Nâng cao hiệu quả biểu hiện β-glucosidase tái tổ hợp từ trình tự gen trong cơ sở dữ liệu metagenomic suối nước nóng Bình Châu

rong nghiên cứu này, trình tự ORF mã số [denovogenes] 32768 mã hóa cho β-glucosidase được khai thác từ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu được lựa chọn để biểu hiện trong vector pET17b do có độ tương đồng amino acid thấp với các enzyme trong GenBank, có chỉ số kiềm tính và Tm cao.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 545-551, 2019 NÂNG CAO HIỆU QUẢ BIỂU HIỆN β-GLUCOSIDASE TÁI TỔ HỢP TỪ TRÌNH TỰ GEN TRONG CƠ SỞ DỮ LIỆU METAGENOMIC SUỐI NƯỚC NĨNG BÌNH CHÂU Trần Thanh Thủy, Lại Thị Hồng Nhung, Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Kim Thoa* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: nkthoa@ibt.ac.vn Ngày nhận bài: 12.02.2019 Ngày nhận đăng: 17.9.2019 TÓM TẮT Sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật hệ sinh thái địa nhiệt thường có tính chất đặc biệt, giúp cho vi sinh vật tồn tại, sinh trưởng phát triển môi trường cực trị Để khai thác nguồn gen vi sinh vật từ hệ sinh thái đặc biệt này, cần phải có cách tiếp cận mà khơng thơng qua nuôi cấy Cùng với phát triển kỹ thuật metagenomic theo hướng giải trình tự gen hệ phần mềm tin sinh học, nhà nghiên cứu tiếp cận với gen vi sinh vật trực tiếp từ hệ gen mơi trường Trong nghiên cứu này, trình tự ORF mã số [denovogenes] 32768 mã hóa cho β-glucosidase khai thác từ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu lựa chọn để biểu vector pET17b có độ tương đồng amino acid thấp với enzyme GenBank, có số kiềm tính Tm cao Nhằm nâng cao hiệu biểu hiện, số điều kiện (chủng chủ, môi trường, nồng độ IPTG, độ thơng khí ) khảo sát Kết cho thấy chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp đạt lượng sinh khối khô cực đại 8,26 g/L, biểu hoạt tính βglucosidase tốt 0,34 U/mL sau 42-48 nuôi cấy nhiệt độ 30ºC, môi trường TB điều kiện lắc với thể tích dịch ni cấy chiếm 20% thể tích bình ni, nồng độ IPTG cảm ứng 0,25mM Kết nghiên cứu không góp phần khẳng định hiệu việc khai thác trực tiếp gen mã hóa cho enzyme từ DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Việt Nam mà sở để nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp đáp ứng nhu cầu chuyển hóa sinh khối Từ khóa: Biểu gen, DNA metagenome, E coli C43(DE3), β-glucosidase, enzyme tái tổ hợp, suối nước nóng Bình Châu MỞ ĐẦU Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) nhóm enzyme thủy phân mối liên kết glycoside phân tử carbohydrate để giải phóng gốc glycosyl khơng khử, glycoside oligosaccharide Nhóm enzyme có mặt hầu hết thể sống bao gồm vi khuẩn, cổ khuẩn, eukaryote, đóng nhiều vai trị quan trọng q trình trao đổi chất, ví dụ chuyển hóa sinh khối vi sinh vật, phân giải glycolipid, trình hóa gỗ thực vật, hoạt hóa phytohormone, kiểm sốt sinh học kháng lồi gây hại (Singh et al., 2016) Beta-glucosidase đóng vai trị quan trọng điều trị bệnh Gaucher (Butters, 2007) Trong đó, β-glucosidase sử dụng nhiều phức hệ cellulase, enzyme xúc tác bước cuối trình thủy phân cellulose Để thu nhận nâng cao hoạt tính enzyme, số phương pháp biểu gen mã hóa βglucosidase từ nguồn khác công bố (Byeon et al., 2005; Chan et al., 2012; Tang et al., 2014) Việc tìm kiếm chủng chủ phù hợp để sản xuất lượng lớn enzyme mối quan tâm hàng đầu Các chủng chủ từ nấm men Pichia pastoris, Trichoderma reesei đến chủng E coli sử dụng cho mục đích (Harhangi et al., 2002; Murray et al., 2004; Chang et al., 2011; Tang et al., 2014) Trong đó, chủng chủ E coli giữ ưu tốc độ sinh trưởng nhanh, mật độ tế bào lớn, điều kiện ni cấy đơn giản, rẻ tiền q trình biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào chủ nhanh hiệu (Rosano, Ceccarelli, 2014) Các kỹ thuật phương pháp nhằm nâng cao hiệu biểu protein tái tổ hợp tế bào E coli ngày cải tiến Các điều kiện nuôi cấy thành phần mơi trường, nhiệt độ biểu hiện, độ thơng khí, nồng độ chất cảm ứng 545 Trần Thanh Thuỷ et al yếu tố góp phần làm tăng hoạt tính enzyme tái tổ hợp Việc sử dụng thành cơng chủng E coli tách dịng biểu gen vi sinh vật không thông qua nuôi cấy làm tăng ưu hệ thống Theo ước tính, khoảng 18% gen mã hóa cellulase ưa nhiệt phát thu nhận thơng qua kỹ thuật metagenomic (Escuder-Rodríguez et al., 2018) Nhiều β-glucosidase sàng lọc, xác định trình tự, tách dịng biểu thành cơng E coli (Kim et al., 2007; Guo et al., 2008; Wang et al., 2012; Li et al., 2014; Schröder et al., 2014; RamirezEscudero et al., 2016) Tuy nhiên nghiên cứu tương tự để tìm kiếm β-glucosidase bền nhiệt từ DNA metagenome suối nước nóng cịn cơng bố ngoại trừ nghiên cứu Schröder et al., (2014) Trong nghiên cứu này, trình tự khung đọc mở mã hóa cho βglucosidase (mã số [denovogenes]_32768) lựa chọn từ sở liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu để biểu E coli hệ vector pET17b (Novagen) Nhằm nâng cao hiệu suất biểu enzyme tái tổ hợp, yếu tố ảnh hưởng đến trình biểu gen [denovogenes]_32768 khảo sát Kết thu minh chứng cho tiềm thu nhận enzyme tái tổ hợp trực tiếp không thông qua nuôi cấy VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các chủng E coli tái tổ hợp mang vector pET17b có gắn đoạn ORF trình tự gen [denovogenes]_32768 dùng để nghiên cứu biểu β-glucosidase; pnitrophenol p-nitrophenyl-β-glucopyranoside (pNPG) (Sigma Aldrich) sử dụng làm chất chuẩn chất cho thử hoạt tính β-glucosidase Các hoá chất khác sử dụng: cao nấm men, bacto tryptone, glycerol, IPTG (Merck), có độ tinh khiết, đảm bảo cho trình thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu Dự đốn tính chất enzyme Sử dụng phần mềm Tm Index địa http://tm.life.nthu.edu.tw/ (Ku et al., 2009) để dự đốn tính chịu nhiệt phần mềm Acalpred (http://lin.uestc.edu.cn/server/AcalPred) để dự đốn tính chịu kiềm, acid protein Biểu gen [denovogenes]_32768 Các chủng E coli có mang plasmid pET17b_32768 nhân giống môi trường 546 LB lỏng + ampicillin (100 µg/ml) 37°C, 200 rpm từ 16-18 Giống chuyển sang bình tam giác 500 ml có chứa 100 ml mơi trường biểu + ampicillin (100 µg/ml) với tỷ lệ 1% (v/v) Lắc bình điều kiện 200 rpm, 37°C OD600 dịch nuôi cấy đạt 0,6-0,8, bổ sung mM IPTG tiếp tục nuôi lắc 200 rpm 48 30°C Dịch nuôi cấy ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút để loại dịch nổi, thu tế bào Bảo quản tế bào -20°C cho nghiên cứu + Xác định trọng lượng sinh khối khô: Sấy sinh khối tươi 105°C đến trọng lượng không đổi để xác định trọng lượng sinh khối khô + Thu nhận enzyme thô: Sinh khối tươi rửa hòa lại vào dung dịch đệm phá tế bào (Tris/HCl 50 mM, pH 8,5; EDTA mM; NaCl 100 mM; DTE 0,1 mM PMSF mM) trước phá vỡ siêu âm để thu dịch enzyme thô + Xác định hoạt độ β-glucosidase: Hoạt độ βglucosidase xác định theo phương pháp Lu et al., (2013) cải tiến sử dụng p-NPG chất Cụ thể: 0,5 mL enzyme thêm vào mL dung dịch đệm Tris/Cl 50 mM, pH 8,5 Bổ sung 0,5 ml dung dịch p-NPG 20 mM Phản ứng thực 55°C 15 phút trước bổ sung ml dung dịch Na2CO3 200 mM để dừng phản ứng Lượng p-NP giải phóng xác định mức độ hấp thụ bước sóng 400 nm Một đơn vị hoạt tính enzyme định nghĩa lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng để giải phóng µmol p-NP từ p-NPG thời gian phút điều kiện phản ứng + Ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất biểu β-glucosidase Lựa chọn chủng chủ biểu hiện: Hai dòng tế bào E coli C43(DE3) (Lucigen) E coli JM109 (DE3) (Promega) sử dụng làm chủng chủ để biểu β-glucosidase tái tổ hợp Plasmid pET17b_32768 biến nạp vào dòng tế bào khả biến phương pháp xung điện Các tế bào E coli tái tổ hợp nuôi cấy xác định trọng lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp Lựa chọn mơi trường biểu hiện: Chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp mang vector pET17b_32768 nhân giống môi trường LB trước chuyển sang biểu loại môi trường NB, LB TB Hiệu suất biểu đánh giá thơng qua trọng lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp Độ thống khí: Giống khởi động chủng tái tổ Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 545-551, 2019 hợp E coli C43(DE3) chuyển vào bình tam giác (thể tích 500 mL) chứa mơi trường TB với thể tích khác 50-300 mL (tương ứng 10-60% thể tích bình) Q trình biểu thực 30°C, 200 rpm 48 Hiệu suất biểu đánh giá thông qua trọng lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp Nồng độ IPTG: Nuôi cấy chủng tái tổ hợp E coli C43(DE3) môi trường TB OD600 đạt 0,6-0,8, bổ sung IPTG với nồng độ 0,25-1,5 mM Hiệu suất biểu đánh giá thông qua trọng lượng sinh khối hoạt tính enzyme dung hợp Động thái sinh trưởng biểu β-glucosidase: Chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp ni bình tam giác (500 ml) có chứa 100 ml mơi trường TB Quá trình biểu thực sau cảm ứng 0,25 mM IPTG, 30°C, 200 rpm Trọng lượng sinh khối khơ hoạt tính enzyme dung hợp mẫu xác định cách tiếng 48 Tất thí nghiệm lặp lại lần để tính giá trị sai số chuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dự đốn tính chất enzyme Trong số ORF mã hóa cho β-glucosidase, ORF [denovogenes]_32768 lựa chọn có trình tự amino acid tương đồng 76,11% với βglucosidase có mã số A2392_03130 từ vi khuẩn Candidatus kaiserbacteria RIFOXYB1_FULL_46_14 53,94% với βglucosidase A vi khuẩn Parcubacteria sp GW2011_GWF2_44_8 Hơn nữa, ORF có số kiềm đạt 0,83 Tm 0,92 Do đó, protein dự đốn có tính chất kiềm có nhiệt độ hoạt động tối ưu khoảng 55°C - 65°C Trình tự ORF [denovogenes]_32768 đăng ký GenBank với mã số QAU55422, có chiều dài 1224 nucleotide, mã hóa cho 407 amino acid Trình tự nucleotide tổng hợp nhân tạo gắn vào hệ vector pET17b (Novagen) để nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp Lựa chọn chủng chủ biểu β-glucosidase tái tổ hợp Để sản xuất β-glucosidase tái tổ hợp, mối quan tâm phải kể đến lựa chọn chủng chủ phù hợp Plasmid pET17b_32768 biến nạp vào hai dòng tế bào E coli C43(DE3) E coli JM109(DE3) Sau 48 cảm ứng khả sinh trưởng hai chủng tái tổ hợp tương đương nhau, nhiên hoạt tính βglucosidase chủng E coli C43(DE3) (0,05 U/mL) cao 2,5 lần so với enzyme chủng E coli JM109(DE3) (0,02 U/mL) (Hình 1) Như thấy enzyme tái tổ hợp biểu dạng tan Chủng E coli C43(DE3) Miroux Walker (1996) phát triển từ trình sàng lọc biến chủng dòng E coli BL21(DE3) để biểu vượt ngưỡng protein màng Ưu điểm dòng E coli C43(DE3) so với dòng gốc E coli BL21(DE3) chỗ hạn chế tỷ lệ chết tế bào biểu mức protein dung hợp đột biến hai điểm vùng -10 promoter lacUV5 Trong đó, dịng tế bào E coli JM109(DE3) chủng dùng chủ yếu chiến lược tách dòng gen Từ kết nghiên cứu trên, chủng tái tổ hợp E coli C43(DE3) mang pET17b_32768 chọn cho nghiên cứu Lựa chọn môi trường biểu β-glucosidase tái tổ hợp Để biểu β-glucosidase, chủng tái tổ hợp E coli C43(DE3) mang vector pET17b_32768 nuôi môi trường NB, LB TB Sau 48 biểu 30°C, môi trường TB môi trường cho sinh trưởng biểu hoạt tính enzyme tốt (7,95 g/L 0,28 U/mL), kế sau môi trường LB cuối mơi trường NB (Hình 2) Kết tương tự công bố quốc tế nghiên cứu trình sinh trưởng sinh tổng hợp protein tái tổ hợp hệ thống E coli (Sezonov et al., 2007; Studier, 2005; 2014) Môi trường NB LB sử dụng phổ biến để nuôi cấy E coli chứa thành phần dinh dưỡng dễ hấp thụ giai đoạn tăng sinh sớm Tuy nhiên, môi trường lựa chọn tốt để biểu protein dung hợp chứa carbohydrate ion kim loại hóa trị II (Sezonov et al., 2007) Trong đó, thành phần mơi trường TB có hàm lượng cao nấm men gấp đôi so với thành phần môi trường LB NB, ni cấy E coli môi trường TB cho mật độ tế bào cao (Studier, 2005) Mặt khác, chủng E coli tái tổ hợp biểu protein dung hợp cần lượng phosphate lớn, điều có môi trường TB đáp ứng Hơn nữa, môi trường TB có chứa glycerol đóng vai trị cảm ứng biểu protein điều khiển lac promoter (Studier, 2014) Nhờ đó, hiệu suất biểu protein dung hợp tăng lên đáng kể 547 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 E coli C43 (DE3) Sinh khối khơ (g/L) Hoạt tính β-glc (U/mL) Sinh khối khơ (g/L) Trần Thanh Thuỷ et al E coli JM109 Hoạt tính β-glucosidase (U/mL) 0.35 12 0.35 0.3 10 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 LB NB TB Môi trường biểu hiện Sinh khối khô (g/L) Hoạt tính β-glucosidase (U/mL) Hình Ảnh hưởng mơi trường ni cấy lên sinh trưởng sinh hoạt tính β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Sinh khối khô biểu cột màu đen, hoạt tính enzyme biểu cột màu ghi Ảnh hưởng độ thống khí đến biểu βglucosidase tái tổ hợp E coli vi khuẩn hiếu khí, vậy, lượng oxy hồ tan mơi trường ni cấy yếu tố quan trọng, có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng (O’Beirne, Hamer, 2000; Losen et al., 2004) Để nâng cao hàm lượng sinh khối tế bào hoạt tính 548 Sinh khối khơ (g/L) Sinh khối khơ (g/L) Hoạt tính β-glc (U/mL) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Hoạt tính β-glc (U/mL) Hình Ảnh hưởng chủng chủ lên trình sinh trưởng biểu β-glucosidase tái tổ hợp Sinh khối khơ biểu cột màu đen, hoạt tính enzyme biểu cột màu ghi 10 20 40 60 Thể tích ni cấy : Thể tích bình (%) Sinh khối khơ (g/L) Hoạt tính β-glucosidase (U/mL) Hình Ảnh hưởng độ thống khí lên sinh trưởng sinh hoạt tính β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Sinh khối khô biểu cột màu đen, hoạt tính enzyme biểu cột màu ghi enzyme dung hợp, người ta điều chỉnh số oxy hoà tan cách tăng tốc độ lắc giảm thể tích dịch ni bình Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch ni loại bình tam giác (500 mL) Kết nghiên cứu hình cho thấy thể tích dịch ni cấy có ảnh hưởng đến trình sinh trưởng biểu enzyme dung hợp Mật độ tế bào chủng Tạp chí Công nghệ Sinh học 17(3): 545-551, 2019 IPTG chất cảm ứng cho T7-promoter hầu hết vector biểu thuộc hệ thống pET Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG từ 0,25 - 1,5 mM lên trình sinh trưởng biểu β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Kết nghiên cứu cho thấy nồng độ IPTG có ảnh hưởng khơng nhiều đến khả sinh trưởng biểu β-glucosidase chủng tái tổ hợp Trong khoảng nồng độ IPTG cảm ứng từ 0,25 - 1,5 mM, sinh khối khô chủng tái tổ hợp dao động từ 7,28 - 8,13 g/L, enzyme tái tổ hợp biểu tất nồng độ IPTG cảm ứng hoạt tính dao động từ 0,3 – 0,34 U/mL (Hình 4) Do đó, nồng độ IPTG 0,25 mM chọn để cảm ứng biểu enzyme dung hợp 10 0.4 0.3 0.2 0.1 0.25 0.5 0.75 1.25 1.5 Nồng độ IPTG (mM) Sinh khối khô (g/L) Hoạt tính β-glc (U/mL) Sinh khối khơ (g/L) tái tổ hợp tỉ lệ nghịch với thể tích ni cấy Trong điều kiện khảo sát, mật độ tế bào đạt cao (10,64 g/L) thể tích ni cấy chiếm 10% thể tích bình giảm dần tăng thể tích dịch ni cấy Trong đó, hoạt tính β-glucosidase tái tổ hợp cao bình chứa thể tích dịch ni chiếm 20% (hoạt tính đạt 0,31 U/mL) (Hình 3) Do đó, xét hiệu biểu enzyme dung hợp hiệu kinh tế, tỷ lệ 20% lựa chọn tỷ lệ thơng khí thích hợp cho biểu enzyme dung hợp Kết nghiên cứu phù hợp với công bố Rosano Ceccarelli (2014) nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp chủng chủ E coli Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu βglucosidase tái tổ hợp Hoạt tính β-glucosidase (U/mL) Hình Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng biểu β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Sinh khối khơ biểu cột màu đen, hoạt tính enzyme biểu cột màu ghi 0.4 0.35 0.3 0.25 0.15 0.2 0.1 0.05 Hoạt tính β-glc (U/mL) Sinh khối khơ (g/L) 10 0 2.5 12 18 24 30 36 42 48 Thời gian (h) Sinh khối khơ (g/L) Hoạt tính β-glucosidase (U/mL) Hình Động thái sinh trưởng sinh β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Sinh khối khô biểu đường màu đen, hoạt tính enzyme biểu đường màu ghi 549 Trần Thanh Thuỷ et al Động thái sinh trưởng biểu β-glucosidase dung hợp chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp (2018) Cellulases from Thermophiles Metagenomics Microorganisms 6(3): 66 Dưới điều kiện ni cấy lựa chọn trên, q trình sinh trưởng biểu β-glucosidase tái tổ hợp chủng E coli C43(DE3) mang plasmid pET17b_32768 vào pha cân sau 42-48 nuôi cấy Trong khoảng thời gian này, sinh khối khô đạt giá trị dao động khoảng 8,21-8,26 g/L; sinh tổng hợp β-glucosidase đạt 0,33-0,34 U/mL (Hình 5) Guo H, Feng Y, Mo X, Duan C, Tang J, Feng J (2008) Cloning and Expression of a β-glucosidase Gene umcel3G from Metagenome of Buffalo Rumen and Characterization of the Translated Product Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 24(2): 232-238 KẾT LUẬN Gen [denovogenes]_32768 mã hóa cho βglucosidase gen lần phát từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu Gen biểu thành cơng dịng E coli C43(DE3) Đã xác định số điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Enzyme dung hợp biểu tốt mơi trường TB với thể tích dịch ni cấy chiếm 20% so với thể tích bình, nồng độ IPTG cảm ứng 0,25 mM Sau 42 - 48 nuôi cấy, sinh khối khô đạt 8,21 – 8,26 g/L, hoạt tính βglucosidase đạt 0,33 - 0,34 U/mL Lời cảm ơn: Cơng trình thực với hỗ trợ kinh phí đề tài “Nghiên cứu metagenome số hệ sinh thái mini tiềm nhằm khai thác gen mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu lignocellulose”, mã số ĐTĐLCN.15/14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Butters TD (2007) Gaucher disease Curr Opin Chem Biol 11(4): 412-418 Byeon GM, Lee KS, Gui ZZ, Kim I, Kang PD, Lee SM, Sohn HD, Jin BR (2005) A digestive β-glucosidase from the silkworm, Bombyx mori: cDNA cloning, expression and enzymatic characterization Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 141(4): 418-427 Chan AKN, Wang YY, Ng KL, Fu Z, Wong WKR (2012) Cloning and characterization of a novel cellobiase gene, cba3, encoding the first known β-glucosidase of glycoside hydrolase family of Cellulomonas biazotea Gene 493(1): 52-61 Chang J, Park I-H, Lee Y-S, Ahn S-C, Zhou Y, Choi Y-L (2011) Cloning, expression, and characterization of βglucosidase from Exiguobacterium sp DAU5 and transglycosylation activity Biotechnol Bioprocess Eng 16(1): 97-106 Escuder-Rodríguez J-J, DeCastro M-E, Cerdán M-E, Rodríguez-Belmonte E, Becerra M, González-Siso M-I 550 Found by Harhangi HR, Steenbakkers PJM, Akhmanova A, Jetten MSM, van der Drift C, Op den Camp HJM (2002) A highly expressed family β-glucosidase with transglycosylation capacity from the anaerobic fungus Piromyces sp E2 Biochim Biophys Acta - Gene Structure and Expression 1574(3): 293-303 http://lin.uestc.edu.cn/server/AcalPred http://tm.life.nthu.edu.tw/ Kim SJ, Lee CM, Kim MY, Yeo YS, Yoon SH, Kang HC, Koo BS (2007) Screening and characterization of an enzyme with β-glucosidase activity from environmental DNA J Microbiol Biotechnol 17(6): 905-912 Ku T, Lu P, Chan C, Wang T, Lai S, Lyu P, Hsiao N (2009) Predicting melting temperature directly from protein sequences Comput Biol Chem 33(6): 445-450 Li Y, Liu N, Yang H, Zhao F, Yu Y, Tian Y, Lu X (2014) Cloning and characterization of a new β-glucosidase from a metagenomic library of rumen of cattle feeding with Miscanthus sinensis BMC Biotechnol 14: 85-85 Losen M, Frölich B, Pohl M, Büchs J (2004) Effect of Oxygen Limitation and Medium Composition on Escherichia coli Fermentation in Shake-Flask Cultures Biotechnology progress 20: 1062-1068 Lu J, Du L, Wei Y, Hu Y, Huang R (2013) Expression and characterization of a novel highly glucose-tolerant βglucosidase from a soil metagenome Acta Biochimica et Biophysica Sinica 45(8): 664-673 Miroux B, Walker JE (1996) Over-production of Proteins in Escherichia coli: Mutant Hosts that Allow Synthesis of some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels Journal of Molecular Biology 260(3): 289-298 Murray P, Aro N, Collins C, Grassick A, Penttila M, Saloheimo M, Tuohy M (2004) Expression in Trichoderma reesei and characterisation of a thermostable family betaglucosidase from the moderately thermophilic fungus Talaromyces emersonii Protein Expr Purif 38(2): 248-257 O'Beirne D, Hamer G (2000) Oxygen availability and the growth of Escherichia coli W3110: A problem exacerbated by scale-up Bioprocess Engineering 23(5): 487–494 Ramirez-Escudero M, Del Pozo MV, Marin-Navarro J, Gonzalez B, Golyshin PN, Polaina J, Ferrer M, SanzAparicio J (2016) Structural and Functional Characterization of a Ruminal beta-Glycosidase Defines a Novel Subfamily of Glycoside Hydrolase Family with Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 545-551, 2019 Permuted Domain Topology J Biol Chem 291(46): 2420024214 Rosano GL, Ceccarelli EA (2014) Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges Frontiers in microbiology 5: 172-172 Schröder C, Elleuche S, Blank S, Antranikian G (2014) Characterization of a heat-active archaeal β-glucosidase from a hydrothermal spring metagenome Enzyme and Microbial Technology 57: 48-54 Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R (2007) Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth J Bacteriol 189(23): 8746-8749 Singh G, Verma AK, Kumar V (2016) Catalytic properties, functional attributes and industrial applications of βglucosidases Biotech 6(1): Studier FW (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures Protein Expr Purif 41(1): 207-234 Studier FW (2014) Stable Expression Clones and AutoInduction for Protein Production in E coli Structural Genomics: General Applications Y W Chen Totowa, NJ, Humana Press: 17-32 Tang Z, Liu S, Jing H, Sun R, Liu M, Chen H, Wu Q, Han X (2014) Cloning and expression of A oryzae β-glucosidase in Pichia pastoris Molecular Biology Reports 41(11): 7567-7573 Wang Q, Qian C, Zhang XZ, Liu N, Yan X, Zhou Z (2012) Characterization of a novel thermostable beta-glucosidase from a metagenomic library of termite gut Enzyme Microb Technol 51(6-7): 319-324 IMPROVEMENT OF A RECOMBINANT β-GLUCOSIDASE ACTIVITY OF A SEQUENCE DERIVED FROM METAGENOME DATABASE OF BINH CHAU HOTSPRING Tran Thanh Thuy, Lai Thi Hong Nhung, Le Thi Thanh Xuan, Nguyen Kim Thoa Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology SUMMARY Metabolic products obtaining from microorganisms of geothermal ecologies often show special characteristics which help their cells to survive, grow and develop under extreme conditions Exploiting the microbial gene resource of those environments demands a new approach via uncultured methods Thanks to the development of metagenomics and bioinformatic softwares, we can exploit novel genes from environment directly Based on Binh Chau hotspring’s DNA metagenome sequencing, ORF [denovogenes]_32768 encoding for β-glucosidase is selected for expression into pET17b vector because it shown a low similartity of amino acid sequence as compared to others in Genbank, a high alkali and Tm predicted values To improve the expression efficiency of β-glucosidase, some factors (host strains, medium culture, IPTG concentration, aeration…) are investigated The results showed that the recombinant E coli C43(DE3) reached the highest dried biomass at 8.26 g/L and the maximum enzymatic activity at 0.34 U/mL in shaking condition (TB medium plus 0.25 mM IPTG with the ratio of cultured /flask volume is 20%, 42-48 hours, 30°C) This study demonstrates the capacity of mining a novel gene encoded for enzyme from DNA metagenome of Vietnam hot spring as well as produces recombinant enzyme for biomass conversion Keywords: Gene expression, DNA metagenome, E coli C43(DE3), β-glucosidase, recombinant enzyme, Binh Chau hotspring 551 ... [denovogenes]_32768) lựa chọn từ sở liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu để biểu E coli hệ vector pET17b (Novagen) Nhằm nâng cao hiệu suất biểu enzyme tái tổ hợp, yếu tố ảnh hưởng đến trình. .. pET17b (Novagen) để nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp Lựa chọn chủng chủ biểu β-glucosidase tái tổ hợp Để sản xuất β-glucosidase tái tổ hợp, mối quan tâm phải kể đến lựa chọn chủng chủ phù hợp Plasmid... tái tổ hợp Trong khoảng nồng độ IPTG cảm ứng từ 0,25 - 1,5 mM, sinh khối khô chủng tái tổ hợp dao động từ 7,28 - 8,13 g/L, enzyme tái tổ hợp biểu tất nồng độ IPTG cảm ứng hoạt tính dao động từ