14,5 8,58 11,7 10,95 10,35 17,00 8,4 9,05 11,15 8,1 9,3 8,1 10,7 10.5 9,05 9,2 8,05 11,35 9,15 8,3 9,8 8,15 9,65 8,8 8,35 8.55 S typhi E coli Pr mirabilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ps aeruginosa Ca albicans 0 0 0 0 0 0 0 Các kết thử cho thấy phần chiết hợp chất tinh khiết H1, H2, H3 nhận từ hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Arteraceae) có tác dụng ức chế chủng vi khuẩn gram (+) tác 111 dụng chủng vi khuẩn gram (-) tác dụng kháng nấm Candida albicans Khả kháng sản phẩm hy thiêm chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus chủng vi khuẩn gây mủ vết thương, vết bỏng, gây nhiễm trùng mủ da quan nội tạng, nguyên nhân khiến cho y học dân gian đà dùng để chữa lở ngứa, mụn nhọt, vết rắn cắn 4.3.1.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm sản phẩm từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.) Các phần chiết từ bòn bọt (E0, E1, E2 E3) số hợp chất phân lập từ phần chiết (B2 B4) đà thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nồng độ 5mg/ml (hàm lượng trung bình 450 g chất/khoanh giấy) tổ Vi nấm-Kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội Kết nêu bảng 4.10 Bảng 4.10 - Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết hợp chất từ bòn bọt E0 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) E1 E2 E3 B2 11,5 10,5 10,0 11,5 Sar lutea 0 0 0 Bac cereus 0 0 0 Bac subtilis 0 0 0 Bac pumilus 12,5 13,0 10,5 Sh flexneri 14,5 15,2 11 11,5 S typhi 0 0 0 E coli 0 0 0 Pr mirabilis 0 0 0 Ps aeruginosa 8,5 8,3 8,2 15,0 Ca albicans 16,2 8,5 18,5 13 19,5 Chñng vi khuẩn Sta aureus B4 112 Qua kết ta nhận thấy số phần chiết số hợp chất phân lập từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.) có tác dụng rõ đối vói chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri đặc biệt Pseudomonsas aeruginosa trực khuẩn mủ xanh Theo [7] Pseudomonas aeruginosa nguyên gây nhiễm khuẩn huyết bỏng tỷ lệ nhiễm khuẩn huyết bỏng Pseudomonas aeruginosa gây 66,7% Ngày việc sử dụng thuốc kháng sinh rộng rÃi, không hợp lý nhiễm trùng bệnh viện đà làm tăng chủng kháng thuốc Cho đến Pseudomonas aeruginosa đà kháng lại hầu hết thuốc kháng sinh th­êng dïng (víi tû lƯ cao, 62-97%) vµ mét số loại thuốc kháng sinh có hiệu lực cao sử dụng Tác dụng ức chế tốt với Pseudomonas aeruginosa phần chiết E0, E1, E2 chất B2 từ bòn bọt (xem bảng 4.10) sở để giải thích cho tác dụng chữa bỏng có hiệu tốt cao bòn bọt Điều gợi mở hướng sử dụng bòn bọt để chữa số bƯnh g©y bëi vi khn Pseudomonas aeruginosa, mét chđng vi khn kh¸ng kh¸ng sinh víi tû lƯ cao hiƯn Cũng qua kết ta nhận thấy phần chiết E0, E1, E2 đặc biệt B2 có tác dụng ức chế mạnh nấm Candida albicans 4.3.2 Thử hoạt tính chống oxy hoá Tia tử ngoại, xạ ion hoá, nhiều chất gây ô nhiễm khí chất độc ozon, , nguồn gốc biến đổi phân tử oxy peroxy hóa lipit (nguồn gốc tự ngoại sinh) Đồng thời có gốc tự nội sinh tế bào hệ miễn dịch tế bào nơi bị viêm sinh Các gốc tự nhiều đóng vai trò chủ yếu nhiều bệnh Độc tính gốc tự trình bệnh tim mạch hô hấp, nhiễm ®éc, ung th­, nh÷ng bƯnh cđa hƯ miƠn dịch số trình viêm, đà chứng minh Khả chất chống gốc tự chống peroxy hoá 113 lipid (POL) có nguồn gốc nội sinh bị vượt qua số trạng thái bệnh lý, khả bị giảm thiểu tuổi già nên điều hợp lý dùng chất chống oxy hoá bệnh có liên quan đến gốc tự [1] Vì việc đánh giá hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) chế phẩm, hoạt chất, đóng góp nhằm làm sáng tỏ chế chữa số bệnh thuốc đà sử dụng 4.3.2.1 Phương pháp thử Quá trình POL xảy phản ứng dạng oxy hoạt động, chủ yếu gốc hydroxyl (ÃOH) oxy đơn bội (1O2), với chất hữu thể, chủ yếu axit béo chưa no có nhiều nối đôi tổ chức màng (LH) Sản phẩm trình POL dien liên hợp, malonyl diandehit (MDA), ankan etan, pentan, Xác định lượng sản phẩm trình POL hình thành nhiều hay giúp đánh giá trình peroxy hoá mạnh hay yếu suy tương quan dạng oxy hoạt động chất chống oxy hoá thể đà tăng hay giảm Để xác định sản phẩm trình POL, dựa vào việc đo lượng dien liên hợp hình thành, lượng ankan, MDA sử dụng phương pháp xác định lượng MDA hình thành trình POL để đánh giá khả chống oxy hoá mẫu thử HTCO chế phẩm (phần chiết, hợp chất tinh khiết) đánh giá tỷ lệ phần trăm MDA giảm mẫu thử có chứa chế phẩm so sánh với mẫu chứng không chứa chế phẩm Để xác định HTCO in vitro thông qua việc định lượng MDA hình thành trình POL tiến hành theo phương pháp C G Blogodarov cộng [110] Nguyên tắc phương pháp dùng gốc axit 114 oleic Tween 80 để làm chất oxy hoá chuyển thành MDA có mặt muối sắt (II), axit ascobic oxy không khí MDA hình thành tác dụng với axit thiobacbituric tạo phức màu hồng, có hấp thụ cực đại max=532 nm Theo định luật Bughe-Lamber- Bia D = c.l. Trong ®ã: c: Nång ®é dung dÞch mÉu (M/l) D: MËt ®é quang l: ChiỊu dµy cuvet (cm) : HƯ sè tắt phân tử (M1 l cm1) Như vậy, dựa vào biến đổi mật độ quang mẫu thử mà ta nhận định cách định tính biến đổi nồng độ MDA từ dẫn đến nhận định HTCO mẫu thử 4.3.2.2 Thử HTCO sản phẩm từ hy thiêm Để đánh giá sơ HTCO phần chiết số hợp chất phân lập từ hy thiêm tiến hành thử HTCO phần chiết etanol (tức O0) hy thiêm theo nồng độ khác phần chiết hỗn hợp ủ Mỗi số liệu trung bình cộng ba lần thí nghiệm Kết nêu bảng 4.11 Bảng 4.11 - HTCO phần chiết etanol hy thiêm (tức O0) Mẫu Nồng độ mẫu hỗn hợp ủ (mg/ml) Mật độ quang (D) HTCO (%) Chøng 0,1918 0,05 0,1840 0,10 0,1755 0,20 0,1029 46 0,40 0,0904 53 0,80 0,0714 63 O0 115 Từ số liệu thực nghiệm thu bảng 4.10, ta biểu diễn mối liên hệ HTCO nồng độ mẫu thử O0 hỗn hợp ủ hình 4.15 70 HTCO (%) 60 50 40 30 20 10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Nồng độ mẫu (mg/ml) Hình 4.15 - Sự thay ®ỉi HTCO theo nång ®é cđa chÊt thư hỗn hợp ủ phần chiết etanol hy thiêm (O0) Qua kết nhận thấy nồng độ 0,2 mg/ml chất thử hỗn hợp ủ, phần chiết etanol hy thiêm đà có HTCO rõ rệt Trong giới hạn nồng độ thí nghiệm đà chọn ,HTCO tăng theo nồng độ chất thử từ nồng độ 0,2 mg/ml tăng không nhiều so với tăng nồng độ chất thử Để thử HTCO phần chiết số hợp chất tách từ phần chiết hy thiêm, chọn nồng độ 0,2 mg/ml chất thử hỗn hợp ủ để thử HTCO mẫu Kết nêu bảng 4.12 Mỗi số liệu kết trung bình cộng lần thí nghiệm 116 Bảng 4.12 - HTCO phần chiết hợp chất từ hy thiêm Mẫu Mật độ quang (D) HTCO (%) Chứng 0,2099 O1 0,0985 53 O2 0,1099 48 O3 0,1060 50 H1 0,0719 66 H2 0,2036 H3 0,0940 56 Nh­ nồng độ phần chiết PE (O1), phần chiết EtOAc (O2), phần chiết n-Bu (O3), H1 H3 có HTCO rõ rệt, đặc biệt H1 (axit cafeic) ) H3 (rutin) Với H2 (ditecpen glycozit) HTCO Điều phù hợp với nhận định chung polyphenol (flavonoit) thường có hoạt tính chống oxy hoá cao Kết thử với H3 (rutin) đáng lưu ý cho thấy tính chất vitamin P (xem trang 88), rutin thĨ hiƯn t¸c dơng chèng oxy ho¸ kh¸ tèt 3.4.2.3 Thử HTCO sản phẩm từ bòn bọt Kết thử HTCO phần chiết etanol bòn bọt nêu bảng 4.13 biểu diễn hình 4.16 Bảng 4.13 - HTCO phần chiết etanol bòn bọt (tức E0) Chứng Nồng độ mẫu hỗn hợp ủ (mg/ml) Mật độ quang (D) 0,3630 HTCO (%) E0 0,10 0,3320 0,20 0,3199 12 0,40 0,3057 16 0,80 0,2748 24 1,6 0,1999 45 MÉu HTCO (%) 117 50 45 40 35 30 25 20 15 10 0 0,5 1,5 Nồng độ mẫu (mg/ml) Hình 4.16- Sự thay đổi HTCO theo nồng độ chất thử hỗn hợp ủ phần chiết etanol bòn bọt (E0) Qua kết ta nhận thấy giới hạn nồng độ thí nghiệm, tăng nồng độ mẫu thử hỗn hợp ủ HTCO tăng lên HTCO phần chiết etanol bòn bọt biểu rõ nồng độ chất thử hỗn hợp ủ 0,8 mg/ml Chúng chọn nồng độ để thử HTCO phần chiết số hợp chất tách từ phần chiết Kết nêu bảng 4.14 Bảng 4.14- HTCO phần chiết hợp chất từ bòn bọt MÉu MËt ®é quang (D) HTCO(%) Chøng 0,2389 E1 0,1747 27 E2 0,1266 47 E3 0,1684 30 B1 0,1171 51 B2 0,1068 55 B4 0,1624 32 118 Khi thö HTCO phần chiết (E1, E2, E3 ) hợp chất tách từ phần chiết (B1, B2 B4) bòn bọt nồng độ 0,8mg/ml hỗn hợp ủ nhận thấy B1 (este cña axit galic), B2 (axit galic) cã HTCO râ rệt 4.3.3 Kết luận Các kết thử tác dụng kháng vi sinh vật phần chiết số hợp chất phân lập từ hy thiêm đà cho thấy sản phẩm có tác dụng ức chế tốt chủng vi khuẩn gram (+), tác dụng chủng vi khuẩn gram(-) vi nấm Candida albicans Cây bòn bọt có khả kháng khuẩn tốt Đặc biệt khả kháng mạnh bòn bät ®èi víi chđng vi khn Pseudomonas aeruginosa (tøc trùc khuẩn mủ xanh) đáng lưu ý, Pseudomonas aeruginosa đà kháng lại hầu hết kháng sinh th­êng dïng víi tû lƯ cao (62-97 %), vµ cịng đà kháng lại kháng sinh có hiệu lực cao Morfloxacin Cefotaxim với tỷ lệ đáng kể (trên 20%) Cây bòn bọt có tác dụng kháng nấm Candida albicans mạnh Tác dụng kháng khuẩn bòn bọt nguyên nhân khiến có tác dụng chữa bỏng tốt, cã mét sè t¸c dơng chèng nhiƠm khn kh¸c, khiÕn cho y học dân gian đà dùng điều trị tiêu chảy chữa lỵ Cả hai có hoạt tính chống oxy hoá rõ rệt Trong giới hạn nồng độ nghiên cứu, HTCO tăng theo tăng nồng độ chất thử Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chống oxy hoá hai nghiên cứu đà góp phần lý giải hoạt tính sinh học hai 119 kết luận Qua thời gian thực luận án, đà thu kết chủ yếu sau đây: Đà khảo sát thành phần polyphenol (flavonoit) tecpenoit cao hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) mọc Việt Nam Kết đà lần phân lập axit cafeic, rutin, -sitosterol, stigmasterol hỗn hợp tritecpen glucozit từ Siegesbeckia orientalis L nói chung darutozit từ loài mọc Việt Nam Bằng phương pháp HPLC đà xác định hàm lượng rutin phần mặt đất hy thiêm 1,85.10-2% so với lượng mẫu thực vật khô Đà khảo sát cấu trúc darutozit phương pháp phổ 2D NMR (H,H- COSY, HMQC), từ kết đà góp phần khẳng định cấu trúc darutozit gán tín hiệu 1H 13C cách phù hợp Đà lần phân lập từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ., Euphorbiaceae) hợp chất polyphenol axit galic, etyl galat hai flavonol rhamnozit Đà phân lập dẫn xuất tritecpenoit có khung oleanan đề xuất cấu trúc cho chất dựa khảo sát phổ Đà bước đầu khảo sát số tác dụng sinh học hy thiêm Các phần chiết hợp chất H1, H2, H3 phân lập từ hy thiêm có tác dụng ức chế chủng vi khuẩn gram (+) tác dụng chủng vi khuẩn gram (-) tác dụng kháng nấm Candida 120 albicans Các khảo sát cho thấy hy thiêm có tác dụng chống oxy hoá rõ rệt Đà bước đầu khảo sát số tác dụng sinh học bòn bọt Các phần chiết hợp chất B1 phân lập từ bòn bọt (Glochidion eriocarpum Champ.) có tác dụng rõ đối vói chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri đặc biệt Pseudomonas aeruginosa trực khuẩn mủ xanh Cây bòn bọt có tác dụng kháng nấm Candida albicans mạnh Các khảo sát cho thấy bòn bọt có tác dụng chống oxy hoá rõ rệt Các kết nghiên cứu đà góp phần hiểu biết hoá thực vật hai loài thuốc dân gian nghiên cứu tạo sở cho việc ứng dụng thực tiễn hai loài ... hoá cây, với hoà tan chất di chuyển chúng qua màng sinh học với hô hấp quang hợp thực vật Một số flavonoit có tác dụng ức chế enzym chất độc Chúng có tác dụng ức chế kích thích sinh trưởng cây, ... viêm; trình lÃo hoá thể Trong số chất chống oxy hoá công nhận rộng rÃi có thĨ kĨ ®Õn: Vitamin E +Selen, Vitamin C, Vitamin A (dưới dạng -caroten tốt nhất) Tác dụng chống oxy hoá chất đà chứng minh... đă tìm hoạt chất có giá trị Nhiều thuốc thuốc dân gian truyền từ đời sang đời khác, làm sáng tỏ chế tác dụng chữa bệnh nhờ kết nghiên cứu hoá thực vật hoạt tính sinh học Nhờ mà chúng sử dụng cách