NGHIÊN cứu và THU NHẬN PHLOROTANNIN BẰNG kỹ THUẬT NGÂM dầm kết hợp với ENZYME

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN PHLOROTANNIN BẰNG KỸ THUẬT NGÂM DẦM KẾT HỢP VỚI ENZYME GVHD: TS ĐẶNG XUÂN CƯỜNG SVTH: PHẠM THỊ HOÀNG OANH MSSV: 14070060 LỚP :17SH01 BÌNH DƯƠNG - 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - PHẠM THỊ HOÀNG OANH TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN PHLOROTANNIN BẰNG KỸ THUẬT NGÂM DẦM KẾT HỢP VỚI ENZYME LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH GVHD: TS ĐẶNG XUÂN CƯỜNG BÌNH DƯƠNG - 2018 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Cơng nghệ Sinh học – Trường Đại học Bình Dương tạo điều kiện tốt cho em trình học tập Trường; Xin gửi lời cám ơn chân thành tới Thầy Hoàng Ngọc Cương toàn thể Q Thầy Cơ - Trường Đại học Bình Dương giúp đỡ truyền đạt cho em kiến thức quý báu từ môn học; Xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới Thầy Đặng Xuân Cường - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tận tình dạy; xin cảm ơn Cán bộ, Viên chức – Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tạo điều kiện để em hồn thành Khóa luận; Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới Gia đình tồn thể bạn bè kề vai sát cánh bên hồn cảnh Bình Dương, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực Phạm Thị Hoàng Oanh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT LUẬN VĂN x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược rong biển 2.2 Rong nâu Sargassum 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Đặc điểm rong nâu Sargassum 2.2.2.1 Sắc tố 2.2.3.2 Glucid 2.2.2.2.1 Protein 2.2.2.2.2 Chất khoáng 2.2.3 Các cơng dụng vai trị sinh học rong nâu 2.2.3.1 Công dụng 2.2.3.2 Vai trò sinh học 2.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng rong nâu giới nước 2.3.1 Thế giới 2.3.2 Trong nước 2.4 Q trình oxy hóa hoạt tính sinh học Phlorotannin 2.4.1 Quá trình oxy hóa gốc tự 2.4.1.1 Quá trình oxy hóa 2.4.1.2 Gốc tự 2.4.1.3 Nguồn gốc gốc tự 10 2.4.1.4 Ảnh hưởng gốc tự tới thể 10 ii 2.4.1.5 Một số hợp chất chống oxy hóa 12 2.4.2 Phlorotannin hoạt tính sinh học 15 2.4.2.1 Phlorotannin 15 2.4.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa Phlorotannin 18 2.4.2.3 Hoạt tính kháng nấm 19 2.5 Một số phương pháp chiết Phlorotannin 21 2.5.1 Cơ sở trình chiết 21 2.5.2 Chọn dung môi để chiết xuất 21 2.5.2.1 Chất tan nước dung môi phân cực 21 2.5.2.2 Chất tan ete dung môi không phân cực 22 2.5.3 Các phương pháp chiết 23 2.5.3.1 Các phương pháp chiết tách dung môi 23 2.5.3.2 Chiết phương pháp ngấm kiệt (Percolation) 24 2.5.3.3 Chiết phương pháp ngâm dầm (Maceration) 24 2.5.3.4 Tách chiết phương pháp chiết hồi lưu 24 2.5.3.5 Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm 25 2.5.3.6 Phương pháp chiết sử dụng lượng lị vi sóng 25 2.5.3.7 Sử dụng enzyme 26 2.5.3.8 Chiếc chất lỏng siêu tới hạn 26 2.5.3.9 Sử dụng áp lực thủy tĩnh cao (HHP) 26 2.5.4 Tinh chế chạy phổ xác định phlorotannin 27 2.5.5.Những yếu tố kỹ thuật 27 2.5.5.1 Nhiệt độ chiết 27 2.5.5.2 Thời gian chiết 28 2.5.5.3 Độ mịn dược liệu 28 2.5.5.4.Dung dịch đệm pH 29 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Nguyên liệu chuẩn bị mẫu 30 3.1.1 Rong nâu Sargassum 30 iii 3.1.2 Loai enzyme 30 3.2 Phương pháp nghiên cứu 31 3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng phlorotannin tổng số 31 3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng 31 3.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính khử sắt 31 3.2.4 Xác định loại cacbon phổ DEPT – NMR (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) 31 3.2.5 Phổ NMR 32 3.3 Hóa chất 32 3.4 Bố trí thí nghiệm 33 3.4.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 33 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng enzyme đến khả chiết phlorotannin 34 3.4.3 Xác định tỷ lệ enzyme/nguyên liệu dùng xử lý rong nguyên liệu 35 3.4.4 Khảo sát thời gian xử lý rong nguyên liệu enzyme 36 3.4.5 Phân đoạn phlorotannin hoạt tính 37 3.4.6 Tinh chế Phlorotannin 38 3.5 Phân tích liệu 39 Chƣơng 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Ảnh hưởng điều kiện xử lý enzyme đến q trình chiết phlorotannin hoạt tính từ rong nâu 40 4.1.1 Xác định loại enzyme xử lý rong nguyên liệu 40 4.1.2 Xác định tỷ lệ enzyme/ dung dịch cho trình chiết phlorotannin 42 4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phù hợp xử lý nguyên liệu enzyme đến hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa 44 4.2 Kết tinh chế phlorootannin 46 4.2.1 Hàm lượng phlorotannin 46 4.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa tổng 47 4.2.3 Hoạt tính khử sắt 48 4.3 Đặc điểm cấu trúc phlorotannin 48 iv 4.4 Mối tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính khử sắt 50 4.4.1 Mối tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa tác động loại enzyme xử lý rong nguyên liệu 50 4.4.2 Mối tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa tác động tỷ lệ enzyme/ dung dịch xử lý rong nguyên liệu 51 4.4.3 Mối tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa qua thời gian xử lý rong nguyên liệu enzyme 52 4.5 Đề xuất quy trình chiết phlorotannin từ rong mơ Sagassum duplicatum phương pháp ngâm dầm kết hợp với enzyme 54 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 62 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT E Enzyme TPc Hàm lượng Phlorotannin TA Hoạt tính chống oxy hóa tổng RP Hoạt tính khử sắt vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Diện tích rong mơ theo vùng biển tỉnh Bảng 2.2 Hàm lượng Phlorotannin số loại rong Nâu 18 Bảng 2.3 Tính chất số dung môi sử dụng để chiết hợp chất tự Nhiên 21 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tác nhân bên ngồi gây gốc tự 12 Hình 2.2 Cơ chế chống oxy hóa 13 Hình 2.3 Sự kết hợp nhóm acetate 16 Hình 2.4 Sự tạo vịng chuỗi triketide để hình thành Phloroglucinol 16 Hình 3.1 Một nhánh rong nâu Sargassum 30 Hình 3.2 Quy trình chiết xuất phlorotannin từ rong nâu Sagassum duplicatum có hỗ trợ enzyme 33 Hình 3.3 Khảo sát ảnh hưởng loại enzyme xử lý rong đến phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết 35 Hình 3.4 Lựa chọn tỷ lệ enzyme thích hợp 36 Hình 3.5 Khảo sát thời gian phù hợp để xử lý rong nguyên liệu enzyme 37 Hình 3.6 Sơ đồ phân đoạn phlorotannin kỹ thuật chiết lỏng lỏng 38 Hình 3.7 Sơ đồ tinh chế phlorotannin 39 Hình 4.1 Ảnh hưởng loại enzyme lên hàm lượng phlorotannin dịch chiết 40 Hình 4.2 Ảnh hưởng loại enzyme lên hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt dịch chiết 41 Hình 4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/ dung dịch lên hàm lượng phlorotannin dịch chiết 42 Hình 4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/ dung dịch lên hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt phlorotannin 43 Hình 4.5.Ảnh hưởng thời gian xử lý rong nguyên liệu enzyme đế hàm lượng phlorotannin 44 Hình 4.6 Ảnh hưởng thời gian xử lý rong nguyên liệu enzyme đến hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt 45 Hình 4.7 Hàm lượng phlorotannin phân đoạn sau cột sephadex LH20 46 Hình 4.8 Hoạt tính chống oxy hóa tổng phân đoạn sau cột Sephadex viii 7,85 ±0,21 mg acid ascorbic/g DW hoạt tính khử sắt 7,38 ±0,23 mg FeSO4/g DW Khi hàm lượng phlorotannin 3,57 ±0,11 mg phloroglucinol/g DW hoạt tính chống oxy hóa tương đương 8,44 ±0,27 mg acid ascorbic/g DW hoạt tính khử sắt 7,91 ±0,18.mg FeSO4/g DW Hàm lượng phloorotannin hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan mạnh 100% theo phương trình phi tuyến tính: y = 54,252x2 - 368,64x + 633,04 với R2 = Hàm lượng phlorotannin hoạt tính khử sắt có mối tương quan mạnh 100% theo phương trình phi tuyến tính: y = 1,8058x2 + 14,043x – 19,209 với R2 = 4.4.2 Mối tƣơng quan hàm lƣợng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa dƣới tác động tỷ lệ enzyme/ dung dịch xử lý rong nguyên liệu Hình 4.15 Sự tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính oxy hóa tổng 51 Hình 4.16 Sự tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính khử sắt Kết nghiên cứu thể hình 4.15 4.16 cho thấy, hàm lượng phlorotannin tăng hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt tăng theo Ở tỷ lệ eyme 2,5% hàm lượng phlorotannin 2,94 ±0,06 mg phloroglucinol/g DW hoạt tính oxy hóa tương đương 7,03 ± 0,14 mg acid ascorbic/g DW hoạt tính khử sắt tương đương 6,54 ± 0,19 mg FeSO4/g DW Ở tỷ lệ enzyme 5% hàm lượng phlorotannin 3,57± 0,11.mg phloroglucinol/g DW) hoạt tính oxy hóa tương đương 8,44 ± 0,27 mg acid ascorbic/g DW) hoạt tính khử sắt tương đương 7,91 ± 0,18 mg FeSO4/g DW Hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan mạnh 98,43% theo phương trình phi tuyến tính: y = 0,0632x2 + 1,782x + 1,3141 với R² = 0,9843 Hàm lượng phlorotannin hoạt tính khử sắt có mối tương quan mạnh 97,87% theo phương trình phi tuyến tính: y = 0,6392x2 -2,2044 x + 7,5846 với R² = 0,9787 4.4.3 Mối tƣơng quan hàm lƣợng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa qua thời gian xử lý rong nguyên liệu enzyme 52 Hình 4.17 Sự tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính oxy hóa tổng Hình 4.18 Sự tương quan hàm lượng phlorotannin hoạt tính khử sắt Kết nghiên cứu thể hình 3.17 3.18 cho thấy, thời gian thay đổi hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa, khử sắt thay đổi theo Khi thời gian xử lý hàm lượng phlorotannin 4,32 ± 0,09 mg phloroglucinol/g DW hoạt tính chống oxy hóa 10,58 ± 0,21 mg acid ascorbic/g DW hoạt tính khử sắt 10,23 ± 0,27 mg FeSO4/g DW Khi thời gian xử lý giờ, hàm lượng phlorotannin 4,07 ± 0,07 mg phloroglucinol/g DW hoạt tính chống oxy hóa 9,72 ± 0,25 mg acid ascorbic/g DW hoạt tính khử sắt 9,16 ± 0,19 mg FeSO4/g DW Phân tích liệu cho thấy: 53 Hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan mạnh 99,43% theo phương trình phi tuyến tính: y = 0,96x2 - 4,3185x + 11,298 với R² = 0,9943 Hàm lượng phlorotannin hoạt tính khử sắt có mối tương quan mạnh 99,83% theo phương trình phi tuyến tính: y = 2,1748x2 -13,463 x +27,869 với R² = 0,9983 4.5 Đề xuất quy trình chiết phlorotannin từ rong mơ Sagassum duplicatum phƣơng pháp ngâm dầm kết hợp với enzyme Enzyme cellulose Tỷ lệ enzyme/ dung dịch: 7,5% Tỷ lệ dung dịch/ rong: 15/1 (v/w) Nhiệt độ: 400C Thời gian: Nguyên liệu Xử lý Nhiệt độ phòng Thời gian 24 enzyme Chiết Rong Rong g Lọc Nhiệt độ 450C Áp suất 120 psi Rong Rong g Cô đặc Rong g Phân đoạn Sephadex LH20 Chạy cột Cơ đặc Đơng khơ Phlorotannin Hình 4.19 Quy trình chiết xuất phlorotannin từ rong nâu Sargassum duplicatum có hỗ trợ enzyme 54 Thuyết minh quy trình Ngun liệu: Rong khô chuẩn bị công đoạn chuẩn bị mẫu Xử lý enzyme: công đoạn sử dụng enzyme để bào mòn màng tế bào rong, nhằm hỗ trợ q trình chiết phlorotannin chống oxy hóa khỏi tế bào rong nâu Các yếu tố nghiên cứu công đoạn loại enzyme, tỉ lệ enzyme/ dung dịch, thời gian xử lý enzyme Hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa sử dụng để đánh giá lựa chọn điều kiện xử lý enzyme Chiết: Dung môi sử dụng để chiết phlorotannin ethanol 96%, thời gian 24 nhiệt độ phòng Lọc: Thu nhận dịch chiết vải giấy lọc để loại bỏ tạp chất không tan cát, bã rong tạp chất khác Cô đặc: Dịch lọc đem cô đặc để loại bỏ bớt dung môi thu nhận cao chiết chuẩn bị cho q trình phân đoạn Phân đoạn: Dịch sau đặc đem phân đoạn n-hexan, chloroform, EtOAC, n-butanol Phân đoạn EtAOC mang cô đặc tiếp tục phân đoạn dung môi chloroform n-butanol Phân đoạn EtOAC thu tiếp tục cô đặc để loại bỏ dung môi phân đoạn ethanol 96% Phân đoạn ethanol 96% thu nhận đặc thành cao phục vụ q trình tinh chế Chạy sắc ký cột: công đoạn gel Sephadex LH20 sử dụng, công đoạn nhằm tăng độ phlorotannin phân đoạn phlorotannin theo nhóm khối lượng khác Dung mơi rửa giải chloroform : methanol : acid formic (90:9:1) Phân đoạn thu tiếp tục hòa tan ethanol 96% lọc Cô đặc: công đoạn nhằm loại bỏ dung môi thu phần phlorotannin tinh dạng cao Đông khô: cao phlorotannin tinh thu nhận từ công đoạn mang đơng khơ nhằm thuận lợi cho q trình phân tích đặc điểm cấu trúc phlorotannin Phlorotannin tinh: có màu trắng đục 55 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ nghiên cứu trên, cho phép em rút số kết luận sau: Đã nghiên cứu xác định loại enzyme thích hợp cho việc hỗ trợ chiết phlorotannin từ rong Nâu phương pháp ngâm dầm có hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt cao: Loại enzyme: E cellulase Tỷ lệ enzyme/ dung dịch: 7,5% Thời gian xử lý enzyme: Tinh phlorotannin dải dung mơi có độ phân cực khác cột Sephadex LH 20 Đặc điểm cấu trúc phlorotannin tinh 5.2 KIẾN NGHỊ Mặc dù cố gắng trình làm đề tài, song thời gian điều kiện nghiên cứu có giới hạn nên đề tài cịn nhiều hạn chế thiếu sót Với kết đạt từ đề tài “Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin kỹ thuật ngâm dầm kết hợp với enzyme” xin đề xuất số ý kiến sau: Áp dụng phương pháp nghiên cứu đề tài lồi rong có điều kiện sống khác Tìm hiểu yếu tố ban đầu ảnh hưởng đến hàm lượng phlorotannin rong như: thời gian thu hái, độ tuổi rong, môi trường sinh sống, trồng rong,… Nghiên cứu khả ứng dụng phlorotannin lĩnh vực: dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm,… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Xuân Cường (2009) Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật “Nghiên cứu thu nhận dịch có hoạt tính kháng khuẩn từ rong Nâu Dictyota Dchotoma Việt Nam” Đại học Nha Trang Đặng Xuân Cường (2015) Luận án Tiến sĩ kỹ thuật “Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum Serratum) Nha Trang thử nghiệm sử dụng đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa” Đại học Nha Trang Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Minh Lý, Vũ Ngọc Bội (2011) “Sự tích lũy phân bố phlorotannin chống oxy hóa sốlồi rong Sargassum Khánh Hòa theo thời gian sinh trưởng”, Quyển – Sinh học nguồn lợi, Hội nghị Khoa học Công nghệ biển lần thứ V, Tuyển tập báo cáo, Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Lê Minh Đức, Bùi Minh Lý, Trần Thị Thanh Vân (2011) “Các yếu tố ảnh hưởng đến trình polyphenol từ lồi rong Saragassum mcclurei”, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Biển tồn quốc, tiểu ban sinh học nguồn lợi biển, 680 – 685 Nguyễn Ý Đức (2011) Gốc tự chất chống oxy hóa Nxb Y tế Nguyễn Hải Hà (2004) Luận văn Thạc sỹ “Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà Camellia simensis (L)”, Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004) Chế biến rong biển Nxb Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Lê Ngọc Thạch (2003) Tinh dầu, Nxb ĐHQG TP Hồ Chí Minh Tài liệu Tiếng Anh A Rajaei, M Barzegar, Z Hamidi, M A Sahari (2010) Optimization of extraction conditions of phenolic compounds from pistachio (Pistachia vera) green Hull through Response Surface Method., J Agr Sci Tech., 12, 605-615 57 10 Daniel Franco, Jorge Sineiro, Manuel Pinelo, Noelia Costoya (2008) Polyphenols from Plant Materials: Extraction and Antioxidant Power EJEAFChe, 7(8), 3210-3216 11 Ergin M Altuner, Cemil Islek, Taplip Center and Hami Alpas (2012) High hydrostatic pressure extraction of phenolic compounds from Maclura pomifera fruits, African Journal of Biotechnology, 11(4), 930-937 12 Franciska S, Steinhoff, Martin Graeve, Krzysztof Bartoszek, Kai Bischof, Christian Wiencke (2012) Phlorotannin Production and Lipid Oxidation as Potential Protective Function Against High Photosynthetically Active and UV Radiation in Gametophytes of Alaria esculenta (Alariales, Phaeophyceae) Photochemistry and Photobiology, 88(1), 46-57 13 Gin-Nae Ahn, Kil-Nam Kim, Seon-Heui Cha, Choon-Bok Song, Jehee Lee, Moon-Soon Heo, In-Kyu Yeo, Nam-Ho Lee, Young-Heun Jee, Jin-SooKim (2006) Antioxidant activities of phlorotannin purified from Eckloniacava on free radical scavenging using ESR and H202-mediated DNA damage European Food Research and Technology, 226 71-79 14 Graciliana Lopes, Eugenia Pinto, Paula B Andrade, Patricia Valentao (2013) Antifungal activity of phlorotannins against dermatophytes and yeasts approaches to the mechanism of action and influence on Candida albicans Virulence Factor PLos one, 8(8), e72203 15 Hyun Ryul Goo, Jae Sue, Choi Dong Hee Na (2010) Quantitative determination of major phlorotannin in Ecklonia stolonifera Archives of pharmacal reseach, 33(4), 539-544 16 Ioana Ignat, Irina Volf, Valentin I Popa (2011) A critical review of methods for characterization of polyphenolic compounds in fruits and vegetables Food Chemistry, 126, 1821-1835 17 Lopes, Graciliana, Sousa, Carla, Silva, Lui’s R, Pinto, Eugenia, Andrade, Paula B Bernardo, Joao, Mouga, Teresa, Valentao, Patricia, Holford, Mande (2012) Can Phlorotannin Purified Extracts Constitute a Novel Pharmacological Alternative 58 for Microbial Infections with Associated Inflammatory Conditions Plos one, 7(2), e31145 18 Massaki Nakai, Norihiko Kageyama, Koichi Nakahara and Watam Miki (2006), Phlorotannin as radical scavengers from the extract of Sargassum ringgoldianum Marien Biotechnology, 8(4), 409-414 19 Mathew Obichukwu Edoga, Labake Fadipe, Rita Ngozi Edoga (2006) Extraction of polyphenols from Cashew Nut Shell Leonardo Electronic Journal of Practices and Teachnologies, 9, 107-112 20 Melody Dutot, Roxane Fagon, Marc Hemon, Patrice Rat (2012) Antioxidant, anti-inflammatory, and anti-senescence activities of a phlorotanninrich natural extract from brown seaweed Ascophyllum nodosum Applied biochemistry and biotechnology, 167(8), 2234-2240 21 Miliauskas G, van Beek TA, de Waard P, Venskutonis RP, Sudholter EJR, Sudhölter EJ (2006) Comparison of analytical and semi-preparative columns for high-performance liquid chromatography-solid-phase extraction-nuclear magnetic resonance J Cheomatogr A, 1112(1-2), 276-284 22 Naja Khaled, Mawlawi Hiba, Chbani Asma (2012) Antioxidant and Antifungal activities of Padina Pavonica and Sargassum Vulgare from the Lebanese Mediterranean Coast Advances in Environmental Biology, 6(1), 42-48 23 Nalin Siriwardhana, Ki-Wan Lee va You-Jin Jeon (2005) Radical Scavenging Potential of Hydrophilic Phlorotannins of Hizikia fusiformis Algae, 20(1), 69-75 24 Patricia Garcia –Salas, Aranzazu Morales-Soto, Antonio Segura Carretero (2010) Phenolic compound extraction systems for fruit and vegetable samples Molecules, 15, 8813-8826 25 Pham Thanh Quan, Tong Van Hang, Nguyen Hai Ha, Nguyen Xuan De, Truong Ngoc Tuyen (2006) Microwave – assited extraction of polyphenols from fresh tea shoot Journal of Science and Technology Development, Vietnam National University- Ho Chi Minh City, 69-75 59 26 Ragan MA and Glombitza KW (1986) Phlorotannin, Brown algal polyphenols Prog Phycol Res., 4, 129-241 27 Ragan MA and Jamieson WD (1976) Physodes and the phenolic compounds of brown algae Isolation and characterization of phloroglucinol polymers from Fucus vesiculosus (L) Phytochemistry, 54(1), 2709-2711 28 Riitta Koivikko (2008) Ph.D Thesis “Brown algal phlorotannin improving and applying chemical methods” University of Turku, Turku, Finland 29 Schutz K, Persike M, Carle R, Schieber A (2006) Characterization and quantification of anthocyanins in selected artichoke (Cynara scolymusl.) cutivars by HPLC-DAD-ESI-MSn., Anal Bioanal Chem., 384(7-8), 1511-1517 30 Shiv Kumar (2011) Free Radicals and Antioxidants: Human and Food System Advances in Applide Science Research, 2(1), 129-135 31 Sumitra Chavasa, Mital Kaneria Yogesh Baravalia (2012) Antioxidant and antimicrobial properties of various polar solvent extracts of stem and leaves of four Cassia species, African Journal of Bioteachnology, 11(10), 2490-2503 32 Swanson AK, Druehl LD (2002) Induction, exudation and the UV protective role of kelp phlorotannins Aquat Bot, 73, 241-253 33 Sung-Hwan Eom, Young-Mog Kim, Se-Kwon Kim (2012) Antimicrobial effect of phlorotannins from marine brown algae Food and Chemical Toxicology, 50, 3251-3255 34 Young Min Ham, Jong Seok Baik, Jin Won hyun, Nam Ho Lee (2007) Isolation of a New Phlorotannin, Fucodiphlorethol G from a Brown Alga Ecklonia cava, department of Chemis try and Research Institute of Basic Sciences Cheju National University Korean Chem Soc, 28(9), 15951597 35 Wajp Wijesinghe, Seok-Chun Ko va You-Jin Jeon (2011), Effect of phlorotannin isolated from Ecklonia cava on angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity Nutrition Research and Practice, 5(2), 93-100 36 Wang T., Jonsdottir R., Liu H., Gu L., Kristinsson H.G., Raghavan S., Olafsdottir G (2012) Antioxidant Capacities of Phlorotannin Extracted from the 60 Brown Algae Fucus vesiculosus Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(23), 5874-5883 Trang web 37 http://diendancntpdhnt.wordpress.com 38 https://vi.wikipedia.org/wiki/Dung_m%C3%B4i 61 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Định lƣợng polyphenol dịch chiết Hàm lượng phlorotannin xác định theo phương pháp so màu, thuốc thử Folin – Ciocalteus đo bước song 750nm a) Ngun lý Oxy hóa tồn lượng phlorotannin dịch dung dịch Folin – Ciocalteus (hỗn hợp acid phosphotungstic acid phosphomolyblic) Các acid bị khử thành Vonfam (W8O23) oxit moliden (W08O23) có màu vàng b) Dụng cụ hóa chất Dụng cụ: - Máy quang phổ UV-VIS - Pipet - Ống nghiệm Hóa chất: - Dung dịch phloroglucinol 0,1% (C6H6O3 0.1%) làm chất chuẩn - Dung dịch Folin – Ciocalteus - Na2CO3 10% c) Tiến hành Lấy 100µl mẫu với 900µl nước cất cộng thêm 1ml Folin – Ciocalteus pha loãng đến nồng độ 10% vào ống nghiệm, giữ phút Tiếp theo, thêm vào 2ml Na2CO3 10% trộn giữ 90 phút bóng tối Sau đó, đo độ hấp thụ bước sóng 750nm Tính tốn xác định hàm lượng Phlorotannin có mẫu 62 Phụ lục 2: Xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng a) Nguyên lý Chống oxy hóa tổng xác định theo phương pháp phosphomolybdenum Phương pháp dựa việc giảm hóa trị Mo (VI)-MO (V) hợp chất chống oxy hóa hình thành sau dung dịch phosphate màu xanh (phức hợp Mo (V) pH acid) b) Dụng cụ hóa chất Dụng cụ: - Máy quang phổ UV-VIS - Pipet - Ống nghiệm Hóa chất: - Dụng dịch H2SO4 0,6M - Sodium phosphate 28mM - Ammonium Molybdate 4mM - Acid ascorbic c) Tiến hành Lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước cất thêm 3ml dung dịch A (H2SO4 0,6M, sodium phosphate 28mM ammonium Molybdate 4mM) Hỗn hợp giữ 90 phút 95oC.Sau đo bước sóng 695nm với chất chuẩn acid ascorbic Cách pha đường chuẩn pha dung dịch acid ascorbic 1mg/1ml Sau lấy 10µl, 20µl, 30µl, 40µl, 50µl, 60µl, 70µl, 80µl, 90µl, 100µl, bổ sung nước cất tương ứng cho đủ 1ml sâu thêm 3ml dung dịch A vào giữ 90 phút 95oC Sau đo bước sóng 695nm Với kết đo vẽ đường chuẩn đưa phương trình So sánh kết mẫu chiết với đường chuẩn có hàm lượng tương ứng acid ascorbic 63 Phụ lục 3: Bảng 3.1 Kết hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt rong Nâu loại enzyme Loại enzyme E Termamyl E Cellulase E Viscozyme Hàm lƣợng phlorotannin (mg phloroglucinol/ g DW) 3.26 3.57 Hoạt tính chống oxy hóa tổng (mg acid ascorbi/ g DW) 7.85 8.44 3.34 8.17 Hoạt tính khử sắt (mg FeSO4/ g DW) 7.38 7.91 7.55 Bảng 3.2 Kết hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt rong Nâu theo tỷ lệ enzyme/dung dịch Tỷ lệ enzyme/ dung dịch (v/v) 2,5% 5,0% 7,5% 10,0% 12,5% 15,0% Hàm lƣợng phlorotannin (mg phloroglucinol/ g DW) 2.94 3.57 4.28 4.01 3.82 3.36 Hoạt tính chống oxy hóa tổng (mg acid ascorbi/ g DW) 7.03 8.44 10.21 9.28 9.05 8.2 64 Hoạt tính khử sắt (mg FeSO4/ g DW) 6.54 7.91 10.02 8.76 8.44 7.59 Bảng 3.3 Kết hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt rong Nâu theo thời gian Thời gian xử lý enzyme hỗ trợ chiết (giờ) Hàm lƣợng phlorotannin (mg phloroglucinol/ g DW) 3.17 4.28 4.45 4.32 4.07 Hoạt tính chống oxy hóa tổng (mg acid ascorbi/ g DW) 7.25 10.21 11.17 10.58 9.72 65 Hoạt tính khử sắt (mg FeSO4/ g DW) 7.04 10.02 11.09 10.23 9.16 ... cứu Thu nhận phlorotannin kỹ thu? ??t ngâm dầm kết hợp với enzyme Nội dung nghiên cứu + Nghiên cứu xử lý rong nguyên liệu enzyme để hỗ trợ trình chiết; + Tinh chế phlorotannin từ dịch chiết thu. .. trợ trình chiết; + Tinh chế phlorotannin từ dịch chiết thu từ hỗ trợ enzyme; + Đề xuất quy trình thu nhận thu nhận phlorotannin kỹ thu? ??t ngâm dầm kết hợp với enzyme Kết đạt Khóa luận sau: + Đưa... trợ enzyme 54 ix TĨM TẮT LUẬN VĂN Khóa luận tốt nghiệp ? ?Nghiên cứu thu nhận phlorotannin kỹ thu? ??t ngâm dầm kết hợp với enzyme? ?? thực từ tháng 4/2018 đến tháng 7/2018, Viện Nghiên cứu