TỔNG QUAN VỀ CÂY KIM TIỀN THẢO DESMODIUM STYRACIFOLIUM (OSBECK) MERR.FABACEAE

Dùng thuốc y học cổ truyền để điều trị sỏi thận đã được bắt đầu chú ý nghiên cứu từ cuối những năm 1970. Kim tiền thảo - Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., họ Đậu (Fabaceae) - là loại dược liệu rất công hiệu để chữa các bệnh về sỏi tiết niệu. Ở Việt Nam cây Kim tiền thảo mọc hoang dại khắp các vùng đồi núi ở nước ta như Hòa Bình, Bắc Giang, Hà Nội, Lạng Sơn, Ninh Bình, Quảng Ngãi…được thu hái vào mùa hạ, mùa thu, có thể dùng tươi hay phơi khô. [9] Theo kinh nghiệm dân gian và y học cổ truyền, Kim tiền thảo là nguồn dược liệu quan trọng dùng để chữa các bệnh về thận, sỏi thận, sỏi túi mật, bàng quang, phù thũng, đái buốt, khó tiêu, thanh nhiệt, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm, trị các chứng nhiệt, ung nhọt, hoàng đản…Tại Việt Nam, Kim tiền thảo đã được nghiên cứu tính kháng khuẩn từ năm 1975, đưa vào Dược liệu Việt Nam từ năm 1978 và có trong Dược điển Việt Nam III xuất bản 2002. Một số công trình nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của Kim tiền thảo có chứa flavonoid, alkaloid, triterpenoid,… Thử nghiệm độc tính trên chuột nhắt có liều tương đương với 333 lần liều lâm sàng đã cho thấy Kim tiền thảo hầu như không có độc tính. Kết quả nghiên cứu lâm sàng cho thấy Kim tiền thảo có hiệu lực điều trị tốt đối với sỏi có gốc Calcium. [8] Xuất phát từ thực tế trên chúng em đã chọn đề tài “ Tổng quan về cây Kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osbeck) Merr.” để tìm hiểu mối quan hệ giữa thành phần hóa học của cây với công dụng dược tính đã được sử dụng làm ra các chế phẩm thông dụng trên thị trường hiện nay. Tổng quan được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: - Tổng quan về thực vật học - Tổng quan về thành phần hóa học - Tổng quan về tác dụng dược lý - Phương pháp chiết xuất - Kiểm nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA DƯỢC BỘ MÔN DƯỢC LIỆU  ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH TỔNG QUAN VỀ CÂY KIM TIỀN THẢO DESMODIUM STYRACIFOLIUM (OSBECK) MERR FABACEAE TP.HCM – 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA DƯỢC BỘ MÔN DƯỢC LIỆU  ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH TỔNG QUAN VỀ CÂY KIM TIỀN THẢO DESMODIUM STYRACIFOLIUM (OSBECK) MERR FABACEAE THÀNH VIÊN MSSV NGUYỄN MẠNH ĐỨC 1511536813 NGUYỄN BÙI HOÀN 1511538949 ĐOÀN THỊ THANH HẬU 1511537217 LƯƠNG NGỌC MAI 1511537695 NGUYỄN CÔNG HUÂN 1511537694 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS PHAN THIỆN VY TP.HCM – 2019 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đồ án chun ngành tổng quan Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium) cách hoàn chỉnh, bên cạnh nỗ lực cố gắng thành viên nhóm, chúng em cịn nhận hướng dẫn, quan tâm nhiệt tình quý Thầy Cô môn suốt thời gian thực đồ án chuyên ngành Trước hết, chúng em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến ThS Phan Thiện Vy, người hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho chúng em hoàn thành đồ án Bên cạnh đó, chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể quý Thầy Cô khoa Dược trường Đại học Nguyễn Tất Thành tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em suốt thời gian theo học trường Chúng em xin chúc nhà trường ngày phát triển, quý Thầy Cô dồi sức khỏe để hoàn thành nhiệm vụ dạy học Với điều kiện vốn kiến thức cịn hạn chế, đồ án chuyên ngành tránh nhiều thiếu sót, chúng em mong nhận góp ý, bảo thêm q Thầy Cơ để đồ án hoàn thiện Một lần chúng em xin gửi đến q Thầy Cơ lời cảm ơn chân thành tốt đẹp nhất! ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1 Vị trí phân loại thực vật 1.1.1 Họ Fabaceae .2 1.1.2 Chi Thóc Lép (Desmodium) .3 1.1.3 Loài Desmodium styracifolium 1.2 Tổng quan thực vật 1.2.1 Mô tả thực vật .4 1.2.2 Vi phẫu .5 1.3 Sinh thái phân bố 1.3.1 Sinh thái 1.3.2 Phân bố .7 1.3.3 Trồng trọt 1.3.4 Thu hoạch chế biến 1.4 Bộ phận dùng CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.1 Flavonoid 2.2 Alkaloid 12 2.3 Terpenoids 12 CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 14 3.1 Tác dụng trị sỏi thận 14 3.2 Tác dụng hệ tim mạch 15 3.3 Tác dụng ức chế alcohol dehydrogenase (ADH) 16 3.4 Trị đường mật viêm không vi khuẩn 16 3.5 Công dụng y học cổ truyền 17 3.5.1 Tính vị, quy kinh 17 iii 3.5.2 Tác dụng 17 3.5.3 Chủ trị .17 3.5.4 Liều dùng 17 3.6 Một số thuốc chế phẩm từ Kim tiền thảo 17 3.6.1 Một số thuốc từ Kim tiền thảo 17 3.6.2 Kiêng kỵ 18 3.6.3 Độc tính 18 3.7 Một số chế phẩm từ Kim tiền thảo 19 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT & PHÂN LẬP .21 4.1 Phương pháp chiết xuất 21 4.1.1 Chiết xuất & phân lập dung môi Methanol (MeOH) 21 4.1.2 Chiết xuất toàn Kim tiền thảo dung môi Ethanol (EtOH) 23 4.1.3 Chiết xuất hạt Kim tiền thảo dung môi Ethanol (EtOH) 25 CHƯƠNG KIỂM NGHIỆM 27 5.1 Mô tả dược liệu 27 5.2.1 Định tính hóa học .27 5.2.2 Sắc ký .27 5.3 Định lượng 28 5.3.1 Phương pháp cân 28 5.3.2 Phương pháp đo phổ tử ngoại 28 5.3.3 Phương pháp đo màu 28 5.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 6.1 Kết luận 30 6.2 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ D Styracifolium Desmodium Styracifolium TFDS Tổng số flavonoid D styracifolium CaOx Canxi oxalat Ang II Angiotensin II OPN Loãng xương ADH Alcohol dehydrogenase (ADH) NAD + Nicotinamide adenine dinucleotide CCE Clematis chinensis EtOH Ethanol MeOH Methanol HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hoa, Kim tiền thảo Hình 1.2 Vi phẫu Kim tiền thảo Hình 1.3 Vi phẫu Thân Kim tiền thảo Hình 2.4 Các công thức cấu tạo Flavonoid .10 Hình 2.5 Các hợp chất Flavonoid từ D styracifolium 11 Hình 2.6 Cấu trúc hóa học – 11 Hình 2.7 Công thức cấu tạo alkaloid D styracifolium 12 Hình 2.8 Soyasoponin I 12 Hình 2.9 Cơng thức cấu tạo saponin triterpenoid .13 Hình 4.10 Hợp chất chiết xuất phân lập Methanol 22 Hình 4.11 Sơ đồ chiết xuất Kim tiền thảo với Methanol .22 Hình 4.12 Hình chụp tia X cấu trúc hợp chất 23 Hình 4.13 Cấu trúc hợp chất phân lập .24 Hình 4.14 Sơ đồ chiết xuất tồn Kim tiền thảo Ethanol 24 Hình 4.15 Cấu trúc hợp chất phân lập từ hạt Kim tiền thảo 25 Hình 4.16 Sơ đồ chiết xuất hạt Kim tiền thảo dung mơi Ethanol 26 Hình 5.17 Sắc ký đồ HPLC dịch chiết Kim tiền thảo bước sóng 272nm 29 Hình 5.18 Các cấu trúc hóa học tương ứng sắc ký đồ hình 5.17 29 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Một số chế phẩm thông dụng 20 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Dùng thuốc y học cổ truyền để điều trị sỏi thận bắt đầu ý nghiên cứu từ cuối năm 1970 Kim tiền thảo - Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., họ Đậu (Fabaceae) - loại dược liệu công hiệu để chữa bệnh sỏi tiết niệu Ở Việt Nam Kim tiền thảo mọc hoang dại khắp vùng đồi núi nước ta Hịa Bình, Bắc Giang, Hà Nội, Lạng Sơn, Ninh Bình, Quảng Ngãi…được thu hái vào mùa hạ, mùa thu, dùng tươi hay phơi khơ [9] Theo kinh nghiệm dân gian y học cổ truyền, Kim tiền thảo nguồn dược liệu quan trọng dùng để chữa bệnh thận, sỏi thận, sỏi túi mật, bàng quang, phù thũng, đái buốt, khó tiêu, nhiệt, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm, trị chứng nhiệt, ung nhọt, hoàng đản…Tại Việt Nam, Kim tiền thảo nghiên cứu tính kháng khuẩn từ năm 1975, đưa vào Dược liệu Việt Nam từ năm 1978 có Dược điển Việt Nam III xuất 2002 Một số cơng trình nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học Kim tiền thảo có chứa flavonoid, alkaloid, triterpenoid,… Thử nghiệm độc tính chuột nhắt có liều tương đương với 333 lần liều lâm sàng cho thấy Kim tiền thảo khơng có độc tính Kết nghiên cứu lâm sàng cho thấy Kim tiền thảo có hiệu lực điều trị tốt sỏi có gốc Calcium [8] Xuất phát từ thực tế chúng em chọn đề tài “ Tổng quan Kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osbeck) Merr.” để tìm hiểu mối quan hệ thành phần hóa học với cơng dụng dược tính sử dụng làm chế phẩm thông dụng thị trường Tổng quan thực với mục tiêu cụ thể sau: - Tổng quan thực vật học - Tổng quan thành phần hóa học - Tổng quan tác dụng dược lý - Phương pháp chiết xuất - Kiểm nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1 Vị trí phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại Bentham and Hooker’s, vị trí Desmodium styracifolium (Osb.) Merr xếp sau: Giới thực vật (Plantae) Phân giới thực vật bậc cao Ngành Thực vật có hoa (Magnoliophyta) Phân lớp Hai mầm (Magnoliophyta) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Chi Thóc lép (Desmodium) Lồi Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.[17] 1.1.1 Họ Fabaceae Dạng sống: Thân gỗ to hay nhỏ, dây leo nhờ thân quấn hay vòi cỏ sống năm hay nhiều năm, đa số thân non có lơng Rễ: Có nốt rễ chứa vi khuẩn cộng sinh, có khả cố định nitơ khơng khí, có biến thành củ Lá: Mọc cách, kép hình lơng chim 1-2 lần, chẵn hay lẻ Lá kép đơi giảm cịn chét thu hẹp thành vịi Đơi khơng có Cụm hoa thường chùm cành hay nách Hoa: Hoa đối xứng bên, cánh hoa cờ (cánh lớn trùm lên cánh bên), tràng tiền khai lợp úp Nhị 10, tất dính thành ống, dính cịn thứ 10 tự Nỗn cong hình móng ngựa có chân ngắn Quả: Đậu đơi khơng mở mà phân đốt, đứt khúc thành đoạn có hạt bên Thế giới có 500 chi, 20.000 lồi Phân bố tồn cầu Việt Nam có 90 chi, 450 loài Phân loại: Họ phân thành 10 - 11 tông vào dạng sống, dạng lá, mức độ dính nhị Sophoreae, Podalyrieae, Genisteae, Trifolieae, Loteae, Galegeae, Hedysareae, Vicieae, Phaseoleae, Dalbergieae Một số gộp họ: Mimosaceae, 3.7 Một số chế phẩm từ Kim tiền thảo CÔNG DỤNG CHẾ PHẨM Kim tiền thảo - Công Ty Cổ Phần dược Hậu Giang - Thành phần: Cao khô Kim tiền thảo 200mg, tương đương Kim tiền thảo khô 2,5g, tá dược vừa đủ viên - Công dụng: Hỗ trợ điều trị sỏi đường tiết niệu: sỏi thận, sỏi bàng quang, sỏi niệu quản sỏi mật Kim tiền thảo OPC - Công ty Cổ Phần dược phẩm OPC - Thành phần:120mg cao khô Kim Tiền Thảo tá duợc vừa đủ viên - Công dụng: Hỗ trợ điều trị sỏi đường tiết niệu: sỏi thận, sỏi bàng quang, sỏi niệu quản sỏi mật Trà Kim tiền thảo Lava - Công ty TNHH Lava - Thành phần: Kim tiền thảo 100% - Công dụng: + Trị gan mật kết sỏi, sỏi thận, tiểu buốt + Tống sạn mật, làm giảm đau mật co thắt + Ức chế hình thành sỏi thận Viên Tán Sỏi Tống Thạch Hồn - Cơng ty Cổ Phần ONEPHARM - Thành phần: Kim Tiền Thảo, Thạch Vĩ, Hải Kim Sa, Râu Ngô,… - Công dụng: Hỗ trợ điều trị sỏi đường tiết niệu: sỏi thận, sỏi bàng quang, sỏi niệu quản sỏi mật 19 Cao Kim Tiền Thảo - Công ty TNHH Đông Nam dược Minh Nhi - Thành phần: 100% Cây kim Tiền Thảo - Công dụng: + Trị gan mật kết sỏi, sỏi thận, sỏi niệu, tiểu buốt, tiểu dắt + Tống sạn mật, làm giảm đau mật co thắt Ức chế hình thành sỏi thận Bảng 3.1 Một số chế phẩm thông dụng 20 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT & PHÂN LẬP 4.1 Phương pháp chiết xuất Có nhiều thành phần hoạt chất phương pháp chiết xuất Kim tiền thảo khác nhiên khuôn khổ báo cáo nhóm nghiên cứu trình bày số phương pháp chiết xuất từ nghiên cứu gần phát hoạt chất Phần chiết xuất báo cáo chủ yếu tập trung vào hợp chất flavonoid biết tìm thấy Kim tiền thảo Tuy nhiên khơng có phương pháp chiết chung để chiết flavonoid chúng khác độ tan nước dung mơi hữu [2] Các dẫn chất flavon, flavonol có OH tự vị trí tan dung dịch kiềm lỗng dựa vào để chiết Để chiết flavonoid glycosid phải loại chất thân dầu ether dầu hỏa sau chiết nước nóng hoăc methanol ethanol hay hỗn hợp CHCl3 ethanol Để phân lập flavonoid người ta sử dụng phương pháp sắc ký cột Có thể dùng pha tĩnh cellulose, silicagel, magnesol…Một số hệ cột kể đến Sephadex LH20, ODS 4.1.1 Chiết xuất & phân lập dung mơi Methanol (MeOH) Ngun liệu 1kg Kim tiền thảo (tồn cây) chiết hồi lưu MeOH Dịch chiết thu đem cô thu hồi dung môi thu cao MeOH (50 g) Lắc phân bố với nBuOH-H2O để lắng tự nhiên thu cao n-BuOH phân tách kỹ thuật sắc ký cột Sephadex LH-20 (MeOH) thu phân đoạn triterpenoid (21,6 g) flavonoid (9,73 g) Phân đoạn triterpenoid tiếp tục đem cô sắc ký cột silicagel (CHCl3:MeOH:H2O =9:2:0,1 => 8:2:0,2 => 7:3:0,5) thu hợp chất (870 mg) (57 mg) [26] 21 R1 R2 -glc UA2gal2rha H R -glc UA2gal2rha Hình 4.10 Hợp chất chiết xuất phân lập Methanol Kim tiền thảo Chiết hồi lưu với MeOH Cao MeOH Lắc phân bố với n-BuOH-H2O Cao n-BuOH Sắc ký cột Phân đoạn flavonoid (9,73 g) Phân đoạn Triterpenoid (21,6 g) Hợp chất Hợp chất (870 mg) (57mg) Hình 4.11 Sơ đồ chiết xuất Kim tiền thảo với Metanol 22 4.1.2 Chiết xuất toàn Kim tiền thảo dung mơi Ethanol (EtOH) Tồn Kim tiền thảo phơi khô nghiền thành bột (25 kg) chiết hồi lưu EtOH– H2O (9.5:0.5), lần lần 60 phút, thu cao EtOH Hòa tan cao nước nóng tiếp tục lắc phân bố với n-hexane EtOAc Cao n-hexane đem phân tách kỹ thuật sắc ký cột với chất nhồi nhựa macroporous resin tiếp đến sắc ký cột silica gel rửa giải kiểu gradient (petroleum ether–EtOAc, 9:1 → 8:2 →7:3 →6:4 →5:5) thu phân đoạn H-1, H-2, H-3, H-4, H-5 Phân đoạn H-5 sau tiến hành sắc ký cột silica gel rửa giải hexane– acetone (9:1 → 7:3) cho 128 phân đoạn khác Trong số thấy có kết tinh không màu phân đoạn 88-95 Phần kết tinh chia làm phần, phần thứ đem hòa tan MeOH chạy sắc ký cột Sephadex LH-20 (MeOH) thu hợp chất (15 mg) (20 mg) Đây xác định hợp chất isoflavon tìm thấy Hình 4.12 Hình chụp tia X cấu trúc hợp chất Phần lại hòa tan EtOH chạy qua sắc ký cột nhồi macroporous resin dung môi MeOH-H2O (9:1) cột silica gel dung môi dichloromethane–acetone (9:1 →5:5) cho phân đoạn E-1, E-2 E-3 Phân đoạn E-3 tiếp tục chạy qua cột macroporous resin rửa giải MeOH-H2O (8:2) Sephadex LH-20 rửa giải methanol quan sát thấy có phần giàu flavonoid Phần cho chạy qua cột silica gel rửa giải hệ dung môi CH2Cl2–MeOH (8:2 →6:4) cho 90 phân đoạn nhỏ Phân đoạn từ 64-81 sau chạy qua hệ sắc ký cột RP-18 rửa giải MeOH–H2O (3:7 →4:6) Sephadex LH-20 MeOH thu hợp chất (16 mg), (12 mg), (15 mg) (100 mg) Bốn hợp chất xác định isoflavanon 7-O-glycosid (Xem hình 4.14) [23] 23 Hình 4.13 Cấu trúc hợp chất phân lập Kim tiền thảo Chiết hồi lưu với EtOH - H2O Cao EtOH Lắc phân bố với n-hexan EtOAc Và đem sắc ký cột Phân đoạn H1 Phân đoạn H2 Phân đoạn H5 Phân đoạn H4 Phân đoạn H3 Sắc ký cột Phân đoạn 88-95 Hòa tan EtOH chạy sắc ký Phân đoạn E-1 Phân đoạn E-2 Hòa tan MeOH chạy sắc ký Phân đoạn E-3 Hợp chất Hợp chất Rửa giải MeOH–H2O Hợp chất Hợp chất Hợp chất Hợp chất Hình 4.14 Sơ đồ chiết xuất toàn Kim tiền thảo Ethanol 24 4.1.3 Chiết xuất hạt Kim tiền thảo dung môi Ethanol (EtOH) Nguyên liệu hạt Kim tiền thảo nghiền thành bột (15 kg) sau loại bỏ dầu béo ether dầu hỏa chiết hồi lưu lần dung môi EtOH 90% lọc, cô thu cao EtOH Tiếp tục lắc phân bố với CHCl3 (3 × 1:1) n-BuOH (3 × 1:1), thu 171 g 664 g cao Còn lại phần dịch chiết nước chứa 831 g nguyên liệu Qua thử nghiệm in vitro chống oxy hóa gốc tự cho thấy dịch chiết n-BuOH có hiệu đáng kể Do dịch chiết n-BuOH chọn để phân lập nghiên cứu Dịch chiết n-BuOH sau phân tách kỹ thuật sắc ký cột ODS (MeOH– H2O, 1:9–10:0) thu 20 phân đoạn (1-20) Phân đoạn 16 phân lập sắc ký cột silicagel (CHCl3–MeOH, 9:1–1:9) thu phân đoạn nhỏ (16.1-16.8) Phân đoạn 16.8 chạy sắc ký liên tiếp qua hệ ODS (MeOH–H2O, 1:9–4:6), polyamide (MeOH–H2O, 0.5:9.5–10:0), Sephadex LH-20 thu hợp chất (12 mg), (10 mg), (17 mg) Phân đoạn số 19 sau chạy sắc ký cột silica gel (CHCl3–MeOH, 1:9–6:4) cho 10 phân đoạn nhỏ 19-1 – 19-10 Phân đoạn 19-10 chạy sắc ký cột Sephadex LH-20 thu hợp chất (5 mg) Cấu trúc hợp chất xác định kết hợp kỹ thuật quang phổ (Xem hình 4.15) [19] Hình 4.15 Cấu trúc hợp chất phân lập từ hạt Kim tiền thảo 25 Kim tiền thảo Chiết hồi lưu với EtOH Cao EtOH Lắc phân bố với n-BuOH + CHCl3 Cao (171 g) Dịch chiết n-BuOH (831 g) Cao (664 g) Sắc ký cột ODS Phân đoạn 16.8 Hợp chất Hợp chất (MeOH–H2O, Hợp chất Phân đoạn 19 Hợp chất Hình 4.16 Sơ đồ chiết xuất hạt Kim tiền thảo dung môi Ethanol 26 CHƯƠNG KIỂM NGHIỆM 5.1 Mơ tả dược liệu Dược liệu có thân hình trụ, cắt ngắn thành đoạn dài cm đến cm, đường kính khoảng 0,2 cm đến 0,3 cm, phủ đầy lơng mềm, ngắn, màu vàng Chất giịn, mặt bẻ lởm chởm Mùi thơm Bột có màu lục nhạt, mùi thơm, vị nhạt Soi kính hiển vi thấy: Lơng che chở đa bào gồm chân có đến tế bào ngắn, phần lông dài, có đầu nhọn; lơng che chở đơn bào ngắn, đầu nhọn hay có móc hình câu Lơng tiết đa bào chân phình to gồm hàng tế bào, hàng khoảng đến tế bào với chất tiết màu vàng, phần lông thuôn dài, đầu tù Mảnh biểu bì mang lơng che chở lỗ chân lơng bị gãy cịn sót lại, có hình trịn Lỗ khí kiểu song bào (1 to, nhỏ) thường nằm rời Mảnh biểu bì mang đầy lơng che chở Mảnh biểu bì thân gồm tế bào dài, thành mỏng bên thường có rải rác vết sắc to màu nâu, vàng nâu [1] 5.2 Định tính Định tính dựa vào chuyên luận phụ lục Dược Điển Việt Nam IV 5.2.1 Định tính hóa học Lấy g bột dược liệu, thêm 50 ml nước, đun nóng cách thủy 15 phút, lắc nhẹ Để nguội, lọc qua giấy lọc, bốc dịch lọc đến cắn Hòa tan cắn ml ethanol 96 % (TT) dung dịch A Lấy ml dung dịch A, thêm vào bột magnesi (TT) giọt đến giọt acid hydrocloric (TT), xuất màu hồng đen đỏ 5.2.2 Sắc ký Tiến hành sắc ký lớp mỏng sắc ký giấy, phát sắc ký đồ dựa vào màu sắc chúng ánh sáng thường tử ngoại (365 nm) trước sau tác dụng với kiềm (ammoniac) Bản mỏng: Sử dụng mỏng: tráng sẵn GF254 hãng Merck Cơ đặc dịch chiết cịn lại dùng mao quản chấm lên mỏng silicagel (cỡ kính 2,5 x 10 cm) Dung môi khai triển: ethyl acetat- acid formic- nước (80: 10: 10) ethylacetat acid formic nước (4:1:1) ethylacetat acid acetic nước (20:3:4) Bản sắc ký sau khai 27 triển, cho để bay hết dung môi, quan sát vết chất ánh sáng thường, huỳnh quang ánh sáng tử ngoại với bước 254 nm (đối với mỏng silicagel 60 GF254) trước sau cho tác dụng với amoniac Ngồi màu vết chất cách phun dung dịch kiềm, dung dịch AlCl3 2% pha cồn cao độ [1] 5.3 Định lượng Phần định lượng chủ yếu tập trung vào thành phần Flavonoid có dược liệu Kim tiền thảo 5.3.1 Phương pháp cân Áp dụng cho dược liệu giàu flavonoid dịch chiết tạp chất Các bước bao gồm: Loại tạp HCl 0,5% Chiết cồn 96% Thủy phân H2SO4 Lọc lấy quercetin, sấy cân [2] 5.3.2 Phương pháp đo phổ tử ngoại Dựa vào độ hấp thu phân tử (ε) độ hấp thu E 1% 1cm λmax dung môi quy định cho loại flavonoid để định lượng [2] 5.3.3 Phương pháp đo màu Bằng phản ứng cyaniding, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan, chrom…[2] 5.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC Sắc ký HPLC thực cột Agilent TC-C18 (4,6 × 250 mm, mm) cách rửa giải kiểu gradient pha động acetonitril acid formic 0,1% (v / v), nhiệt độ cột 30°C bước sóng phát 272 nm Phương pháp dùng định lượng năm thành phần Kim tiền thảo (vicenin-1, schaftoside, isoschaftoside, vicenin-3 isovitexin) để đánh giá chất lượng dược liệu [25] Sắc ký HPLC-ESI/MS hệ thống gồm máy sắc ký lỏng LC-2010 (Japan) có buồng khử khí chân không, bơm tứ phân, tiêm mẫu tự động phát diod quang Tiến hành chạy sắc ký cột Ultimate XB-C-18 (250x4,6mm, mm), nhiệt độ 300C 28 với pha động acetonitril axit formic theo chương trình gradient định sẵn sau: 0-8 phút, 10-12% B; 8-45 phút, 12-14% B; 45-55 phút, 14-15% B; 55-70 phút, 1535% B; 70-80phút, 35-50% B; 80-90 phút, 50-55% B Phát bước sóng 272nm, tốc độ dịng 1ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10µl Để phân tích HPLC-MS máy đo khối phổ kết nối vào hệ thống thông qua phận ion hóa ESI Việc thu thập liệu sử dụng phần mềm Agilent Technologies Chem Station Bên cạnh sử dụng sắc ký dấu vân tay với điều kiện tương tự Để phân tích sắc ký dấu vân tay sắc ký đồ phải chuẩn hóa thơng qua việc lựa chọn peak phổ biến đặc trưng, 15 mẫu dịch chiết từ Kim tiền thảo thu hoạch khu vực địa lý khác chạy HPLC cho sắc ký với 35 peak có 20 peak cho phổ biến xuất tất mẫu (Hình 5.16) [18] Hình 5.17 Sắc ký đồ HPLC dịch chiết Kim tiền thảo bước sóng 272nm R1=Glc, R2=Glc, R3=R4=H R1=-Glc(2-1)Xyl, R2=R4=H, R3=OH R1=Xyl, R2=Glc, R3=R4=H R1=Glc, R2=Ara, R3=R4=H R1=Ara, R2=Glc, R3=R4=H R1=Glc, R2=Xyl, R3=R4=H R1=Glc, R2=R3=R4=H 10 R1=Glc, R2=R4=H, R3=OH 15 R1=R2=R4=H, R3=OH 16 R1=R2=R3=R4=H 17 R1=R2=R4=H, R3=OCH3 12 R1=Oglc, R2=R3=H, R4=OH 13 R1=R2=OH, R3=H, R4=OH 14 R1=OH, R2=R4=H, R3=OCH3 19 R1=R2=R3=OCH3 20 R1=R3=OCH3, R2=H Hình 5.18 Các cấu trúc hóa học tương ứng sắc ký đồ hình 5.17 29 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu Kim tiền thảo cho thấy kết tổng quan thực vật học Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng phát triển cho thấy Kim tiền thảo loại dễ trồng, phân bố rộng rãi nhiều nơi, sinh trưởng nhanh cho thời gian thu hoạch ngắn Tuy nhiên với khai thác liên tục mà biện pháp tái trồng trọt nhân giống dẫn đến nguồn Kim tiền thảo Việt Nam giảm rõ rệt Phần tổng quan thành phần hóa học cho thấy Kim tiền thảo có thành phần flavonoid, alkaloid, triterpenoid ngồi cịn có hợp chất Steroides, Phenolic acid, Polysaccharid, Tinh dầu dễ bay Phần tổng quan tác dụng dược lý cho thấy dược liệu có tác dụng chữa sỏi thận, sỏi mật hiệu với số tác dụng khác lên hệ tim mạch, tiêu hóa, tiết niệu dần nghiên cứu sâu Ngày với tiến khoa học kỹ thuật, nhà nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất có hoạt tính quan trọng Kim tiền thảo thay đổi dạng bào chế sản phẩm có tác dụng hiệu tiện lợi cho người dùng 6.2 Kiến nghị Với kiến thức hạn chế thời gian khóa luận có giới hạn nên báo cáo chưa chi tiết hoàn chỉnh Một số điểm cần phải nghiên cứu thêm như: Hoạt tính sinh học, đánh giá mức độ hiệu điều trị bệnh Các hợp chất mới, đặc biệt flavonoid tìm thấy nghiên cứu gần hạt Kim tiền thảo Các phương pháp nhân giống trồng trọt hiệu để bảo tồn phát triển loài dược liệu 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam tái lần thứ 4, Nhà xuất Y học, Hà Nội [2] Bộ y tế, Sách dược liệu học tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội [3] ĐHYD, Tra cứu thuốc, Cây Kim tiền thảo, 01/12/2019, http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/201 [4] Hội đồng dược điển Việt Nam (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y Học, Hà Nội [5] Nguyễn Ngọc Bách (2007), “Báo nông nghiệp Việt Nam”, Cây Kim Tiền Thảo, 24/12/2007, https://nongnghiep.vn/cay-kim-tien-thao-post4975.html [6] OPC, Thành phần hóa học, 9/12/2019, http://www.kimtienthao.vn/thanh-phanhoa-hoc/ [7] OPCpharma, Vườn dược liệu, Kim tiền thảo, 28/12/2015, https://opcpharma.com/vuon-duoc-lieu/kim-tien-thao.html [8] OPCpharma, trình nghiên cứu thuốc trị sỏi thận Kim Tiền Thảo, 15/16/2016, https://opcpharma.com/kien-thuc-y-hoc/suc-khoe-cho-moi-nguoi/qua-trinh-nghiencuu-thuoc-tri-soi-than-kim-tien-thao.html [9] Phytopharma, Kim Tiền Thảo (Herba Desmodii), 18/06/2013, https://www.phytopharma.vn/index.php/vi/cay-thuoc-viet-nam/131-kim-tien-thao [10] Phúc Tâm Đường, Từ điển vị thuốc, Kim tiền thảo, 18/09/2014, https://www.phuctamduong.com/Vi-thuoc-van-K/KIM-TIEN-THAO-1017.html [11] Thầy thuốc bạn, từ điển vị thuốc, Kim tiền thảo, 9/12/2019, https://amp.thaythuoccuaban.com/vithuoc/Kimtienthao.htm [12] Thuốc dân tộc, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng thuốc dân tộc, Kim Tiền Thảo, 03/07/2019, https://www.thuocdantoc.org/duoc-lieu/kim-tien-thao [13] Thuốc vườn nhà, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, http://www.thuocvuonnha.com/nhung-cay-thuoc-va-vi-thuoc-viet-nam/ket-qua-tracuu/kim-tien-thao 31 [14] Tra cứu dược liệu, Kim Tiền Thảo, 9/12/2019, http://tracuuduoclieu.vn/kim-tienthao.html [15]Trương Thị Đẹp (2007), “Thực vật dược”, NXB Y học Hà Nội, tr.245 [16]Võ Văn Chi (1997), “Từ điển thuốc Việt Nam”, NXB Y học [17] Wikipedia, Kim Tiền thảo, 17/07/2018, https://vi.wikipedia.org/wiki/Kim_ti%E1%BB%81n_th%E1%BA%A3o TIẾNG ANH [18] C Zhou, JG Luo, LY Kong (2012), “Quality Evaluation of Desmodium styracifolium Using High-performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detection and Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectrometry”, Phytochemical Analysis, pp 240-247 [19] Cheng, Xuan-xuan & Tang, et al (2018), “New Flavonol Glycosides from the Seeds of Desmodium styracifolium”, Chemistry of Natural Compounds, pp 846-850 [20] CS Hồ, YH Wong, KW Chiu (1989), “The Hypotensive Action of Desmodium styracifolium and Clematis chinensis”, The American Journal of Chinese Medicine, Vol 17, No 03n04, pp 189-202 [21] Jianfu Zhou, Jing Jin, et al (2018), “Total flavonoids of Desmodium styracifolium attenuates the formation of hydroxy-l-proline-induced calcium oxalate urolithiasis in rats”, Urolithiasis, pp 231–241 [22] Lijanglijang Liu, Miao Chen, Xiaoqing Chen, (2015) “ Analysis of alcohol dehydrogenase inhibitors from Desmodium styracifolium using centrifugal ultrafiltration coupled with HPLC–MS”, Journal of the Serbian Chemical Society, 80, pp.1051-1059 [23] Ming Zhao, Jin-Ao Duan, Chun-Tao Che (2007), “Isoflavanones and their Oglycosides from Desmodium styracifolium”, Phytochemistry, pp 1471-1479 [24] Minh Giang Phan, et al (2010),“Flavonoid compounds from Desmodium styracifolium of Vietnamese origin”, Chemistry of Natural Compounds, pp.797– 798 32 [25] Sun, Xianduo, et al (2018), “An effective quantitative fingerprint method for evaluating the quality consistency of Desmodium styracifolium”, Die Pharmazie An International Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 73, pp 579-584 [26] Tomoko Kubo, Shuichi Hamada, et al (1989), “Study on the Constituents of Desmodium styracifolium”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Volume 37, pp 2229-2231 33 ... CHUYÊN NGÀNH TỔNG QUAN VỀ CÂY KIM TIỀN THẢO DESMODIUM STYRACIFOLIUM (OSBECK) MERR FABACEAE THÀNH VIÊN MSSV NGUYỄN MẠNH ĐỨC 151 1536813 NGUYỄN BÙI HOÀN 151 1538949 ĐOÀN THỊ THANH HẬU 151 1537217 LƯƠNG... thấy Kim tiền thảo có hiệu lực điều trị tốt sỏi có gốc Calcium [8] Xuất phát từ thực tế chúng em chọn đề tài “ Tổng quan Kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osbeck) Merr. ” để tìm hiểu mối quan. .. bên có – hạt nhỏ (Xem hình 1.1.B)[7][13] A B C Hình 1.1 Hoa, Kim Tiền Thảo A Hoa Kim tiền thảo B Lá, Kim tiền thảo C Toàn Kim tiền thảo 1.2.2 Vi phẫu Lá: có gân lồi mặt Tế bào biểu bì gân có kích