Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay vẫn chƣa có nghiên cứu cụ thể về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây này. Chính vì vậy, trong khóa luận này, chúng tôi sẽ cùng đi sâu tìm hiểu, nghiên cứu đặc điểm thực vật và khảo sát về thành phần hóa học có trong cây Dây đau xƣơng, nhằm góp phần phát triển nghiên cứu công dụng, tác dụng của cây trong điều trị bệnh. Chính vì vậy, khóa luận đƣợc tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Dây đau xƣơng (Tinospora sinensis (Lour.) Merr)” với các mục tiêu: + Xác định đƣợc các đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của cây Dây đau xƣơng. + Chiết xuất, phân lập và xác định đƣợc cấu trúc một số hợp chất của cây Dây đau xƣơng
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC TRƢƠNG THỊ VÂN HOÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY DÂY ĐAU XƢƠNG (Tinospora sinensis Merr) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC TRƢƠNGLỜI THỊCẢM VÂNƠN HOÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY DÂY ĐAU XƢƠNG (Tinospora sinensis Merr) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Tiến Vững ThS Nguyễn Thúc Thu Hƣơng Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến Vững, Phó viện trƣởng Viện pháp y Quốc gia ThS Nguyễn Thúc Thu Hƣơng giảng viên Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tận tình, chu đáo, ln động viên khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Đức Lợi chủ nhiệm Bộ môn Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền DS Nguyễn Thị Mai Trang tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian thực khóa luận Khoa Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu không tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang qúy báu để em bƣớc vào đời cách vững tự tin Em xin trân trọng cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dƣợc cho phép tạo điều kiện cho em đƣợc tham gia nghiên cứu học hỏi Khoa Em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, ngƣời thân gia đình tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập Trong suốt trình làm khóa luận nghiên cứu Khoa, em cố gắng nỗ lực để hồn thành khóa luận Tuy nhiên kiến thức cịn hạn hẹp, thời gian có hạn nguồn tài liệu cịn hạn chế nên khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc góp ý thầy để khóa luận em đƣợc hoàn thiện Cuối em xin kính chúc thầy ln mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc nhƣ sống Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Trƣơng Thị Vân Hoài DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BtOH Butanol CC Sắc ký cột DĐX Dây đau xƣơng EtOAc Etylacetat High Performance Liquid Chromatography HPLC MeOH (Sắc ký lớp mỏng hiệu cao) Methanol Thin layer chromatography TLC SKLM (Sắc ký lớp mỏng) Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Chú thích Trang Hình 1.1 HPLC sắc Berberine chuẩn Berberine đỉnh lúc retetion 8,6 phút đƣợc phát bƣớc sóng 266nm Hình 1.2 HPLC sắc chiết xuất methanol T sinensis Đỉnh thời gian lƣu 8,6 phút tƣơng ứng với Berberin H nh 1.3 Công thức cấu tạo hợp chất phân lập đƣợc từ cành Tinospora sinensis Hình 3.1 Ảnh quan sinh dƣỡng Dây đau xƣơng nghiên 20 cứu Hình 3.2 Ảnh hoa Dây đau xƣơng 21 Hình 3.3 Ảnh Dây đau xƣơng 21 Hình 3.4 Vi phẫu gân Dây đau xƣơng 22 Hình 3.5 Vi phẫu phiến Dây đau xƣơng 23 Hình 3.6 Vi phẫu thân Dây đau xƣơng 23 Hình 3.7 Một số đặc điểm bột thân Dây đau xƣơng 25 Hình 3.8 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ Dây đau 29 xƣơng Hình 3.9 Sơ đồ phân lập chất cắn Ethylacetat 30 Hình 3.10 Cấu trúc hợp chất L1 34 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học hợp chất L2 36 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Chú thích Trang Bảng 3.1 Kết định tính hóa học nhóm chất Dây 26 đau xƣơng Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR L1 Decarin 34 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR L2 Iwamid 36 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Phần thực vật 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm chi Tinospora 1.1.3 Số lƣợng loài phân bố loài thuộc chi 1.2 Đặc điểm Dây đau xương (Tinospora sinensis) 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Thành phần hóa học 1.2.3 Tác dụng sinh học 1.2.4 Các thuốc y học cổ truyền 10 Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.1 Nguyên vật liệu 12 2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ 12 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 13 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 14 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật Dây đau xương 21 3.1.1 Đặc điểm hình thái 21 3.1.2 Đặc điểm vi học 24 3.2 Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 27 3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 28 3.3.1 Định tính sơ nhóm chất dƣợc liệu phản ứng hóa học 28 3.3.2 Phân lập số hợp chất thân Dây đau xƣơng 29 3.4 Bàn luận 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Đất nƣớc ta nằm vành đai nhiệt đới gió mùa, khí hậu có nhiều nét độc đáo đa dạng Điều kiện tự nhiên thực ƣu đãi cho đất nƣớc ngƣời Việt Nam hệ sinh thái phong phú đa dạng, tiềm to lớn tài nguyên thuốc nói riêng dƣợc liệu nói chung Bên cạnh đó, Việt Nam có y học dân tộc lâu đời với tri thức sử dụng loại dƣợc liệu, thuốc có giá trị dùng để chữa bệnh thông thƣờng nan y Nền y học cổ truyền độc đáo bảo vệ sức khỏe cho dân tộc ta suốt chiều dài lịch sử với phƣơng châm “Nam dƣợc trị nam nhân”, biết phát huy nói có tảng vững để phát triển Hiện nay, không Việt Nam mà giới, với xu hƣớng “Trở thiên nhiên” việc sử dụng thuốc từ dƣợc liệu ngƣời dân ngày gia tăng, có tác động có hại phù hợp với qui luật sinh lý thể Theo tổ chức y tế giới (WHO), khoảng 80% dân số giới dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên chăm sóc sức khỏe cộng đồng Vì vậy, thuốc sử dụng thảo dƣợc đối tƣợng nhà khoa học nghiên cứu cách đầy đủ chất hoạt chất có cỏ thiên nhiên Từ đó, định hƣớng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm loại thuốc hay đƣờng tổng hợp để tạo chất có hoạt chất việc chữa trị nhiều loại bệnh Chính việc nghiên cứu thành phần hóa học từ cỏ thiên nhiên có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Trên giới, chi Tinospora Miers (Menispermaceae Juss.) đƣợc biết đến 32 loài, loài thuộc vùng nhiệt đới Châu Phi, lồi có Madagascar 23 lồi thuộc Châu Á đến Châu Úc đảo thuộc biển Thái Bình Dƣơng [24], Trung Quốc có lồi [34], Lào có lồi, Thái Lan có lồi [25] Ở Việt Nam, chi Tinospora có nhiều địa phƣơng nhƣ Quảng Ninh, Bắc Kạn, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Hà Nội, Thái Bình, Ninh Bình (Chợ Ghềnh, Cúc Phƣơng) [6] Cây Dây đau xƣơng có tên khoa học Tinospora sinensis, thuộc chi Tinospora Miers, họ Tiết dê Menispermaceae [8] Trong tài liệu nghiên cứu nƣớc ngoài, có giá trị tuyệt vời điều trị chứng béo phì, chứng khó tiêu, sốt, viêm, giang mai, lt, viêm phế quản, vàng da, bệnh bí tiểu, bệnh da bệnh gan [13] Các dịch chiết nƣớc ethanol đƣợc báo cáo có tiềm dƣợc lý khác nhau, nhƣ chống viêm [33], chống tiểu đƣờng [49] thích ứng miễn dịch [35] Dây đau xƣơng vị thuốc đƣợc dùng phạm vi nhân dân để chữa triệu chứng bệnh tê thấp, đau xƣơng, đau ngƣời, ngồi cịn đƣợc dùng làm thuốc bổ [8] Tuy nhiên, Việt Nam chƣa có nghiên cứu cụ thể đặc điểm thực vật thành phần hóa học Chính vậy, khóa luận này, chúng tơi sâu tìm hiểu, nghiên cứu đặc điểm thực vật khảo sát thành phần hóa học có Dây đau xƣơng, nhằm góp phần phát triển nghiên cứu công dụng, tác dụng điều trị bệnh Chính vậy, khóa luận đƣợc tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Dây đau xƣơng (Tinospora sinensis (Lour.) Merr)” với mục tiêu: + Xác định đƣợc đặc điểm thực vật giám định tên khoa học Dây đau xƣơng + Chiết xuất, phân lập xác định đƣợc cấu trúc số hợp chất Dây đau xƣơng Phản ứng với amoniac: Nhỏ giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ miệng lọ có chứa amoniac đặc mở nút Nếu có flavonoid thấy vết màu vàng đậm lên Phản ứng với NaOH 10%: Lấy 1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy xuất tủa vàng thêm ml nƣớc cất, tủa tan màu vàng dung dịch tăng thêm c, Phản ứng với FeCl3 Lấy 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất dung dịch màu xanh đen Định tính coumarin Dịch chiết chuẩn bị nhƣ phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến hành phản ứng sau: a, Phản ứng mở đóng vịng lacton Cho vào ống nghiệm ống 1ml dịch chiết: - Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% - Ống 2: để nguyên Đun hai ống nghiệm đến sơi, để nguội quan sát Nếu có coumarin quan sát thấy, ống xuất tủa vàng, ống dung dịch Thêm vào hai ống nghiệm ống 1ml nƣớc cất, lắc quan sát: - Ống 1: dd đục - Ống 2: suốt Acid hóa ống vài giọt HCl đặc, ống trở lại nhƣ ống Định tính saponin Phản ứng tạo bọt Cho 0,1 g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm, thêm ml nƣớc cất, bịt ống nghiệm ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm phút Để yên Quan sát cột bọt sau 15 phút Nếu bọt bền vững sơ kết luận có chứa saponin Định tính glycosid tim 15 Cho 10 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml nƣớc, lắc đều, ngâm 24 Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) chì acetat 30% vừa đủ Để lắng, lọc Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ lần với 25 ml cloroform (10 ml,10 ml,5 ml), để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nƣớc cách lọc qua Chia dịch chiết vào ống nghiệm đƣợc sấy khô, đem cô cách thủy đến khô Cắn thu đƣợc để làm phản ứng định tính a, Phản ứng Liberman Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống nghiệm 0,5 ml H2SO4 đặc để dịch lỏng ống nghiệm chia thành hai lớp Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vịng màu hồng tím đến xanh mặt tiếp xúc lớp chất lỏng Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía có mầu xanh b, Phản ứng Baljet Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%, lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử Baljet (cho vào ống nghiệm to phần dung dịch acid picric 1% phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) pha vào ống nghiệm Sẽ xuất màu đỏ cam c, Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%, lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10%, lắc Sẽ xuất màu đỏ nhƣng chóng d, Phản ứng Keller-Kiliani Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%, lắc cho tan hết cắn Thêm vào giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha acid acetic, lắc Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống nghiệm Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vịng màu tím đỏ mặt tiếp xúc lớp chất lỏng Lắc nhẹ ống nghiệm, lớp chất lỏng phía có màu xanh Định tính anthranoid (dạng tự do) 16 a, Phản ứng Borntraeger Chiết xuất: Lấy g bột dƣợc liệu cho vào ống nghiệm (10 ml) Thêm ml nƣớc cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt sôi Lọc dịch chiết cịn nóng qua giấy lọc qua lớp bơng mỏng vào bình gạn dung tích 50 ml Làm nguội dịch lọc Thêm ml cloroform Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nƣớc Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch amoniac 10% Lắc nhẹ có anthranoid tự lớp nƣớc có màu đỏ sim Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ dƣợc liệu có acid chrysophanic Thêm tiếp tục giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp dung môi hữu màu vàng lớp nƣớc đỏ thẫm lúc ban đầu Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Nếu có anthranoid lớp nƣớc có màu đỏ sim Anthranoid tồn phần (dạng glycosid dạng tự do) đƣợc định tính hoàn toàn tƣơng tự nhƣng bƣớc chiết xuất ban đầu thay ml nƣớc cất ml H2SO4 1N Định tính tanin Lấy khoảng g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 10 ml nƣớc cất, đun sôi phút, để nguội, lọc Dịch lọc đƣợc dùng để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng 1: Lấy ml dịch lọc Thêm giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) có tanin xuất màu tủa màu xanh đen xanh nâu nhạt - Phản ứng 2: Lấy ml dịch lọc Thêm giọt đồng acetat 10%, xuất tủa - Phản ứng 3: Lấy ml dịch lọc Thêm giọt chì acetat 10%, tủa - Phản ứng 4: Lấy ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch gelatin 1%, tủa bơng trắng Định tính alcaloid 0,5 g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 15 ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun đến sơi, để nguội, lọc vào bình gạn dung tích 100ml, kiềm hóa dịch lọc dung dịch amoniac 6N (khoảng ml) đến pH = 9-10 Chiết alcaloid cloroform (chiết lần, lần ml) Gộp 17 dịch chiết cloroform Loại nƣớc natrisulfat khan Lấy phần dịch chiết cloroform đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, lần ml Gộp dịch chiết nƣớc Chia vào ống nghiệm nhỏ, ống 1ml Nhỏ vào ống nghiệm 2-3 giọt lần lƣợt thuốc thử sau: - Ống 1: dịch chiết + thuốc thử Bouchardat: xuất tủa nâu đến đỏ nâu - Ống 2: dịch chiết + thuốc thử Dragendorff: xuất tủa vàng cam đến đỏ - Ống 3: dịch chiết + thuốc thử Mayer: xuất tủa vàng cam đến đỏ Định tính đƣờng khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu Lấy khoảng 1g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nƣớc cất, đun sôi phút Để nguội Lọc Dịch lọc đƣợc dùng để làm phản ứng định tính sau: Định tính đường khử: Lấy ml dịch chiết nƣớc Thêm vào giọt thuốc thử Fehling A giọt thuốc thử Fehling B Đun cách thủy 10 phút Đáy ống nghiệm xuất kết tủa đỏ gạch Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn Cho vào ống: - Ống 1: 4ml dịch chiết nƣớc giọt thuốc thử Lugol - Ống 2: 4ml nƣớc cất giọt thuốc thử Lugol Quan sát so sánh hai ống nghiệm: có polysaccharid, ống có màu xanh đậm ống Định tính acid amin: lấy ml dịch chiết nƣớc Thêm giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thủy sôi 10 phút Xuất dung dịch màu xanh tím Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm lớn ml dịch chiết nƣớc Thêm bột Na2CO3 vào ống nghiệm Xuất bọt khí bay lên Định tính chất béo, sterol, caroten Cân 10 g bột dƣợc liệu cho vào bình nón 100 ml Đổ ngập n-hexan Ngâm qua đêm Lọc thu lấy dịch lọc để làm phản ứng: Định tính chất béo: nhỏ giọt dịch chiết n-hexan lên giấy lọc Hơ nóng cho bay hết dung mơi Nếu có chất béo quan sát thấy vết mờ giấy lọc 18 Định tính sterol: lấy ml dịch chiết n-hexan, cô cách thủy đến khô Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm, nhỏ giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Tại mặt phân cách hai lớp chất lỏng có vịng trịn màu tím đỏ Định tính caroten: lấy ml dịch chiết n-hexan Cô cách thủy đến cắn Thêm giọt H2SO4 đặc vào cắn Dung dịch chuyển sang màu xanh đậm b Chiết xuất phân lập Phƣơng pháp xử lý mẫu chiết xuất Thân Dây đau xƣơng sơ chế đƣợc ngâm chiết kỹ lần dung môi methanol, sử dụng thiết bị siêu âm 40oC Lọc dịch chiết methanol qua giấy lọc, gộp dịch lọc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết tổng methanol Phân tán cao chiết ethanol nƣớc cất chiết phân bố n- hexan ethyl acetat (3 lần) Các phân đoạn nhexan, ethyl acetat đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc phân đoạn tƣơng ứng Phƣơng pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất Để phân tích phân tách phần chiết nhƣ phân lập hợp chất, phƣơng pháp sắc ký đƣợc sử dụng nhƣ: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột (CC) Sắc ký lớp mỏng (TLC): đƣợc thực mỏng đế nhôm Kieselgel 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát chất đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm 366 nm dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun lên mỏng, sấy khơ hơ nóng bếp điện từ từ đến màu Sắc ký cột (CC): đƣợc tiến hành với chất hấp phụ silicagel pha thƣờng Silicagel pha thƣờng có cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merk) c Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học hợp chất 19 - Phƣơng pháp vật lý: dựa vào góc quay cực, điểm nóng chảy - Phƣơng pháp phổ đại: + Dựa vào liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hai chiều (HMBC, HSQC, COSY) + So sánh liệu thu đƣợc từ thực nghiệm với liệu công bố 20 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật Dây đau xƣơng 3.1.1 Đặc điểm h nh thái Dây leo, thân có nhiều lơng,lúc đầu có lơng, sau nh n, lớp vỏ khơng sần sùi, thân màu xanh đậm, có bì khổng xếp thành hang nhau, dài 7080cm có cành dài rũ xuống, có nhựa mủ vàng (Hình 3.1a, b) Lá hình tim, mặt mặt dƣới có nhiều lơng có màu trắng nhạt, phiến hình tim, phía trịn h m lại, phía đỉnh hẹp lại thành mũi nhọn, dài - 10cm, rộng 5- 7cm có gân nhỏ, toả hình chân vịt, gốc có hai tai trịn hình tim Lá đơn, mọc sole (Hình 3.1b, c, d), cuống dài – 5cm, mép nguyên ( Hình 3.1g) Hoa mọc thành chùm kẽ đơn độc, chùm tụ lại, chùm dài khoảng 10cm, có lơng măng màu trắng nhạt (Hình 3.2) Hoa đực có đài, tràng cánh hoa, nhị Hoa đài tràng giống hoa đực; nhị lép 6, dài mm Quả hạch chín có màu đỏ, có dịch nhày, vỏ nh n, hạch hình bán cầu, mặt phẳng bán cầu h m lại, chiều dài khoảng 0,8 - 1,5 cm, đƣờng kính 0,7 - cm (Hình 3.3) Ảnh đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu đƣợc trình bày hình 3.1: 21 Hình 3.1: Ảnh quan sinh dƣỡng Dây đau xƣơng nghiên cứu Chú thích: a Tồn cây; b Cành mang lá; c Lá mặt trên; d Lá mặt dƣới; e Cách mọc lá; f Cuống lá; g Mép 22 Hình 3.2: Ảnh hoa Dây đau xƣơng Hình 3.3: Ảnh Dây đau xƣơng 23 3.1.2 Đặc điểm vi học a Đặc điểm vi phẫu Đặc điểm vi phẫu Phần gân lá: Gân lồi ít, gân dƣới lồi nhiều Cấu tạo gân từ ngồi vào gồm: Lơng che chở gồm nhiều lông che chở đa bào mặt dƣới, mặt chứa lơng tiết Biểu bì trên, 10 Biểu bì gồm hàng tế bào nhỏ hình chữ nhật, xếp đặn, có phủ lớp cutin mỏng, biểu bì vách dày biểu bì dƣới., Mơ dày gồm 2-3 lớp tế bào hình đa giác gần trịn, thành dày, kích thƣớc tƣơng đối đều, xếp sát Mô mềm gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác kích thƣớc lớn, thành mỏng bao quanh bó libe gỗ hình cung nằm gân Gân phụ gồm gân phụ nằm đối xứng qua bó gỗ, Trụ bì, Gỗ cấp gồm tế bào hình đa giác hay hình vng, to dần từ xuống, xếp thành dãy xen lẫn với mô mềm gỗ Tầng phát sinh Libe – gỗ gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác kích thƣớc đều, xếp thành vòng bao quanh gỗ Ảnh chụp vi phẫu gân Dây đau xƣơng đƣợc trình bày hình 3.4: Hình 3.4: Vi phẫu gân Dây đau xƣơng Chú thích: Biểu bì trên, Lông che chở, Mô dày, Mô mềm, Gân phụ, Trụ bì, Lơng che chở, Gỗ cấp 1, Tầng phát sinh libe – gỗ, 10 Biểu bì dƣới, 24 Phần phiến lá: Biểu bì gồm lớp tế bào hình chữ nhật, tế bào biểu bì lớn tế bào biểu bì dƣới; biểu bì có vách dày cutin dày; Mô giậu gồm hàng tế bào xếp đứng vng góc với bề mặt biểu bì, kích thƣớc tƣơng đối đều, xếp sát nhau; Mơ mềm tế bào đa giác kích thƣớc lớn; Tinh thể canxi oxalat Lông che chở đa bào có nhiều mặt dƣới Ảnh chụp vi phẫu phiến Dây đau xƣơng đƣợc trình bày hình 3.5: Hình 3.5: Vi phẫu phiến Dây đau xƣơng Chú thích: Biểu bì, Mơ giậu, Tinh thể canxi oxalat, Mô mềm, Lông che chở Đặc điểm vi phẫu thân Ảnh chụp vi phẫu thân Dây đau xƣơng đƣợc trình bày hình 3.6: Hình 3.6: Vi phẫu thân Dây đau xƣơng 25 Chú thích: Lông che chở; 2, Lỗ vỏ; 3, Bần; 4, Tầng sinh bần; 5, Mơ mềm vỏ; 6, Trụ bì; 7, Tầng phát sinh libe- gỗ; 8, Gỗ cấp 2; 9, Libe; 10, Bao mô cứng; 11, Mô mềm ruột Mặt cắt thân hình trịn (hình 3.6), từ ngồi vào có: Lơng che chở đa bào xuất thƣa thớt so với vi phẫu Lỗ vỏ Bần lớp tế bào gồm tế bào hình chữ nhật kích thƣớc đặn có thành dày Tầng sinh bần gồm 3-4 lớp tế bào nằm dƣới biểu bì có hình chữ nhật đặn vách mỏng biểu bì Mơ mềm vỏ gồm tế bào hình đa giác tƣơng đối nhau, có khoảng gian bào Trụ bì Nhiều lớp tế bào hình chữ nhật có chỗ dày hóa gỗ bắt màu xanh Bó libe gỗ: có libe ngồi, gỗ nằm phía Libe gồm tế bào hình trịn, kích thƣớc khơng đều, xếp thành dãy xuyên tâm, bắt màu hồng nhuộm đỏ son phèn Gỗ cấp liên tục, gồm tế bào hình đa giác gần trịn, kích thƣớc khơng phân bố vùng mơ mềm gỗ, đƣợc bao bọc 10 Bao mô cứng Tầng phát sinh libe- gỗ nằm xung quanh bó libe gỗ, gồm tế bào nhỏ hình chữ nhật , có vách mỏng xếp thành dãy tƣơng đối đặn 11 Mô mềm ruột gồm lớp tế bào hình đa giác gần trịn, kích thƣớc khơng nhau, có thành hóa gỗ nhiều, tế bào kích thƣớc lớn dần thành hóa gỗ hơn, mỏng b Đặc điểm bột Tải FULL (68 trang): https://bit.ly/3jHIzTA Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net Bột màu nâu nhạt, mùi gỗ, không vị Ảnh chụp đặc điểm bột thân Dây đau xƣơng dƣới kính hiển vi đƣợc trình bày hình 3.7: 26 Hình 3.7: Một số đặc điểm bột thân Dây đau xƣơng Chú thích: Tinh bột, Mảnh mơ mềm có chứa tinh bột, Mảnh bần, Bó sợi, Mảnh mạch mạng, Mảnh mạch chấm, Mảnh biểu bì 3.2 Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Mẫu đƣợc lƣu Phòng tiêu thuốc, Bộ môn Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền Phân tích đặc điểm hình thái hoa, thân, lá, rễ; quan sát đặc điểm giải phẫu phận trên, có so sánh đối chiếu với công bố đặc điểm thực vật, tên khoa học số loài thuộc chi Tinospora mô tả ghi tài liệu phân loại thực vật: Cây cỏ Việt Nam – Phạm Hoàng Hộ, tập I; Từ điển thực vật thông dụng - V Văn Chi, tập 2, Thực vật chí Trung Quốc; chúng tơi khẳng định mẫu tiêu (SMP 06/2016) thu hái thị trấn Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc loài Tinospora sinensis Merr thuộc họ Tiết dê Menispermaceae 27 Mẫu đƣợc Thạc sỹ Bùi Hồng Quang, Phòng thực vật, Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật, giám định tên khoa học loài Tinospora sinensis Merr, thuộc họ Tiết dê Menispermaceae (Phiếu Giám định ngày 22/12/2016) 3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 3.3.1 Định tính sơ nhóm chất dƣợc liệu phản ứng hóa học Tải FULL (68 trang): https://bit.ly/3jHIzTA Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Mục tiêu: Xác định nhóm chất dược liệu phản ứng hóa học đặc trưng Kết định tính nhóm chất phản ứng hóa học đƣợc trình bày bảng 3.1: Bảng 3.1: Kết định tính hóa học nhóm chất Dây đau xƣơng TT Phản ứng Kết Kết luận Chất béo Dấu hiệu vết mờ giấy lọc - Khơng có Carotenoid PƢ với H2SO4 đậm đặc - Khơng có Sterol PƢ Libermann-bourchardt + Có PƢ với Cyanidin + PƢ với NaOH NH4OH đặc + PƢ với FeCl3 5% + Mở, đóng vịng lacton - PƢ với FeCl3 5% + PƢ với Gelatin ++ Tên nhóm chất Flavonoid Coumarin Tanin Khơng có Có PƢ với Chì acetat +++ PƢ với Đồng acetat +++ 28 Có Acid hữu PƢ Với Na2CO3 PƢ Bourchardt Glycosid tim - Liebermann- Khơng có ++ Keller-Kiliani ++ PƢ Baljet + PƢ Legal + Có Anthranoid PƢ Borntraeger - Khơng có Saponin PƢ Tạo bọt + Có Đƣờng tự TT Fehling + Có 10 Acid amin TT Ninhydrin - Khơng có 11 Polysaccarid TT Lugol +++ Có TT Mayer ++ TT Dragendoff ++ TT Bouchardat ++ 12 Alcaloid Ghi : (-) : Phản ứng âm tính Có (++) : Phản ứng dƣơng tính r (+) : Phản ứng dƣơng tính (+++) : Phản ứng dƣơng tính r Nhận xét: Từ kết định tính sơ kết luận thân Dây đau xƣơng có chứa: flavonoid, alcaloid, tanin, polysaccharid, saponin, glycosid tim, đường khử, sterol 3.3.2 Phân lập số hợp chất thân Dây đau xƣơng a Chiết phân đoạn từ thân Dây đau xƣơng Mẫu thân Dây đau xƣơng sau rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ nghiền thành bột (1,2kg) đƣợc thấm ẩm 500ml methanol 30 phút, sau ngâm chiết kỹ 9l dung môi methanol 48h, sử dụng thiết bị chiết siêu âm 40oC vòng 30 phút Lọc dịch chiết methanol 6811169 29 ... pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 13 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 14 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật Dây đau xương 21 3.1.1 Đặc điểm hình... đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Dây đau xƣơng (Tinospora sinensis (Lour.) Merr)? ?? với mục tiêu: + Xác định đƣợc đặc điểm thực vật giám định tên khoa học Dây đau xƣơng...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC TRƢƠNGLỜI THỊCẢM VÂNƠN HOÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY DÂY ĐAU XƢƠNG (Tinospora sinensis Merr) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC