Định lượng Bacillus cereus

Định lượng Bacillus cereus CHƯƠNG I GIỚI THIỆU BACILLUS CEREUS 1.1 Đặc điểm Bacillus cereus B.cereus trực khuẩn kỵ khí, gram dương, rộng khoảng μm, dài khoảng 3-4μm, có khả sinh nha bào, bào tử dạng hình ovan sống sót xử lý nhiệt hóa chất, chúng có khả thích nghi với loạt điều kiện mơi trường, phân phối rộng rãi tự nhiên bụi, đất, loài động vật khác nhau, thường thấy hạt ngũ cốc, gạo, bột thực phẩm khô lẫn lộn chung với gạo, mì, khoai, ngụ bị nhiễm từ đất trình trồng trọt thu hoạch Vi khuẩn không tạo giáp mô, khả di động theo phân loại quốc tế thuộc giới bacteria, ngành (phylum) firmicute, lớp (Class) Bacilli, (Order) Bacillales, họ (Family) Bacillaceaem ,chi (Genius) Bacillus, loài (Species) Cereus.Trong chi bacillus ngồi lồi cereus cịn có số loài như: Bacillus subtilis Bacillus coagulans Bacillus thuringiensis Bacillus natto Paenibacillus larvae Bacillus cereus loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả sinh nha bào, phát ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955 từ năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm Bacillus cereus phát báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, thực tế số lớn nhiều SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus Hình 1.1 Bacillus cereus kính hiển vi Hình 1.2 Bacillus cereus thạch máu cừu Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mộc Hiếu khí kị khí tùy nghi Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC PH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2 Trên môi trường NA hay TSA sau 24 tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì Trên mơi trường BA tạo dung huyết rộng Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanhcó vịng sáng Trên mơi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanhcó vịng sáng Trên mơi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn 1.2 Tính chất sinh hóa Trên mơi trường đường: Lên men glucose điều kiện hiếu khí kị khí, khơng lênmen mannitol SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus Khử nitrat thành nitrit Phản ứng VP (+) Phân giải Tyroxin Catalase (+), Citrate (+) Mọc NB + 0,001% lyzozym1.Tính chất gây bệnh Độc tố-Triệu chứng: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều tự nhiên, nhiễm vào loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm Tính chất gây bệnh- Độc tố-Triệu chứng:Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều tự nhiên, nhiễm vào loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm CHƯƠNG II: ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS 2.1 Giới thiệu chung độc tố Bacillus cereus B.cereus gây bệnh sinh độc tố, B.cereus gây ngộ độc thức ăn sinh loại độc tố bao gồm  Độc tố ly giải hồng cầu (Hbl), có khoảng 60% số chủng B.cereus xem yếu tố gây độc B.cereus chế hoạt động nội SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus độc tố chưa biết rõ Độc tố gây ly giải hồng cầu có thành phần protein B, L1, L2, protein mã hóa bởi gen nheA, nheB, nheC  Độc tố ruột không ly giải hồng cầu (Nhe) độc tố có chất protein thành phần hầu hết chủng B.cereus sinh ra, với thành phần tương tự Hbl ; Độc tố khụng gõy ly giải hồng cầu BL có protein liên kết B mã hóa gen hblA, protein ly giải L1 L2 mã hóa gen hblC hblD Tất hoạt động Hbl cần loại protein  Độc tố T(BceT): độc tố có hoạt động sinh học tương tự Nhe có chất protein thành phần  Độc tố FM (EntFM) độc tố có chất protein thành phần với vai trị đặc tính chưa biết đến  Nội độc tố K (CytK), loại độc tố giống độc tố beta vi khuẩn Clostridium perfring CytK gần đõy phát khoảng 85% số chủng B.cereus  Độc tố gây nơn (Emetictoxin) Độc tố có tên cereulide hình thành trước thực phẩm, nguyên nhõn hội chứng nôn, chất dodecadepsipeptide có vịng acid amin với phân tử lượng 1,2 kDa và/ oxy acid [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] lặp lặp lại lần, bền với nhiệt, pH phân giải protein: hoạt động nhiệt độ 121 0C, có khả chịu điều kiện axit, độc tố gõy nôn phát triển tốt thức ăn từ cơm, khoai tây nghiền, thực phẩm có nhiều tinh bột rau Vì ngộ độc thực phẩm B.cereus khơng phải loại bệnh nói đến nhiều, thật phạm vi ảnh hưởng loại bệnh biết đến, báo cáo nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chiếm khoảng 33% tổng số nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số nguyên nhân vi rút) Norway (1988-1993), 47% SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus Iceland (1985-1992) Tỷ lệ thấp nhiều báo cáo quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) Canada (2.2%) Ở Anh vàxứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995 B cereus thực vật hoại sinh đất phổ biến Nó phân lập từ nhiều nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, từ thịt, sản phẩm từ thịt cá Phát mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm từ năm 1949 Hauge phân lập mẫu từ xốt vani sau có ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy bệnh viện Oslo, Norway Xốt vani nấu trước tiêu thụ bảo quản nhiệt độ phòng sử dụng Để khẳng định B cerus nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106 ml-1 uống 200ml cocktail Sau 13h, ông cảm thấy đau bụng tiêu nhiều nước, triệu chứng dai dẳng khoảng 8h Hơn 20 năm sau,một triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác chủng B cereus gây lại xuất công nhân người Anh Triệu chứng nặng triệu chứng nôn mửa kéo dài thời gian ngắn(chưa đến 5h), điều cho thấy nhiễm độc Ngày nay, bệnh liên quan đến triệu chứng gây nôn mửa B.cereus Bacillus cereus gây nhiễm trùng nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó,những ngộ độc khác B.cereus gây nhiễm trùng máu, viêm màng não, nhiễm trùngmắt Hai loại ngộ độc thực phẩm nguyên nhân nhiều nhấn tố gây độc hại khác Bệnh nôn mửa mô tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), nguyên nhân gây ngộ độc chuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) hình thành trước thực phẩm (ví dụ Gạo) Triệu chứng bao gồm buồn nôn, nôn mửa đau dày) Bệnh tiêu chảy mô tả với thời kỳ ủ bệnh từ – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, tiêu nhiều nước đau thắt trực tràng Nguyên nhân triệu chứng sản sinh độc tố đường ruộttrong thời kỳ sinh trưởng B.cereus ruột non từ việc ăn vào bụng tế bào hay bào tử vi khuẩn SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus Thông thường hai triệu chứng tương đối nhẹ, kéo dài 24h khơng phải ln ln địi hỏi phải dùng thuốc Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu chảy xảy ra, nguyên nhân có lẻ tế bào biểu mô chiếm đa số ruột non bào tử B.cereus sinh sôi nảy nở sản sinh độc tố đường ruột Bacillus cereus biết nguyên nhân gây hai loại ngộ độc thực phẩm, triệu chứng nôn mửa triệu chứng tiêu chảy Phần lớn ngộ độc Bacillus cereus gây phát sau Cereulide biết đến với cấu trúc bậc 1, với dodecadepsipeptide tuần hoàn, với 12 góc lập thể trung tâm Hóa học lập thể từ sản phẩm thủy phân dipeptide kiềm tính, D-O-Leu, D Ala, L-O-Val L-Val Đó ion Kali mạnh, liên kết yếu với ion Li + , ion Na+, ion Cs+, với ion Rb+ lại liên kết mạnh nhất, ion kim loại kiềm nào.Độc tố nguyên nhân dẫn đến hình thành ty lạp thể có chứa ATP enyme liên quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào mơ khác Chúng ta bắt đầu quan tâm đến đường sinh tổng hợp độc tố cho chương trình phòng chống ngộ độc thực phẩm tương lai Nghiên cứu trình sinh tổng hợp tương tự dodecadepsipeptide, valinomycin Agata – nhiều tác giả nghiên cứu trình phát triển sinh độc tố bacillus cereus trình tổng hợp trung gian cách đầy đủ từ CADM (hỗn hợp amino acid) đường sucrose (đường mía) Người ta nhận thấy rằng, Bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh cereulide cấu trúc bậc amino acid Val, Leu Thr cần thiết Những nghiên cứu khác q trình sinh tổng hợp cereulide có lẽ cần thiết để thúc đẩy việc nghiên cứu tìm phương pháp ngăn chặn ngộ độc từ thực phẩm Xét đoán từ cấu trúc 1, tiền thân D-Ala, L-O-Val D-O-Leu lien quan đến amino acid L-Ala, LVal, L-Leu 2.2 Ngộ độc thực phẩm SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus Ngộ độc thực phẩm gây B.cereus thực phẩm chuẩn bị mà không giữ điều kiện lạnh vài trước sử dụng Thực phẩm chứa vi khuẩn mật độ 106 tế bào/g đủ gây ngộ độc Các triệu chứng ngộ độc B.cereus thường nhẹ nhanh chóng hồi phục, nhiều tác giả khác đề cập tới với hai dạng ngộ độc : + Dạng thứ nhất: Xảy nhanh, buồn nôn, nôn, tiêu chảy thường xuất vòng sau ăn phải thức ăn bị ô nhiễm độc tố B.cereus, thể nhẹ bình phục vịng 12-24 + Dạng thứ hai: Tiêu chảy thường xảy sau 8-16 sau ăn phải thức ăn bị nhiễm độc tố B.cereus, thể thơng thường thường khơng cấp tính, 1-2 ngày sau ăn phải thức ăn ô nhiễm B.cereus thấy lượng lớn B.cereus mẫu phân, bình phục chất nhanh chóng tiết khỏi thể Nguyên nhân triệu chứng sản sinh độc tố đường ruột thời kỳ sinh trưởng B.cereus ruột non từ việc ăn vào bụng tế bào hay bào tử vi khuẩn Thông thường hai triệu chứng tương đối nhẹ, kéo dài 24h khơng phải ln ln địi hỏi phải dùng thuốc Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu chảy nặng xảy ra, nguyên nhân có lẽ tế bào biểu mô chiếm đa số ruột non bào tử B.cereus sinh sôi nảy nở sản sinh độc tố đường ruột Mức độ biến đổi liều gây nhiễm khả sản sinh độc tố đường ruột khác tính nhạy cảm cá nhân khác Mặc dù xảy nhiều vụ ngộ độc thực phẩm mà nguyên B.cereus chưa có cơng bố tình hình ngộ độc thực phẩm B.cereus gây Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu nhằm xác định thực trạng ô nhiễm vi khuẩn thực phẩm Các giám sát tình trạng ô nhiễm thực phẩm năm vừa qua chủ yếu tập trung vào việc đánh giá thực trạng ô nhiễm thực phẩm với E.coli, staphylococus, vibrio… SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus Việt Nam quốc gia có khí hậu nóng ẩm điều tạo điều kiện thuận lợi cho B.cereus phát triển thực phẩm giải phóng độc tố, ý thức người dân chưa đầy đủ đặc biệt việc sử dụng nhiều sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm B.cereus không nhỏ Việt Nam Các vụ ngộ độc thực phẩm B.cereus gặp nước phát triển phát triển Thức ăn nhiễm độc B.cereus khái niệm phổ biến khắp giới Q trình nấu chín khơng tiêu diệt vi khuẩn B Cereus có khả tạo thành dạng bào tử để tự vệ, ăn sau khinấu bào tử khơng có hội phục hồi, điều kiện bảo quản không sau nấu bào tử nảy mầm, tạo thành tế bào sinh dưỡng nhân lên Đặc biệt cơm nhiễm B.cereus biểu khác thường mùi vị, màu sắc nên nhận biết, nhiều trường hợp ngộ độc cơm nguội lại lại nghĩ đến nguyên nhân ngộ độc loại thức ăn khác B Cereus có khả sản sinh nhanh phát triển nhiều loại thực phẩm khác như: rau sống, giá đỗ, bơ sữa Đây mối lo ngại vệ sinh, an toàn thực phẩm cho nhiều quốc gia giới Vì việc nghiên cứu dịch tễ, chế bệnh sinh, độc tố B.cereus ngày trọng B.cereus lần Frankland phân lập mô tả năm 1887 Tuy nhiên, tận năm 1950, vi khuẩn Hauge cộng chứng minh nguyên gây vụ dịch ngộ độc thức ăn Các vụ dịch ngộ độc thức ăn B.cereus với đặc điểm nôn tiêu chảy Để khẳng định B.cereus nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge phỏt triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x10 6/ml uống 200ml cocktail Sau 13 giờ, ông cảm thấy đau bụng tiêu nhiều nước, triệu chứng dai dẳng khoảng Hơn 20 năm sau, triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác chủng B cereus gây lại xuất cỏc cụng nhân người Anh Triệu chứng nặng triệu chứng nôn mửa kéo dài thời gian ngắn (chưa đến giờ), điều cho thấy nhiễm độc SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus CHƯƠNG III: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.1 Phương pháp phân tích truyền thống  Ưu nhược điểm - Ưu điểm:  Không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền - Nhược điểm:      Độ nhạy không cao Yêu cầu kỹ thao tác Tốn nhiều hóa chất Thời gian phân tích lâu Tốn nhiều nhân cơng SVTH: Nhóm 07 Trang Định lượng Bacillus cereus 25 Các đặc tính Bacillus nhóm SVTH: Nhóm 07 Trang 10 Định lượng Bacillus cereus 3.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc Mẫu Đồng mẫu Phân lập Khẳng định Đếm số khuẩn lạc điển hình Nhuộm Gram Test sinh hóa  Cách tính kết quả: Mật độ (CFU/ml)=A1 x D1 /V : Số khuẩn lạc trung bình/đĩa : Độ pha lỗng V : Dung tích huyền phù tế bào cho vào đĩa (ml) 3.1.2 Phương pháp MPN SVTH: Nhóm 07 Trang 11 Định lượng Bacillus cereus Mẫu pha lỗng vào peptone đệm ống mơt trường TSP Chọn ống đục cấy sang MYP ủ 30oc/2448h Chọn khóm hồng có vịng sáng TSA có thạch nghiên Nhuộm Gram, thử sinh hóa Tra bảng MPN 3.1.2.1 Các thử nghiệm phân biệt lồi Bacillus nhóm  Thử nghiệm tín di động; Hầu hết chủng B.cereus;B.thuringgensis di động, B.anthracis, B.mycoides không di động  Sự hình thành rễ giả: B.cereus khơng tạo cấu trúc rễ giả, B.Mycoides tạo cấu trúc rễ giả  Thử nghiệm làm tan máu: B.cereus làm tan máu mạnh, tao vùng tan máu hồn tồn (β) 2-4µm, B.thuringiensis B.mycoides làm tan máu, B.anthracis thường không làm tan máu 24h SVTH: Nhóm 07 Trang 12 Định lượng Bacillus cereus  Sự tạo độc tố proterin dạng tinh thể: B.thuringiensis tạo tinh thể độc tố, B.cereusvà Bacillus khác không tạo tinh thể độc tố Tiêu chuẩn vi sinh cho phép thực phẩm Bộ y tế 4/1998 Nhóm thực phẩm Nhóm thịt  Thịt tươi, thịt đơng xay nhỏ, thịt nghiền,thịt chế biến  Sản phẩm chế biến từ thịt : thịt hun khói, pate, xúc xích Sant phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ:  Cần xử lý nhiệt trước dung: Bột miến, mì sợi  Dùng trực tiếp không xử lý nhiệt: Bánh bột Nhóm thức ản khơ chứa dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay đặc biệt  Phải xử lý nhiệt trước sử dụng  Dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt Giới hạn cho phép (CFU/g CFU/ml thực phẩm) B.cereus 102 10 102 10 10 10 3.2 Phương pháp đại :  BCET-RPLA (B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination)  BDE-ELISA ( Bacillus Diarheal Enterotoxin Visual Immuno Assay)  PCR 3.2.1 Phương pháp RPLA SVTH: Nhóm 07 Trang 13 Định lượng Bacillus cereus  Nguyên tắc: Phương pháp LA ( latex agglutination) Phương pháp RPLA ( Reverse Passive Latex Agglutination) t Kh hể Kháng nguyên dạng hạt Bộ kít BCET-RPLA : Hạt latex tụ lại 3.2.2 Phương pháp ELISA :  Nguyên tắc phương pháp Elisa SVTH: Nhóm 07 Trang 14 Định lượng Bacillus cereus SVTH: Nhóm 07 Trang 15 Định lượng Bacillus cereus Bộ BDE-Tecra kit tes 3.2.3 Phương pháp PCR:  B.cereus PVR kit test ( Takara): xét nghiệm loại gen o CRS (cereulide-emetic toxin) B.cereus o LE (lecithinase ezyme gen ) loài Bacillus Chuẩn bị mẫu Phản ứng PRC lặp lại 40 lần Chu kỳ bắt đầu 40oC/30s 55oC/30s 72oC/30s Chạy điện di SVTH: Nhóm 07 Trang 16 Định lượng Bacillus cereus CHƯƠNG IV: ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 4.1 Định nghĩa nguyên tắc B.cereus trực khuẩn, gram dương, hiếu khí kỵ khí tuỳ ý, di động tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP(+), có khả sử dụng nitrate Lồi có khả tăng trưởng nhiệt độ khoảng từ – 50C, tối ưu 35 - 40C; pH dao động từ 4.5 – 9.3, dễ dàng tạo bào tử bào tử nảy mầm dễ dàng Trên mơi trường chọn lọc lồi tạo khuẩn lạc to, mọc lăn, rìa nhăn Vi khuẩn hiễn diện đất, bụi, loại thực phẩm ( sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khơ…) Vi khuẩn tiết loại độc tố diarrhoeal toxin gây tiêu chảy emetic toxin gây nơn mửa Lồi phân biệt với loại khác Bacillus nhóm B.anthracis, B.thuringiensis, B.mycoides, Bmegaterium B.cereus phát định lượng môi trường thạch chọn lọc Mannitol – Egg Yolk-Polymcin (MYP) Cereus Selective Agar( MOSSEL), Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA) Khuần lạc B.cereus có hình thái đặc trưng mơi trừơng Các khuần lạc tiếp tục khẳng định dựa thử nghiễm sinh hoá với đặc diểm lên men đường glucose sinh acid điều kiện kỵ khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP(+), thuỷ phân L-tyrosine, tăng SVTH: Nhóm 07 Trang 17 Định lượng Bacillus cereus trưởng 0,001% lysozyme Ngoài B.cereus định lượng phương pháp MPN 4.2 Mơi trường hố chất - Nước pepton đệm Buffered Peptone Water (BPW) - Thạch Mannitol – Egg Yolk-Polymycin(MYP) - Thạch Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar(PEMBA) - Môi trường thạch Cereus Seletive Agar (MOSSEL) - Nhũ lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50% - Canh Trypticase Soy Polymyxin (TSP) - Canh Phenol Red Glucose - Thạch Tyrosine - Canh Lysozyme - Môi trường thử nghiệm Voges-Prokauer - Canh nitrate Broth - Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar cho B.cereus - Thạch máu Tryticase Soy Sheep - Môi trường kiểm tra di động - Thuốc thử nitrate ( dd A, dd B ) - Hoá chất nhuộm Gram 4.3 Quy trình phân tích SVTH: Nhóm 07 Trang 18 Định lượng Bacillus cereus - Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 25ml môi trường pepton đệm (BPW) đồng để có độ pha lỗng 10-1, đồng Stomacher phút Mẫu tiếp tục pha lỗng thành dãy thập phân để có độ pha lỗng thích hợp 4.3.1 Quy trình định lượng B.cereus phương pháp đếm khuẩn lạc Cân 25g mẫu, đồng 25ml PBW, đồng Stomacher, độ pha loãng 10-1 Pha loãng đến độ pha loãng 10-2, 10-3 Trải 0.1ml độ pha lỗng lên mơi trường thạch MYP, ủ 24h 30oC Chọn từ khuẩn lạc (+)màu hồng cấy sang thạch nghiêng MYP để chuẩn bị cho phản ứng khẳng định ủ 24h 30oC Nhuộm Gram thử nghiệm sinh hóa như: lên men Glocose, thử nghiệm VP, khả sinh nitrate… SVTH: Nhóm 07 Trang 19 Định lượng Bacillus cereus 4.3.1.1 Phát môi trường chọn lọc Trải 0.1ml độ pha lỗng lên mơi trường thạch MYP, ủ 24h 30 oC Do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase kháng polymycin nên môi trường khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, bao quanh vùng có tủa chứng tỏ lecithinase tạo thành Trường hợp sử dụng môi trường MOSSE, khuẩn lạc B.cereus to, màu hồng, xung quanh có vịng sáng Chọn từ khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho phản ứng khẳng định B.cereus 4.3.1.2 Các thử nghiệm khẳng định Nhuộm Gram: cấy ria khuẩn lạc chọn từ môi trường MYP hay MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng Ủ 30oC 24h Sau đó, tiến hành nhm Gram, quan sát kính hiển vi Việc nhm Gram thực phương pháp Jensen hay phương pháp Hucker Trước tiên, tạo vệt bôi VSV phiến kính Chọn phiến kính sạch,dùng bút ghi kính vẽ vịng trịn đường kính khoảng 2cm mặt phiến kính Sau nhỏ lên phiến kính giọt nước cất Dùng que cấy vịng chuyển sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước phiến kính, khuấy nhẹ đầu que cấy để huyền phù đồng bôi khu vực vịng trịn Để n cho vệt bơi khơ, dùng tay giữ hai cạnh đầu phiến kính, đưa phiến kính qua lại lửa đèn cồn Tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với lửa Thực tương tự với để tạo vệt bôi chung hai chủng VSV đối chứng phiến kính khác Sử dụng E.coli làm chủng đối chứng cho Gram(-) Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+) Theo phương pháp Jensen, nhỏ vài giọt dd methyl violet lên vệt bôi, giữ yên 20 giây Dùng bình xịt nước, bơm nước lên vệt bơi để rửa phẩm nhuộm Nhỏ vài SVTH: Nhóm 07 Trang 20 Định lượng Bacillus cereus giọt dd KI/I2 lên vệt bơi, để n phút Dùng bình xịt chứa cồn 95% bơm cồn lên vệt bôi, rửa phẩm nhuộm đến vừa màu Để yên vài giây sau rửa lại nước Nhuộm dd safranin 30 giây, rửa nước Thấm nước dư giấy lọc Theo phương pháp Hucker, thao tác tương tự phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi phút dd crystal violet Rửa nước Nhuộm dd KI/I phút Khử màu cách xịt cồn 95% màu Rửa lại nước nhuộm dd safranin phút Sau thực xong quy trình nhuộm, quan sát màu nhuộm tế bào vật kính 100X nhúng dầu Tế bào nhuộm Gram (+) có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli) B.cereus trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với thành dạng chuỗi Bào tử hình bầu dục, khơng có dạng nang bào tử Dùng que cấy vòng cấy chuyển lượng sinh khối chủng thử nghiệm ống thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng Huyền phù hóa dịch để sử dụng cho phản ứng sinh hóa Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth, ủ 35oC, 24h điều kiện kỵ khí Lắc ống nghiệm thật mạnh quan sát phát triển thong qua độ đục chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sinh acid từ glucose điều kiện kỵ khí Thử nghiệm khả sinh nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml môi trường canh Nitrate Broth, ủ 35oC 24h Kiểm tra diện nitrite cách bổ sung vài giọt dd A dd B thuốc thử nitrate Nếu có màu cam xuất vịng 10 phút chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrite SVTH: Nhóm 07 Trang 21 Định lượng Bacillus cereus Thử nghiệm VP: Thử nghiệm khả thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng Tyrosine, ủ 35oC 48h Sự suất sinh khối khuẩn lạc thị tyrosine bị phân hủy Thử nghiệm canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2,5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0,001% Lysozyme Thực tương tự với môi trường Nutrient Broth không chứa lysozyme Ủ ống nghiệm 35oC 24h Kiểm tra tăng trưởng môi trường chứa lysozyme môi trường đối chứng Ủ ống nghiệm (-) them 24h trước kết luận kết thử nghiệm => Dựa vào bảng 5.1 để khẳng định dịng chọn có phải B.cereus hay không 4.3.1.3 Các thử nghiệm phân biệt lồi Bacillus nhóm Để phân biệt lồi khác Bacillus nhóm cần tiến hành bổ sung thử nghiệm sau: Thử nghiệm tính di động: dung que cấy vịng cấy dịch 24h nuôi cấy thẳng vào môi trường kiểm tra di động cho B.cereus Ủ 30 oC, từ 18 – 24h kiểm tra ánh đèn kiểu mọc dọc theo đường cấy Loài di động mọc khuếch tán vào mơi trường theo hướng xa đường cấy Lồi khơng di động mọc dọc theo đường cấy Bổ sung 0,2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar Cấy huyền phù vi khuẩn vào, ủ thạch nghiêng từ 6-8h 30 oC Nhỏ nước vơ trùng lên phiến kính đặt sinh khối vi khuẩn vào Quan sát kính hiển vi, kiểm tra di động Hầu hết chủng B.cereus B thuringiensis di động, B.anthracis hầu hết chủng B.nycoides khơng di động SVTH: Nhóm 07 Trang 22 Định lượng Bacillus cereus Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vịng mang huyền phù 24h ni cấy lên đĩa Nutrient Agar Ủ 30oC, từ 48 – 72h Kiểm tra phát triển rễ giả, đặc trưng việc tạo khuẩn lạc có cấu trúc giống rễ tóc mở rộng vào cm từ vị trí cấy B.cereus khơng tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng B.mycoides - Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy Ủ 35oC, từ 24h B.cereus làm tan máu mạnh tạo vùng tan máu hoàn toàn (β) - 4mm xung quanh vùng phát triển B.thuringiensis B.mycoides tan máu β B.anthracis thường không làm tan máu sau 24h - Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể: cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch nghiêng Nutrient Agar, ủ 30oC, từ 24h, sau để nhiệt độ phịng 2-3 ngày Thực nhuộm phẩm màu fuchsin Quan sát kính hiển vi tinh thể độc tố hình tứ giác (dạng kim cương) nhuộm màu tối nhỏ bào tử Tinh thể độc tố B.thuringiencis xuất nhiều sau – ngày nuôi cấy phát kỹ thuật nhuộm bào tử nang vỡ Do đó, khơng quan sát bào tử tự do, cần để them vài ngày nhiệt độ phòng tiến hành kiểm tra lại B.cereus Bacillus khác nhóm khơng có tinh thể độc 4.3.1.4 Cách tính kết Tính số tế bào B.cereus 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ( tham khảo cách chọn đĩa sử dụng để đếm chương IV) độ pha loãng hiệu chỉnh tỷ lệ khẳng định (% khuẩn lạc xác nhận B.cereus) Vd, số khuẩn lạc đếm độ pha lỗng 10-4 65, có số khuẩn lạc chọn xác nhận B.cereus sau kiểm tra phản ứng sinh hóa Như vậy, số tế bào B.cereus 1g thực phảm 65 x 4/5 x 10000 x 10 = 520000( phải nhân với 10 có 0.1ml mẫu sử dụng để trải đĩa) SVTH: Nhóm 07 Trang 23 Định lượng Bacillus cereus TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] http://www.doko.vn/luan-van/nghien-cuu-xay-dung-quy-trinh-phat-hien-gendoc-to-cua-b-cereus-trong-thuc-pham-bang-ky-thuat-multiplex-pcr-92533 [2] http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=3602118 [3] http://www.docs.vn/vi/sinh-hoc-38/28783-phan-lap-vi-khuan-bacillus-subtilistu.html [4] http://www.agroviet.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=27269 [5] Bài giảng phân tích vi sinh thưc phẩm, Trường Đại học Cơng Nghệ Thực Phẩm,Thành Phố Hồ Chí Minh, 2011 [6] PGS TS Lê Thanh Mai,Giáo Trình Phân tích Vi sinh Thực Phẩm,Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2008 SVTH: Nhóm 07 Trang 24