TỔNG QUAN VỀ CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ý TƯỞNG ỨNG DỤNG

TRƯỜNG THPT CHUYÊN LÊ HỒNG PHONG - - TỔNG QUAN VỀ CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ý TƯỞNG ỨNG DỤNG Tác giả: TRƯƠNG ĐÌNH QUANG ĐĂNG (Lớp 10CSI) Tp.HCM tháng 11/2021 PHẦN 1: CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ I Kĩ thuật PCR Khái quát Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng để khuếch đại một vài đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo hàng ngàn đến hàng triệu trình tự DNA Được đưa Kary Mullis năm 1985 Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR kĩ thuật phổ biến việc giải trình tự hệ gene; chuẩn đoán bệnh di truyền; nghiên cứu trình phát sinh chủng loại; xác định dấu vân tay DNA khoa học pháp y hay để xác định quan hệ huyết thống Kĩ thuật PCR dựa chu trình nhiệt, bao gồm chu kỳ tăng giảm nhiệt độ phản ứng biến tính DNA chép DNA Đoạn mồi (là đoạn DNA ngắn) mang trình tự giống với trình tự bổ sung với DNA đích DNA polymerase thành phần quan trọng cho phép khuếch đại cách chọn lọc lặp lại Khi trình PCR diễn ra, DNA tạo từ DNA khuôn ban đầu tiếp tục sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền mẫu DNA khuếch đại theo cấp số nhân Hầu tất kỹ thuật PCR sử dụng DNA polymerase bền nhiệt, Taq polymerase (enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus) DNA polymerase có hoạt tính lắp ráp tổng hợp sợi DNA từ đơn phân nucleotide cách sử dụng khuôn DNA sợi đơn đoạn DNA oligonucleotide (hay gọi DNA mồi), thành phần bắt buộc để bắt đầu trình tổng hợp DNA Phần lớn phương pháp PCR sử dụng chu trình nhiệt, nghĩa tiến hành xen kẽ trình gia nhiệt giảm nhiệt mẫu PCR thơng qua chuỗi giai đoạn nhiệt khác xác định Ở bước đầu tiên, hai sợi xoắn kép DNA tách nhiệt độ cao, trình gọi q trình biến tính DNA Ở bước thứ hai, nhiệt độ hạ xuống hai sợi DNA trở thành khuôn cho DNA polymerase tổng hợp đoạn DNA đích Khả khuếch đại chọn lọc việc sử dụng mồi mang trình tự bổ sung với đoạn DNA đích khuếch đại chu trình nhiệt đặc hiệu Thành phần tham gia phản ứng PCR a) Dung dịch DNA mẫu (DNA template) chứa đoạn ADN cụ thể tinh để nhân b) Primers: đoạn DNA mồi, thường có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu điểm kết thục đoạn DNA mẫu c) DNA polymerase: enzyme có nhiệm vụ tổng hợp đoạn DNA trình tự DNA ban đầu Enzyme có khả chịu nhiệt cao thường sử dụng PCR Taq polymerase d) Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm loại (A, T, G, C)  thành phần bản, xem “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc ADN  DNA polymerase sử dụng dNTPs để tổng hợp nên trình tự ADN e) Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase f) Ống PCR (PCR tube): dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước cho vào thiết bị thực PCR (Thermal cycler) Hình Khái quát kĩ thuật PCR Có thành phần tham gia vào phản ứng PCR Trong trình PCR, có giai đoạn gia nhiệt: Giai đoạn 1: Tăng nhiệt độ lên 95°C; Giai đoạn 2: Giảm nhiệt độ xuống khoảng 55°C; Giai đoạn 3: Tăng nhiệt độ lên 72°C Quy trình Nguyên lý hoạt động PCR dùng enzyme trùng hợp polymerase để nhanh chóng tạo lượng lớn từ đoạn DNA (RNA) chọn lọc Thông thường, PCR bao gồm chuỗi khoảng 20-40 lần biến đổi nhiệt độ lặp lặp lại, gọi chu kỳ, chu kỳ thường gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt, thường ba (Giai đoạn biến tính, kết hợp mở rộng) Các chu kỳ thường bắt đầu giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C), dừng lại sản phẩm cuối tổng hợp dừng lại nhiệt độ thấp để lưu trữ sản phẩm PCR thời ngắn Nhiệt độ thời gian thực chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những yếu tố gồm enzyme tổng hợp DNA, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng phản ứng, nhiệt độ nóng chảy (Tm) mồi Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước sau:  Giai đoạn khởi đầu (Initalization): (Chỉ cần enzyme DNA polymerase bắt buộc phải kích hoạt nhiệt độ) Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C sử dụng polymerases bền nhiệt) tiến hành 1-9 phút  Giai đoạn biến tính (Denaturation): bước chu kỳ trình tăng nhiệt độ lên 94-98°C 20-30 giây DNA biến tính cách phá vỡ liên kết hydro bazơ, tạo thành phân tử DNA sợi đơn  Giai đoạn bắt cặp (Annealing): nhiệt độ phản ứng giảm xuống 50-65°C 20-40 giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn Nhiệt độ cần phải đủ thấp phép mồi bắt cặp với sợi DNA, đủ cao cho trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung mạch khn Nếu nhiệt độ thấp, mồi gắn không đặc hiệu Nếu q cao, mồi khơng gắn Thơng thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp 3-5 °C so với Tm mồi dùng phản ứng Liên kết hydro bền phân tử DNA – DNA hình thành mồi bổ sung hồn tồn với khn Polymerase liên kết với phân tử lai DNA mồi – khuôn bắt đầu tổng hợp DNA  Giai đoạn kéo dài (Extension/elongation): Nhiệt độ giai đoạn phụ thuộc vào DNA polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 75-80°C, nhiệt độ 72°C thường sử dụng với enzyme Tại giai đoạn DNA polymerase tổng hợp sợi DNA bổ sung với DNA khuôn cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng ngưng xảy nhóm 5′ – phosphate dNTP với nhóm 3′ – hydroxyl phía cuối sợi DNA vừa hình thành Thời gian giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase độ dài đoạn DNA cần khuếch đại Thông thường, DNA polymerase có khả khuếch đại hàng nghìn bazơ nitơ phút Trong điều kiện tối ưu, tức là, khơng có hạn chế giới hạn chất chất phản ứng sau giai đoạn kéo dài, số lượng DNA khuếch đại sau chu kì tuần theo hàm mũ Hình Cơ chế chép DNA  Giai đoạn kết thúc kéo dài (Final elongation): Giai đoạn thực nhiệt độ 70-74°C (đây nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu hầu hết enzyme polymerase dùng phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối để đảm bảo tất DNA sợi đơn cịn lại tổng hợp hồn tồn  Giai đoạn bảo quản (Final hold): Giai đoạn thực nhiệt độ 4-15°C thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm phản ứng Sự khuếch đại tính sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: Là số chuỗi mã hóa n: Là số chu kỳ Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành hai sao; chu kỳ lặp lặp lại liên tục 30 đến 40 lần từ DNA đích nhân thành 230 đến 240 sao, tức đến hàng tỷ Ứng dụng Hiện thành tựu PCR mở nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát pháp y,… Các loại kĩ thuật PCR  Allele-specific PCR: kỹ thuật chẩn đoán hay nhân dựa biến đổi đơn nucleotide (SNVs không nên nhầm lẫn với SNPs) (đây khác biệt bazơ đơn lẻ bệnh nhân) Nó u cầu thơng tin trình tự DNA, có khác biệt alen, thường sử dụng đoạn mồi nucleotide biến đổi đầu 3′ trình tự Quá trình khuếch đại cần điều kiện nghiêm ngặt nên hiệu mồi khn khơng bổ sung hồn tồn  Assembly PCR hay Polymerase Cycling Assembly (PCA): trình tổng hợp nhân tạo trình tự DNA dài việc thực phản ứng PCR nhóm oligonucleotide dài với phân đoạn ngắn gối lên Các oligonucleotide xen kẽ theo hướng sense antisense, phân đoạn gối xác định trật tự đoạn PCR, từ chọn lọc tổng hợp sản phẩm DNA dài cuối  Asymmetric PCR: ưu tiên khuếch đại sợi DNA phân tử DNA sợi kép Nó sử dụng giải trình tự lai đầu dò mà hai sợi bổ sung cần khuếch đại Phản ứng PCR tiến hành bình thường, sử dụng lượng mồi lớn cho sợi DNA đích cần khuếch đại Bởi khuếch đại bị chậm giai đoạn sau phản ứng lượng mồi sử dụng hết nên phản ứng PCR cần có thêm chu kỳ phụ Gần đây, biến đổi trình này, gọi Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), sử dụng lượng mồi giới hạn với nhiệt độ nóng chảy cao (Tm) so với lượng mồi dư thừa nhằm trì hiệu phản ứng nồng độ mồi giới hạn giảm phản ứng  Dial-out PCR: phương pháp PCR song song giúp nhanh chóng tìm phân tử DNA xác để tổng hợp gen Một thư viện phức tạp phân tử DNA biến đổi với vùng hai bên đặc thù phía trước trình tự song song Mồi Tag-directed sau có khả tìm kiếm phân tử với trình tự mong muốn PCR  Digital PCR (dPCR): sử dụng để định lượng số lượng sợi DNA đích mẫu DNA Các mẫu DNA pha loãng để sau chạy nhiều phản ứng PCR song song số phản ứng khơng nhận phân tử DNA đích Nồng độ DNA đích tính tốn cách sử dụng tỷ lệ kết âm tính  Khuếch đại phụ thuộc helicase: tương tự kỹ thuật PCR truyền thống, sử dụng nhiệt độ ổn định thông qua giai đoạn biến tính gắn mồi/kéo dài chu kỳ DNA helicase enzyme tháo xoắn DNA, sử dụng thay cho việc biến tính nhiệt  Hot start PCR: kỹ thuật làm giảm khuếch đại khơng đặc hiệu q trình PCR Nó thực cách gia nhiệt thành phần phản ứng nhiệt độ biến tính (ví dụ, 95°C) trước thêm polymerase Hoạt động polymerase bị ức chế enzyme đặc hiệu, kháng thể diện liên kết cộng hóa trị với chất ức chế có khả phân ly kích hoạt nhiệt độ cao  In silico PCR (digital PCR, virtual PCR, electronic PCR, e-PCR): cơng cụ tính tốn sử dụng để tính tốn lý thuyết kết phản ứng chuỗi polymerase, sử dụng tập hợp đoạn mồi (đầu dị) để khuếch đại chuỗi DNA từ trình tự gen hệ phiên mã  Intersequence-specific PCR (ISSR): phương pháp PCR in dấu vân tay DNA, khuếch đại vùng trình tự đơn lặp lặp lại để tạo dấu vân tay độ dài đoạn khuếch đại  Inverse PCR: thường sử dụng để xác định trình tự hai bên xung quanh vị trí chèn gen Nó bao gồm loạt trình tự phân hủy DNA tự nối lại, kết trình tự biết nằm hai đầu trình tự chưa biết  Ligation-mediated PCR: sử dụng trình tự DNA nhỏ gắn với DNA mà cần quan tâm dùng nhiều mồi gắn với trình tự liên kết DNA; sử dụng để xác định trình tự DNA, thăm dò hệ gen, làm dấu chuẩn DNA  Methylation-specific PCR (MSP): phát triển Stephen Baylin Jim Herman trường Y Johns Hopkins sử dụng để phát methyl hóa đảo CpG DNA gen DNA xử lý với sodium bisulfit, chuyển cytosine không bị methyl thành uracil, gắn với thymine phản ứng PCR Hai phản ứng PCR sau thực với DNA bị biến đổi, sử dụng cặp mồi giống ngoại trừ vị trí đảo CpG trình tự mồi Tại điểm này, cặp mồi bổ sung với cytosines để khuếch đại DNA bị methyl hóa, cặp mồi bổ sung với uracil hay thymine để khuếch đại DNA khơng bị methyl hóa MSP sử dụng qPCR thực để xác định thông tin số lượng chất lượng DNA bị methyl hóa  Miniprimer PCR: Sử dụng polymerase chịu nhiệt (S – TBR) kéo dài từ đoạn mồi ngắn “smalligos” khoảng 10 nucleotide Phương pháp cho phép phản ứng PCR nhắm đến mồi liên kết với vùng có kích thước nhỏ hơn, sử dụng để khuếch đại trình tự DNA bảo thủ, gen rRNA 16S (hay 18S sinh vật nhân thực)  Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA): cho phép khuếch đại đa mục tiêu với cặp mồi nhất, tránh giới hạn độ phân giải PCR đa mồi  Multiplex-PCR: bao gồm nhiều cặp mồi hỗn hợp PCR để tạo kích thước khác đặc trưng cho trình tự DNA khác Với nhiều gen đích khuếch đại lúc, nhiều thơng tin thu từ lần chạy mà khơng địi hỏi nhiều hóa chất thời gian thực Nhiệt độ gắn mồi phải tối ưu hóa cho cặp mồi để chúng thực xác phản ứng đơn, với nhiều kích thước khuếch đại khác Như chiều dài cặp bazơ phải khác để tạo băng phân biệt mắt thường điện di  Nanoparticle-Assisted PCR (nanoPCR): Trong năm gần đây, số báo cáo cho hạt nano (NP) nâng cao hiệu phản ứng PCR (do gọi nanoPCR), chí cịn tốt so với chất tăng cường phản ứng PCR trước Người ta tìm thấy chấm lượng tử (QDs) cải thiện độ đặc hiệu hiệu phản ứng PCR Ống nano cacbon vách (SWCNTs) ống nano cacbon đa vách (MWCNTs) tăng cường khuếch đại phản ứng PCR dài Nanopowder Carbon (CN) báo cáo nâng cao hiệu phản ứng PCR lặp PCR dài Hạt nano ZnO, TiO2, Ag tìm để tăng hiệu suất phản ứng PCR Điều quan trọng là, liệu trước rằng, hạt nano phi kim loại đảm bảo tính xác thực phản ứng khuếch đại giới hạn cho phép Sử dụng nhiều hạt nano có khả cải tiến hiệu suất PCR, rõ ràng chúng có tiềm lớn để cải tiến công nghệ nanoPCR phát triển sản phẩm  Nested PCR: PCR lồng làm tăng độ đặc hiệu phản ứng PCR cách giảm độ nhiễu khuếch đại DNA không đặc hiệu Sử dụng hai cặp mồi hai phản ứng PCR liên tiếp Trong phản ứng đầu tiên, cặp mồi sử dụng để tạo sản phẩm DNA, bên cạnh đoạn DNA đích mà phản ứng hướng đến bao gồm đoạn DNA khuếch đại khơng đặc hiệu Các sản phẩm sau sử dụng tiếp phản ứng PCR thứ hai với cặp mồi mà vị trí gắn khác hồn tồn khác phần từ vị trí 3′ mồi phản ứng PCR lồng thường thành công phản ứng PCR thông thường đặc biệt trường hợp khuếch đại đoạn DNA dài, địi hỏi thơng tin chi tiết trình tự đích  Overlap-extension PCR or Splicing by overlap extension (SOEing): kỹ thuật kỹ thuật di truyền sử dụng để ghép nối hai nhiều phân đoạn DNA có chứa trình tự bổ sung với Nó sử dụng để nối đoạn DNA chứa gen , trình tự điều hòa, đột biến; kỹ thuật cho phép tạo DNA cấu trúc đặc trưng dài Nó thêm vào đột biến mất, thêm hay đột biến điểm để tạo thành trình tự DNA khác  PAN-AC: sử dụng điều kiện đẳng nhiệt để khuếch đại DNA, sử dụng tế bào sống  Quantitative PCR (qPCR): PCR định lượng sử dụng để đo số lượng trình tự đích (thường thời gian thực) Nó đo hàm lượng ban đầu DNA, cDNA, RNA PCR định lượng thường sử dụng để xác định xem có mặt trình tự DNA mẫu số lượng mẫu PCR định lượng có độ xác cao Phương pháp PCR định lượng sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn Sybr Green, EvaGreen đầu dò DNA chứa huỳnh quang, TaqMan, để đo số lượng sản phẩm khuếch đại thời gian thực Đơi khi, viết tắt RT – PCR (real – time PCR) chữ viết tắt nên sử dụng cho PCR phiên mã ngược qPCR thường viết tắt cho PCR định lượng  Reverse Transcription PCR (RT-PCR): PCR phiên mã ngược dùng để khuếch đại DNA từ RNA Enzyme phiên mã ngược mã ngược RNA tạo thành cDNA, sau cDNA khuếch đại PCR RT – PCR sử dụng rộng rãi biểu gene, để xác định biểu gen để xác định trình tự mã RNA, bao gồm vùng khởi đầu kết thúc phiên mã Nếu biết trình tự DNA gen, RT – PCR sử dụng để lập đồ vị trí exon intron gen Đầu 5′ gen (tương ứng với vị trí khởi đầu phiên mã) thường xác định RACE – PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends – PCR)  Solid Phase PCR: bao gồm nhiều nghĩa, có Polony Amplification (nơi cụm PCR tìm thấy gel ví dụ), PCR cầu (cặp mồi liên kết cộng hóa trị với bề mặt rắn có chức hỗ trợ) Gồm Solid Phase PCR thường Solid Phase PCR tăng cường  Suicide PCR: sử dụng nhiều nghiên cứu, điển hình lĩnh vực“paleogenetics” để tránh kết dương tính giả đảm bảo đặc hiệu trình tự đích cần khuếch đại Kĩ thuật bắt nguồn từ nghiên cứu xác định lại tồn vi khuẩn Yersinia pestis mẫu thu từ phần mộ nạn nhân bị chết đại dịch “cái chết đen” (Black Death) kỉ 14 Vào thời điểm đó, phương pháp cho phép sử dụng lần với cặp mồi phản ứng PCR mà cặp mồi hoàn tồn chưa sử dụng phản ứng PCR đóng vai trị đối chứng dương trước Hơn nữa, cặp mồi khuếch đại từ hệ gen trình tự đích chưa sử dụng nghiên cứu trước Các điều kiện đảm bảo cho khơng có nhiễm từ phản ứng PCR trước tiến hành phạm vi phịng thí nghiệm, nói cách khác để hạn chế kết dương tính giả  Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR): sử dụng để phân lập trình tự chưa biết nằm cạnh trình từ biết TAIL-PCR sử dụng mồi đặc hiệu bắt cặp với vùng trình tự biết, khuếch đại từ phía mồi suy biến để khuyếch đại từ phía cịn lại trình tự chưa biết  Touchdown PCR (Step-down PCR): phản ứng PCR cải biến để làm giảm khuếch đại không đặc hiệu cách giảm dần nhiệt độ gắn mồi quy trình phản ứng PCR Nhiệt độ gắn mồi chu kì thường cao từ – 5°C so với Tm cặp mồi, đến chu kì sau, nhiệt độ gắn mồi thấp – 5°C so với Tm Nhiệt độ gắn mồi cao giúp tăng tính đặc hiệu trình bắt cặp mồi nhiệt độ gắn mồi thấp cho phép tăng tính hiệu khuếch đại sản phẩm đặc hiệu hình thành chu kì trước  Universal Fast Walking: Thăm dò hệ gen dấu vân tay di truyền cách sử dụng PCR ‘hai chiều’ đặc hiệu so với phương pháp tiếp cận ‘một chiều’ thông thường (chỉ sử dụng mồi đặc trưng cho gen cụ thể mồi chung – mà dẫn đến tượng nhiễu giả) Các ứng dụng phù hợp phương pháp LaNe RAGE (lariat-dependent nested PCR for rapid amplification of genomic DNA ends), 5’RACE LANE 3’RACE Lane 10  Lai DNA cố định màng lai với mẫu dị có đánh dấu phóng xạ, biotin mẫu dị phát quang sinh học Q trình dựa nguyên tắc bổ sung mẫu dò với DNA cố định  Sau trình lai, màng lai rửa để loại mẫu dị khơng bắt cặp cặp chuyên biệt với DNA màng  Cuối cùng, nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi (đối với đầu dị đánh dấu phóng xạ), phương pháp so màu (với đầu dò đánh dấu biotin) hay dựa vào phát quang (với đầu dò phát quang sinh học) để định vị DNA –probe Hình 16 Tóm tắt kĩ thuật Southern blot d) Xử lý số vấn đề thường gặp Southern Blot 31 32 e) Ứng dụng Southern blot - Southern blot sử dụng dể đánh giá copy gen genome, xác định intron, exon, đoạn bị đột biến thêm đoạn… - Khi sử dụng DNA marker khác làm mẫu dị, phân biệt lồi, lồi đồng hình - Southern blot – RFLP: giúp phát đa dạng chiều dài đoạn cắt RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền vị trí nhận biết RE dẫn đến sai biệt chiều dài đoạn DNA tạo từ RE Đồng thời, RFLP sử dụng để xác định huyết thống, lập đồ giới hạn gene - Chẩn đoán bệnh thai nhi 33 f) Tài liệu tham khảo Southern Blot- Sơ lược quy trình xử lý số vấn đề thường gặp http://www.biomedia.vn/review/southern-blot-so-luoc-quy-trinh-va-xu-ly-motso-van-de-thuong-gap.html Ứng dụng nguyên lý kỹ thuật southern blot https://www.sinhhocphantu.org/2018/05/ung-dung-va-nguyen-ly-cua-kythuat_17.html Blotting techniques https://www.slideshare.net/mprasadnaidu/blottingtechniques Công nghệ DNA tái tổ hợp https://www.sinhhocphantu.org/2018/06/congnghe-dna-tai-to-hop.html 34 Northern blot a) Giới thiệu i Khái niệm Phương pháp lai Northern blot phương pháp áp dụng cho RNA, lai DNA – RNA RNA – RNA Phương pháp sử dụng để xác định kích thước hàm lượng mRNA đặc trưng hỗn hợp RNA Kỹ thuật lai Northern blot phát triển vào năm 1977 James Alwine, David Kemp, George Stark Đại học Stanford ii Thủ tục - Bắt đầu với khai thác tổng số RNA từ mẫu mô đồng từ tế bào Nhân điển hình mRNA sau lập thơng qua việc sử dụng phương pháp sắc ký oligo (dT) cellulose để cô lập RNA với poly (A) Mẫu RNA sau phân cách gel điện - Các mẫu RNA, tách theo kích cỡ, chuyển giao cho màng nylon thông qua hệ thống mao mạch máy hút thấm - Mao dẫn thấm thiết lập hệ thống cho việc chuyển giao RNA từ gel điện đến màng thấm - Các đệm chuyển giao sử dụng cho thấm thường chứa Formamide làm giảm nhiệt độ ủ tương tác thăm dị-RNA, loại bỏ cần thiết cho nhiệt độ cao, gây suy thoái RNA - Sau RNA chuyển giao cho màng, cố định thơng qua liên kết cộng hóa trị với màng ánh sáng tia cực tím nhiệt Sau đó, lai với RNA màng - Điều kiện thí nghiệm ảnh hưởng đến hiệu độ đặc hiệu lai bao gồm sức mạnh ion, độ nhớt, độ dài song công, cặp base sai, thành phần iii Gel RNA chạy gel agarose formaldehyde - Các mẫu RNA phổ biến tách gel agarose có chứa formaldehyde chất làm biến tính cho RNA để hạn chế cấu trúc thứ cấp - Gel nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) quan sát ánh sáng tia cực tím để quan sát chất lượng số lượng RNA trước thấm - Gel polyacrylamide electrophoeresis urê sử dụng RNA tách biệt thường sử dụng cho RNA bị phân mảnh hay microRNA - Một thang RNA thường chạy song song với mẫu gel điện để quan sát kích thước 35 mảnh vỡ thu tổng số mẫu RNA tiểu đơn vị ribosome hoạt động đánh dấu kích thước iv Đầu dị - Đầu dò bao gồm axit nucleic với chuỗi bổ sung cho tất phần RNA quan tâm, DNA, RNA, oligonucleotide với tối thiểu 25 sở bổ sung cho chuỗi - Các đầu dò cần phải dán nhãn gắn với đồng vị phóng xạ (32P) với chemiluminescence phosphatase kiềm peroxidase phá vỡ sản xuất chemiluminescent phát xạ phát ánh sáng Việc ghi nhãn chemiluminescent xảy theo hai cách: + Hoặc thăm dò gắn vào enzyme + Hoặc thăm dò dán nhãn với phối tử (ví dụ biotin) mà kháng thể (ví dụ avidin hay streptavidin) gắn vào enzyme - Phim X – ray phát hai tín hiệu phóng xạ chemiluminescent (nhiều nhà nghiên cứu thích tín hiệu chemiluminescent nhanh hơn, nhạy cảm hơn, giảm nguy sức khỏe mà với nhãn phóng xạ) b) Nguyên tắc lai ♦ Dựa nguyên tắc bổ sung cặp bazơ nitơ A – T G – C Các đoạn polynucleotide đơn có nguồn gốc khác có cấu trúc bổ sung với chúng bắt cặp với tạo phân tử lai ♦ Phương pháp bao gồm bước sau: - RNA (đã làm biến tính) phân tách theo kích thước nhờ điện di gel agarose có chứa chất làm biến tính - Các chất làm biến tính có tác dụng khiến liên kết yếu quy định cấu trúc bậc RNA hình thành trở lại sau RNA biến tính Và khơng cản trở di chuyển phân tách RNA gel - Sau RNA chuyển lên màng lai - RNA cố định màng lai đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ - Các phân tử lai phát nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi c) Các phương pháp thực Bước 1: Tách chiết biến tính - Tách chiết RNA khỏi tế bào - Tiến hành điện di hỗn hợp RNA vừa tách gel agarose - Làm biến tính dải băng RNA gel nhờ dung dịch formaldehyde 36 Bước 2: Thẩm tích - Chuyển mRNA lên màng lai nitrocellulose nilon filte Dựa nguyên tắc mao dẫn: Đệm từ phía thấm cách tự nhiên lên chuyển mạch DNA từ gel lên màng bám chặt vào màng Hình 17 Kỹ thuật chuyển RNA từ gel agarose lên màng lai Bước 3: Lai với mẫu dị (probe) có đánh dấu phóng xạ - Ủ màng lai với mẫu dị (probe) có gắn đồng vị phóng xạ, chất phát huỳnh quang - DNA cố định màng lai kết hợp probe theo nguyên tắc bổ sung Bước 4: Phóng xạ tự chụp - Rửa trôi probe không gắn - Làm khô - Cho chụp phóng xạ tự động - Phát số lượng vị trí nhờ phim phóng xạ tự ghi hiển thị huỳnh quang d) Tổng quát: - RNA làm biến tính formanldehyde phân tách theo kích thước nhờ điện di gel agarose - RNA chuyển lên màng lai thẩm tích 37 - RNA cố định màng lai đem lai với mẫu dị đánh dấu phóng xạ - Các phân tử lai phát nhờ kĩ thuật phóng xạ tự chụp Hình 18 Tóm tắt kĩ thuật Northern blot e) Ứng dụng - Có thể nghiên cứu mRNA cụ thể đoạn DNA tách dòng Xác định hàm lượng độ dài mRNA - So sánh khác gen tế bào đột biến tế bào bình thường - Phát mRNA gene q trình phiên mã, nói cách khác chứng gene nghiên cứu hóa thành mRNA - Xác định so sánh mức độ biểu gen khác loại tế bào, mô quan khác thể giai đoạn giai đoạn khác trình phát triển thể f) Tài liệu tham khảo Northen Blot https://www.genome.gov/genetics-glossary/Northern-Blot TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP NORTHERN BLOT, SOUTHERN BLOT, WESTERN BLOT http://www.thuvientailieu.vn/tai-lieu/tieu-luan-phuong-phapnorthern-blot-southern-blot-western-blot-14049/ 38 Western blot a) Khái quát Western blot phương pháp phát protein phương pháp điện di gel SDSPAGE, thường sử dụng kháng thể có gắn phóng xạ gắn huỳnh quang để phát loại protein đó, dùng rộng rãi chẩn đoán HIV, viêm gan Phương pháp sử dụng điện di gel để phân tách protein nguyên vẹn cấu trúc 3D hay protein biến tính theo độ dài mạch polypeptide Protein sau chuyển lên màng (thường sử dụng màng nitrocellulose hay màng PVDF), chúng gắn kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu Điện di gel đưa vào hệ thống phân tích Western blot nhằm giải vấn đề phản ứng chéo kháng thể Nhiều cơng ty hóa chất chun cung cấp kháng thể (cả kháng thể đơn dòng kháng thể đa dòng) tương ứng vời hàng ngàn protein khác Các kháng thể thương mại thường có giá thành cao, kháng thể không liên kết tái sử dụng thí nghiệm Phương pháp sử dụng nhiều lĩnh vực sinh học phân tử, miễn dịch gen ngành sinh học phân tử khác Một số công cụ tìm kiếm, CiteAb, Antibodypedia, SeekProducts, sử dụng để giúp nhà nghiên cứu tìm kiếm kháng thể thích hợp để sử dụng phương pháp Western blot Những phương pháp liên quan khác bao gồm phương pháp lai phân tử (dot blot), hóa mơ miễn dịch hóa tế bào miễn dịch, kháng thể sử dụng để phát protein mô tế bào cách nhuộm miễn dịch, hấp thụ miễn dịch lên liên kết enzyme (ELISA) b) Nguyên lý Western blot kỹ thuật lai protein với protein (Kháng nguyên – Kháng thể) Protein kháng nguyên phát qua phản ứng tạo màu phát huỳnh quang Trong Western blot, hỗn hợp protein phân tách điện di SDS – PAGE, miếng gel ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS) – tác nhân biến tính protein Các vạch protein chuyển lên màng nitrocellulose vạch protein phát cách ngâm màng cellulose với kháng thể đơn dịng đa dịng có gắn enzyme đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm Nếu protein quan tâm kết hợp kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí điểm phát cách chụp màng lên film X quang 39 Hình 19 Các bước thực kỹ thuật Western blot c) Các bước thực Bước 1: Xử lý mẫu Lấy mẫu từ toàn mô hay môi trường nuôi cấy tế bào Đầu tiên, xử lý mô rắn phương pháp học sử dụng máy nghiền, sử dụng máy đồng hóa siêu âm Những mẫu virus hay mẫu lấy trừ mơi trường ni cấy nguồn protein xác định Western blot Thêm loại chất tẩy rửa, muối dung dịch đệm để ly giải tế bào hòa tan protein Bước 2: Điện di gel Điện di gel để phân tách protein mẫu Sự phân tách protein dựa điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích phối hợp yếu tố Phương pháp điện di phổ biến điện di gel polyacrylamide có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS) Phương pháp SDS – PAGE (điện di gel polyacrylamide có bổ sung SDS) giữ polypeptide trạng thái biến tính sau chúng xử lý với chất khử mạnh cấu trúc bậc 2, cấu trúc bậc 40 Các mẫu nạp vào giếng gel Thường để lại giếng cho thị (marker) thang chuẩn ladder, sản phẩm thương mại có chứa hỗn hợp protein với khối lượng phân tử xác định nhuộm để tạo band màu nhìn thấy Khi điện thiết lập gel, protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác phụ thuộc vào khối lượng phân tử chúng Vận tốc khác protein (sự khác biệt độ di động điện di) tạo thành vạch khác giếng Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai Để protein phát kháng thể protein phải chuyển từ gel lên màng lai Phương pháp để chuyển protein gọi phương pháp thẩm tách điện sử dụng dòng điện để kéo protein từ gel lên màng PVDF màng nitrocellulose Các protein chuyển lên màng mà trì xếp gel Kết protein phơi lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking) Do kháng thể protein đích protein, nên thường thực bước để ngăn chặn liên kết màng kháng thể sử dụng để xác định protein mục tiêu Việc ngăn chặn liên kết không đặc hiệu cách đặt màng vào dung dịch protein lỗng albumin huyết tương bị 3-5 % (BSA) sữa bột không béo Tris – Buffered saline (TBS) Protein dung dịch loãng gắn với màng tất vị trí mà protein đích chưa gắn vào Do kháng thể bổ sung vào, khơng cịn chỗ bám màng ngoại trừ vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích Điều làm giảm nhiễu sản phẩm cuối Western blot, cho kết rõ ràng ngoại trừ tượng dương tính giả Bước 5: Quá trình lai phát vị trí lai Để phát protein chuyên biệt, màng dò protein quan tâm kháng thể biến đổi có khả liên kết với enzyme thơng báo, enzyme kết hợp với chất tương ứng thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang tạo màu Quá trình diễn gồm bước: - Màng lai cố định protein lai với kháng thể sơ cấp (Ab1) Kháng thể sơ cấp kháng thể đặc hiệu tao cho vật chủ hay môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm - Sau rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp – Ab2) có gắn enzyme (thường sử dụng horseradish peroxidase) Tiếp tục ủ màng lai hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme Đặt phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát điểm sáng phát enzyme 41 Có thể sử dụng nhiều phương pháp để phát kháng thể thứ cấp: sử dụng xạ hồng ngoại gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử dụng đánh dấu phóng xạ Hình 20 Chuyển protein lên màng (blotting), khóa màng phát protein đích d) Tổng quát Kỹ thuật Western blot bao gồm nhiều trình, chia thành bước bản: - Chuẩn bị mẫu protein - Điện di gel mỏng SDS-PAGE (Electrophoresis) - Di chuyển lên màng Sinh học (Blotting) - Phát protein đích (Detection) 42 Hình 21 Tóm tắt kỹ thuật Western blot e) Ứng dụng - Kỹ thuật Western blot dùng để xác định hoạt động gel thông qua có mặt protein mơ - Kỹ thuật Western blot dùng để phát tín hiệu phân tử protein đích từ hỗn hợp protein Và đặc biệt labo nghiên cứu, kỹ thuật Western blot thường xuyên sử dụng để so sánh biểu phân tử protein đích với một vài protein khác - Kỹ thuật Western blot ứng dụng việc dự đốn kích cỡ ước tính khối lượng phân tử protein lạ, thơng qua so sánh với vạch tín hiệu từ phân tử protein biết rõ kích cỡ khối lượng phân tử - Kỹ thuật Western blot ứng dụng sử dụng chẩn đoán xét nghiệm cho HIV Kỹ thuật Western blot cho biết liệu mẫu phẩm bệnh nhân có chứa kháng thể có khả tương tác đặc hiệu với nhiều phân tử protein virus hay không - Kỹ thuật Western blot ứng dụng chẩn đoán phát kháng thể đặc hiệu mẫu bệnh phẩm, cho bệnh nhiễm ấu trùng sán lợn hệ thần kinh (Neurocysticercois) Viêm màng não bệnh lao (Tubercular meningitis) f) Tài liệu tham khảo Nguyễn Cơng Trình (Sep 19, 2020) Giới thiệu bề kỹ thuật Western Blot https://tailieuhoctap123blog.wordpress.com/2020/09/19/gioi-thieu-co-ban-ve-ky-thuatwestern-blot-nguyen-cong-trinh-st/ Phương pháp Western Blot http://biomedia.vn/review/phuong-phap-western-blot.html Phương pháp Western Blot https://www.impehcm.org.vn/noi-dung/kham-benh-giunsan/phuong-phap-western-blot.html Ứng dụng nguyên lý kỹ thuật Western blot https://www.sinhhocphantu.org/2018/05/ung-dung-va-nguyen-ly-cua-ky-thuat.html Western Blot số lưu ý https://genesmart.vn/western-blot-va-mot-so-luu-y Tổng quan Western blot (thẩm tách miễn dịch) https://tapchisinhhoc.com/western-blottham-tach-mien-dich-tong-quan.html/ 43 44 PHẦN 2: Ý TƯỞNG Đề tài: Kiểm soát ung thư - Dựa nguyên lý điều hòa biểu gene mức độ chất nhiễm sắc: Methyl hóa cytosine gene điều hịa phân chia tế bào Ví dụ, gene RAS mã hố protein ras, mang tín hiệu từ thụ thể gắn vào màng tế bào đường RASMAPKinase tới nhân tế bào, điều hòa phân chia tế bào Các đột biến dẫn đến hoạt hóa khơng thích hợp protein ras, dẫn đến tăng trưởng tế bào khơng kiểm sốt Trên thực tế, protein ras bất thường gặp khoảng 25% loại ung thư người Do đó, việc bất hoạt gene RAS bị đột biến phương án hợp lý giúp làm giảm biểu tế bào ung thư - Hoạt hóa gene áp chế khối u p53: Protein p53 đóng vai trị quan trọng trình làm chết tế bào theo lập trình (apoptosis) Việc tăng biểu gene áp chế khối u p53 giúp tăng lượng protein p53, nhờ làm giảm tăng sinh tế bào ung thư hình thành khối u Trong trường hợp gen chức đột biến di truyền đột biến mới, hệ thống theo dõi bắt cặp DNA bị hiệu quả, tế bào có đột biến di truyền tự phát tồn nhân lên, cuối hình thành khối u Để khắc phục, ta dùng kĩ thuật DNA tái tổ hợp cấy chúng vào hệ gene loài vi khuẩn phù hợp, từ tạo nên lượng lớn protein p53, lực lượng hùng hậu việc kiểm soát chu kì tế bào Tài liệu tham khảo: Cơ sở tế bào phân tử ung thư https://www.msdmanuals.com/vi/chuy %C3%AAn-gia/huy%E1%BA%BFt-h%E1%BB%8Dc-v%C3%A0-ung-th %C6%B0-h%E1%BB%8Dc/t%E1%BB%95ng-quan-v%E1%BB%81-ung-th %C6%B0/c%C6%A1-s%E1%BB%9F-t%E1%BA%BF-b%C3%A0o-v %C3%A0-ph%C3%A2n-t%E1%BB%AD-c%E1%BB%A7a-ung-th%C6%B0 P53 https://vi.wikipedia.org/wiki/P53 Campbell phiên 8th Bồi dưỡng Học sinh giỏi 12 – TS Phan Khắc Nghệ 45 ... tỷ Ứng dụng Hiện thành tựu PCR mở nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước,... phép theo dõi trực quan quan sát xem trình điện di tiến hành tới đâu Thuốc nhuộm (Staining): Các phân tử DNA dễ dàng nhìn thấy đèn cực tím mẫu nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide... DNA có kích thước lớn - Chiếu tia tử ngoại (tia UV) để quan sát bang DNA: Khi đoạn DNA di chuyển, chúng phát huỳnh quang đèn tử ngoại để quan sát 16 Hình Các bước cho việc chạy điện di gel agarose