MÔ TẢ VÀ PHÂN BIỆT CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ( LAI TRONG DUNG DỊCH, LAI TRONG PHA RẮN, LAI TẠI CHỖ )

Bộ Giáo Dục Và Đào Tạo TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MÔ TẢ VÀ PHÂN BIỆT CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ( LAI TRONG DUNG DỊCH, LAI TRONG PHA RẮN, LAI TẠI CHỖ ) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: San Trâm Anh Bạch Vũ Hoàng - 1911100344 Bùi Phương Linh - 1911100515 Diệp Trần Việt Khoa - 1911100349 Đặng Quốc Cường - 1911100237 Lớp: 19DSHA1-Nhóm11 TP HỒ CHÍ MINH - 2021 Mục Lục NỘI DUNG I CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ .5 Khái niệm “nhiệt độ nóng chảy” DNA Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” DNA .5 Khái niệm lai phân tử .6 Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử II CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ Lai pha lỏng .7 a Nguyên tắc b Phân tích định lượng phân tử lai: có phương pháp thường dùng c Các ứng dụng phương pháp lai dung dịch: Lai pha rắn a Nguyên tắc b Ứng dụng phương pháp lai pha rắn: .9 Các bước thực Northern Blot 14 Lai chỗ 20 a Nguyên tắc 20 b Ứng dụng phương pháp lai 20 III TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP LAI 23 Kết luận chung tầm quan trọng: .24 NỘI DUNG I II CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ Khái niệm “nhiệt độ nóng chảy” DNA Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” DNA Khái niệm lai phân tử Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ Lai pha lỏng a Nguyên tắc b Phân tích định lượng phân tử lai  Phương pháp quang phổ kế  Phương pháp đùng NUCLEASE S1  Phương pháp sắc ký HYDROXYLAPATITE c Các ứng dụng phương pháp lai dung dịch: Lai pha rắn a Nguyên tắc b Ứng dụng phương pháp lai  Southern Blot  Northern Blot  Western Blot  Dot (slot) Blot Lai chỗ a Nguyên tắc b Ứng dụng phương pháp lai  Lai nhiễm sắc thể  Lai khuẩn lạc  Lai tế bào mô III TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP LAI I CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ Khái niệm “nhiệt độ nóng chảy” DNA Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) mạch tách rời phá vỡ liên kết hydro nối liền mạch Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” DNA  Ảnh hưởng thành phần base phân tử DNA Do số lượng liên kết hidro A T, G C không (A=T; G C) nên thành phần base cấu tạo DNA mạch đơi có ảnh hưởng quan trọng cho bền vững phân tử này, đặc biệt tỷ lệ base G, C Trong điều kiện chuẩn, Tm đánh giá công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C)  Ảnh hưởng độ dài đoạn DNA Đọan DNA dài số lượng liên kết hidro nối mạch lớn nhiêu “nhiệt độ nóng chảy” cao Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA tính theo cơng thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base Công thức cho thấy ảnh hưởng độ dài quan trọng đoạn DNA ngắn Điều kết tính “hợp tác” đề cập phần  Ảnh hưởng điểm bắt cặp sai lệch Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) làm giảm tính ổn định phân tử lai Thơng thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho 1% phần trăm bắt cặp sai lệch Nhưng thành phần base, mismatch có ý nghĩa thực tiễn đoạn DNA ngắn Khái niệm lai phân tử - Sau hai mạch phân tử DNA tách rời tác động Tm, bắt cặp không xảy nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột - Lúc phân tử DNA tồn mơi trường dạng mạch đơn cấu hình khơng gian vô trật tự Ngược lại, sau hai mạch tách rời, nhiệt độ giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại  Hiện tượng gọi lai phân tử (molecular hybridization) Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử  Nồng độ DNA thời gian phản ứng: - Nồng độ DNA, nghĩa số lượng trình tự bổ sung, cao xác suất tiếp xúc với tăng  tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên - Thời gian phản ứng dài xác suất tiếp xúc lớn số lượng phân tử lai tăng dần toàn trình tự bổ sung tái bắt cặp  Nhiệt độ: Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại nhiệt đố thấp Tm nucleic acid độ 25%  Độ dài trình tự: Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với bậc độ dài trình tự bổ sung  Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tằng tốc độ phản ứng lên từ đến 10 lần Nồng độ NaCl vượt 1,2M lại hồn tồn khơng cịn tác dụng II CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ Lai pha lỏng a Nguyên tắc - Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm môi trường lỏng dung dịch đệm - Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ b Phân tích định lượng phân tử lai: có phương pháp thường dùng  Phương pháp dùng quang phổ kế DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu DNA mạch đơn Sự chuyển từ DNA mạch đôi sang dạng mạch đơn xác định thông qua giá trị mật độ quang (OD) bước sóng 260nm Giá trị mật độ quang tăng lên phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn – tượng gọi “hiệu ứng siêu sắc” “Hiệu ứng siêu sắc”: nhuộm tím phân tử DNA, đem chúng đun nóng lên làm lạnh từ từ kết phân tử DNA trở nên tím đậm lúc đầu chút Nếu hạ nhiệt độ cách đột ngột chúng trở nên đậm tượng mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh DNA mạch đôi  Phương pháp dùng Nuclease S1 Nuclease S1 enzyme có khả thủy giải nucleic acid mạch đơn DNA hay RNA Dung dịch phản ứng lai trích phần, đem xử lý với Nuclease S1 Các mạch đơn bị thủy giải, sản phẩm phản ứng oligonucleotides nhóm nucleotide 5’ phosphoryl Các nuleic cịn lại thu nhận qua phương pháp tủa đem định lượng  Phương pháp sắc kí hydroxylapatite Hydroxylapatite tinh thể phosphate calci Kĩ thuật sử dụng mồi đánh dấu để lai với DNA, RNA với protein tế bào mà không cần tách chiết Sau hỗn hợp bị đốt nóng, chúng làm lạnh để mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp ủ khoảng 120h 60oC dung dịch đệm Natri phosphate Nhiệt độ quan trọng nhiệt độ thấp, bắt cặp sai lệch thường xuyên Tại 60oC, DNA bắt cặp với mạch bổ sung đa số base đủ cho mạch kép bền vững nhiệt độ Kế tiếp, mẫu thể lai mạch đôi khác tạo thành đặt vào cột hydroxylapatite dìm chậu nước 55oC Khi thể lai tan chảy, rửa cho vào lọ xác định Cuối cùng, đường cong tan chảy vẽ với kết thí nghiệm c Các ứng dụng phương pháp lai dung dịch:  Tính tỉ lệ % trình tự giống lồi gần Việc lai DNA đo mức độ tương đồng DNA loài khác Những DNA lai tương đồng nhiều tan chảy nhiệt độ cao Kĩ thuật cho thấy người tinh tinh mang DNA giống nhiều so với DNA đười ươi hay khỉ đột  Phân tích trình tự lặp lại Trong trình tự DNA, trình tự lặp lại nhiều lần có nhiều may gặp mạch bổ sung so với trình tự Bộ gene Eukaryote có trình tự lặp lại cao Prokaryote  So sánh kích thước gen khơng chứa trình tự lặp lại Ở Prokaryote, gene khơng chứa trình tự lặp lại nên động học lai tất trình tự Tính chất sử dụng để so sánh kích thước gene loài sinh vật Prokaryote  Ưu điểm: hiệu trình lai cao, trình phân tích định lượng phân tử lai xác  Nhược điểm: quy trình làm phức tạp, khó thực hiện; khó tách phân tử lai khỏi trình; xảy tái bắt cặp hai mạch phân tử Lai pha rắn a Nguyên tắc - Cùng nguyên tắc với lai pha lỏng - Điểm khác biệt trình tự bổ sung (trình tự đích, trình tự cần tìm) cố định giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon)  Ưu điểm: + Thao tác dễ dàng + Tách trực tiếp DNA hay RNA gốc dung dịch thuốc thử + Ngăn tái bắt cặp mạch phân tử  Nhược điểm: + Phân tích định lượng phân tử lai xác + Hiệu thấp + Vận tốc lai pha rắn < 10 lần so với vận tốc lai pha lỏng phần nucleic acid cố định giá thể bị che khuất, khơng tiếp xúc với trình tự bổ sung b Ứng dụng phương pháp lai pha rắn: - Lai pha rắn có nhiều ứng dụng, có phương pháp là:  Southern Blot  Northern Blot  Western Blot  Dot (slot) Blot - Nổi bật lên phương pháp sử dụng rộng rãi phương pháp Southern Blot, Northern Blot Dot Blot SOUTHERN BLOT : Mục đích : Phương pháp dùng để định vị trình tự đặc biệt DNA gen, hay DNA kích thước nhỏ DNA plasmid, phage,… - Cơ sở phương pháp kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai Southern mô tả năm 1975  Các ứng dụng quan trọng Southern Blot: - Lập đồ giới hạn gen - Phát đa dạng trình tự (fragment polymorphism) gen chủng hay cá thể khác qua so sánh đồ giới hạn chúng - Phát đột biến đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp gen chúng làm thay đổi đồ giới hạn Các bước thực Sounthern blot 1) Hỗn hợp đoạn DNA mạch đôi tạo xử lý DNA enzyme cắt đặc hiệu tách theo độ dài điện di gel 2) Một nitrocellulose nylon đặt lên gel, tờ giấy thấm đặt lên Toàn đặt lên lớp bọt biển dd alkali Các đoạn DNA tách rời chuyển lên nitrocellulose (hoặc nylon) blotting: dd đệm hút lên qua gel → nitrocellulose → giấy thấm, mang theo đoạn DNA Khi di qua nitrocellulose, đoạn DNA giữ lại bám chặt 3) Bản nitrocellulose gỡ cẩn thận khỏi lớp gel 4) Bản đặt vào túi nhựa dán kín chứa dd đệm với đoạn đầu dị phóng xạ DNA có trình tự đặc hiệu mong muốn Túi sau để điều kiện thích hợp cho lai 5) Bản lấy khỏi túi rửa sạch, có đầu dị lai với DNA giữ lại Sau chiếu tia X, DNA lai với đầu dò cho băng ảnh 10 NORTHERN BLOT : - Mục đích: nhằm xác định kích thước hàm lượng mRNA đặc trưng hỗn hợp RNA Các bước thực Northern Blot 11 Bước 1: tách chiết biến tính  Tách chiết RNA khỏi tế bào  Tiến hành điện di hỗn hợp RNA vừa tách gel agarose  Làm biến tính dải băng RNA gel nhờ dd formaldehyde Bước 2: thẩm tích Chuyển mRNA lên màng lai nitrocellulo nilon filte Dựa nguyên tắc mao dẫn: Đệm từ phía thấm cách tự nhiên lên chuyển mạch DNA từ gel lên màng bám chặt vào màng Bước 3: lai với mẫu dị (probe) có đánh dấu phóng xạ - Ủ màng lai với mẫu dị (probe) có gắn đồng vị phóng xạ, chất phát huỳnh quang - DNA cố định màng lai kết hợp Probe theo nguyên tắc bổ sung Bước 4: phóng xạ tự chụp     Rửa trôi probe không gắn Làm khơ Cho chụp phóng xạ tự động Phát số lượng vị trí nhờ phim phóng xạ tự ghi hiển thị huỳnh quang 12 WESTERN BLOT: - Protein sau chiết tách điện di polyacrylamide gel chuyển lân màng nitrocellulose - Protein cố định màng tạo vệt (blot) thăm dị (probe) nhờ sử dụng kháng thể - Trước thăm dị, vị trí cịn trống màng trám protein để ngăn cản tượng gắn không đặc hiệu kháng thể lên màng - Sau loại kháng thể (primary antibody) có kháng ngun protein xác định thêm vào kháng thể gắn lên vệt protein màng - Một kháng thể khác (secondary antibody) có mang lọai enzyme bắt cặp với khácg thể ban đầu, enzyme phản ứng với chế đặc hiệu tạo sản phẩm kết tủa có màu vị trí phức hợp kháng nguyên - kháng thể 13 Chuẩn bị mẫu protein: protein tách chiết từ mẫu tế bào, mẫu mô định lượng Điện di Gel mỏng SDS-PAGE (Electrophoresis) Các phân tử protein phân tách trình điện di gel polyacrylamide với có mặt sodium dodecyl sulfate (SDS) SDS biến protein từ cấu trúc bậc thành cấu trúc bậc đồng thời giúp protein mang 14 điện tích âm Do đó, điện cực dương kéo protein mang điện tích âm di chuyển gel, protein có trọng lượng phân tử thấp di chuyển nhanh ngược lại protein có trọng lượng phân tử cao di chuyển chậm Di chuyển lên màng Sinh học (Blotting) Protein di chuyển từ gel sang màng sinh học có cấu tạo từ nitrocellulose (NC) từ polyvinylidene difluoride (PVDF) Protein bám màng nitrocellulose nhờ tương tác kỵ nước Còn màng PVDF cần phải ngâm với methanol trước sử dụng để hoạt hóa nhóm điện tích dương màng, nhờ protein mang điện tích âm bám vào mang sau q trình thẩm tích Phát protein đích (Detection) Tín hiệu phân tử protein đích xác định thơng qua phương pháp trực tiếp việc sử dụng kháng thể sơ cấp có tích hợp với chất xúc tác sinh học (enzyme) Tín hiệu phân tử protein đích biểu vạch tín hiệu, thông qua phim X-quang (X-ray film) hệ thống cảm biến máy tính Cường độ vạch tín hiệu phân tử protein đích biểu film X-quang xử lý thông qua hệ thống máy tính cung cấp thơng tin có mặt có phân tử protein đích hỗn hợp hay khơng, lượng protein đích hỗn hợp hay nhiều Ngồi ra, để đảm bảo độ xác so sánh cường độ tín hiệu protein đích với protein khác, số loại protein đối chứng dùng phổ biến Actin, GAPDH, Tubulin, Porin, Histone 2B, PCNA 15 ĐIỂM KHÁC NHAU CỦA PHƯƠNG PHÁP DOT VÀ SLOT BLOT: Mục đích: định lượng tương đối cho RNA đặc trưng hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng Phương phá sử dụng cho RNA Trong phương pháp người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp lượng mẫu nhỏ lên màng lai (thành điểm Dot hay khe Slot) Quá trình lai phân tách phân tử lai giống đề cập phần Bản phóng xạ tự ghi sau phân tích kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng 16 phân tử lai có mẫu Trong thục nghiệm, người ta sử dụng dụng cụ (tên manifold) cho phép đặt lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai 17 Lai chỗ a Nguyên tắc - Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern blot - Kỹ thuật sử dụng mồi đánh dấu (đoạn nucleotide kháng thể) để lai với ADN, ARN với protein tế bào mà không cần tách chiết Ứng dụng: định vị gen NST, phát dòng vi khuẩn tái tổ hợp, nghiên cứu RNA chuyên biệt tế bào mô b Ứng dụng phương pháp lai LAI TRÊN NGHIỄM SẮC THỂ  Các NST giai đoạn trung kì xử lí kỹ thuật tế bào học lame.   NST cố định lame đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ  Để phát phân tử lai, người ta phủ lên lame mô ̣t huyền dịch (emulsion) nhạy cảm với tia xạ  Sau mô ̣t thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame quan sát kính hiển vi, kết thể thành hạt nằm lớp huyền dịch vị trí có phân tử lai LAI TRÊN KHUẨN LẠC  Mỗi khuẩn lạc để lại vài tế bào vi khuẩn màng lai  Màng lai xử lí NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn làm biến tính DNA  Cố định DNA màng tiến hành phương pháp lai phương pháp lai pha rắn khác  Kết phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm hộp petri ban đầu Dịng thu nhận phân tích 18 LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MƠ Mục đích: Trong tế bào mơ, RNA, đặc biệt mRNA có phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian liên quan đến chức điều hòa tương tác mRNA với thành phần khác tế bào mô Để nghiên cứu mRNA tách chiết tinh không cho phép thu nhận thông tin vừa kể, người ta dùng phương pháp lai tế bào mô Nghiên cứu RNA tách chiết tinh không cho phép thu nhận thông tin vừa kể  sử dụng pp lai tế bào mô Mô xử lí phương pháp mơ học (cố định, khử nước, tẩm parafin, cắt lát mỏng từ – 10 µm, trải lam) Kết đọc trực tiếp lame nhờ kính hiển vi 19 III TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP LAI Nguyên tắc Phương pháp sử dụng phổ biến Ứng dụng Lai pha lỏng Lai pha rắn Lai chỗ - Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm mơi trường lỏng dung dịch đệm - Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ mơi trường thấp Tm vài độ - Giống pha lỏng điểm khác biệt trình tự bổ sung (trình tự đích, trình tự cần tìm) cố định giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon) - Vì vận tốc lai pha rắn gấp 10 lần vận tốc lai pha lỏng - Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern Blot - Kỹ thuật sử dụng mồi đánh dấu (đoạn nucleotide kháng thể) để lai với DNA, RNA với protein tế bào mà không cần tách chiết - Phương pháp dùng quang phổ kế - Phương pháp dùng Nuclease S1 - Phương pháp sắc kí hydroxylapatite - Southern Bot - Northern Blot - Western Blot - Dot (slot) Blot - Lai khuẩn lạc - Lai nhiễm sắc thể - Lai tế bào mô - Tính tỉ lệ % trình tự giống lồi gần - Phân tích trình tự lặp lại - So sánh kích thước gen khơng chứa trình tự lặp lại - Lập đồ giới hạn gen - Phát đa dạng trình tự (fragment polymorphism) gen chủng hay cá thể khác qua so sánh đồ giới hạn chúng - Phát đột biến đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp gen chúng làm thay đổi đồ giới hạn - Định vị xác vị trí phân bố mRNA nhóm tế bào chuyên biệt tổ chức - Xác định mối tương qua hoạt động phiên mã dịch mã gen - Xác định vị trí, phân bố tương tác mRNA tham gia vào trình sống 20 Kết luận chung tầm quan trọng: - Lai xuyên lồi - So sánh kích thước gen khơng chứa trình tự lặp lại - Lập đồ giới hạn gen, phát đột biến - Tìm hiểu phân bố mRNA, ảnh hưởng đến chức năng, điều hòa biểu tương tác chúng đến thành phần khác tế bào mô 21 CÂU HỎI QUIZIZZ 22 23 ... pháp lai dung dịch: Lai pha rắn a Nguyên tắc b Ứng dụng phương pháp lai  Southern Blot  Northern Blot  Western Blot  Dot (slot) Blot Lai chỗ a Nguyên tắc b Ứng dụng phương pháp lai  Lai nhiễm... tìm) cố định giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon) - Vì vận tốc lai pha rắn gấp 10 lần vận tốc lai pha lỏng - Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern Blot - Kỹ thuật sử dụng mồi đánh dấu (? ?oạn... phân tử lai có mẫu Trong thục nghiệm, người ta sử dụng dụng cụ (tên manifold) cho phép đặt lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai 17 Lai chỗ a Nguyên tắc - Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern