Nghiên cứu phân lập và tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường type 2 của các hoạt chất sinh học từ một số loại thực vật thu hái tại miền trung

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ XUÂN THU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE CỦA CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU HÁI TẠI MIỀN TRUNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ XUÂN THU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE CỦA CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU HÁI TẠI MIỀN TRUNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐẶNG ĐỨC LONG PGS.TS THÀNH THỊ THU THỦY ĐÀ NẴNG - 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Việc tham khảo nguồn tài liệu trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Nguyễn Thị Xuân Thu ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án xin gửi lời biết ơn trân trọng tới TS.Đặng Đức Long PGS.TS Thành Thị Thu Thủy, người tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận án Tôi xin cảm ơn đến thầy cô, cán nghiên cứu công tác mơn Cơng nghệ Sinh học, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa ủng hộ giúp đỡ suốt thời gian hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn đến cán nghiên cứu Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng – Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam hỗ trợ đo phổ NMR, MS giúp đỡ tơi nhiều q trình thực nghiệm hồn thành luận án Tơi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập Cuối cùng, xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến tồn thể gia đình bạn bè ủng hộ động viên tơi hồn thành tốt luận án Xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH XI MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu luận án Nội dung nghiên cứu luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Đối tượng phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường 1.1.1 Bệnh đái tháo đường 1.1.2 Bệnh sinh đái tháo đường type 10 1.1.3 Thuốc điều trị đái tháo đường 14 1.2 Tổng quan chè dây đắng 17 1.2.1 Cây chè dây (Ampelosis cantoniensis (Hook et Arn.) Planch) 17 1.2.2 Giới thiệu đắng (Vernonia amygdalina Del.) 20 1.3 Tình hình nghiên cứu giới nước thảo dược điều trị đái tháo đường 24 1.3.1 Tình hình nghiên cứu thảo dược điều trị ĐTĐ giới 24 1.3.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược điều trị ĐTĐ Việt Nam 42 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Nguyên liệu 45 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 45 iv 2.1.2 Nguyên liệu động vật 47 2.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm 47 2.2.1 Hóa chất 47 2.2.2 Thiết bị thí nghiệm 48 2.3 Thực nghiệm phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Phương pháp chiết xuất 49 2.3.2 Phương pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 51 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết 20 mẫu thực vật chuột nhắt ĐTĐ type 55 2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng cao chiết thực vật lên cấu trúc mô tụy gan chuột ĐTĐ type 56 2.3.5 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết cao chiết phân đoạn mẫu chè dây, đắng chuột nhắt ĐTĐ type 57 2.3.6 Phương pháp khảo sát khả năng giảm hoạt tính enzyme α-glucosidase α-amylase hợp chất phân lập 57 2.3.7 Phương pháp đánh giá hoạt động chống viêm cải thiện tính kháng insulin hợp chất tinh dựa dòng tế bào Raw 264.7 3T3-L1 58 2.3.8 Chuẩn bị cao hỗn hợp thảo dược có khả năng hạ đường huyết 61 2.3.9 Xác định độc tính cấp cao hỗn hợp 62 2.3.10 Phương pháp phân lập xác định cấu trúc hóa học 62 2.3.11 Xử lý số liệu 65 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66 3.1 Kết tách chiết mẫu 66 3.2 Kết gây chuột nhắt ĐTĐ type thực nghiệm 67 3.2.1 Gây chuột nhắt béo phì 67 3.2.2 Các số mỡ máu chuột nhắt béo phì 68 3.2.3 Gây ĐTĐ type chuột béo sau tiêm STZ 69 3.2.4 Định lượng insulin máu chuột nhắt sau tiêm STZ 70 3.2.5 Nghiệm pháp dung nạp glucose 71 v 3.3 Kết tác dụng hạ đường huyết cao chiết thực vật chuột ĐTĐ type 72 3.3.1 Sàng lọc đợt I 72 3.3.2 Sàng lọc đợt II 74 3.3.3 Sàng lọc đợt III 75 3.3.4 Sàng lọc đợt IV 76 3.4 Kết nghiên cứu cao chiết chè dây đắng 78 3.4.1 Ảnh hưởng cao chiết chè dây đắng lên kết mô bệnh học tụy gan 79 3.4.2 Nghiên cứu cao chiết phân đoạn chè dây 81 3.4.3 Nghiên cứu cao chiết phân đoạn đắng 91 3.4.4 Khả năng ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase hợp chất phân lập từ chè dây đắng 98 3.4.5 Hoạt động chống viêm cải thiện tính kháng insulin hợp chất phân lập từ chè dây đắng 100 3.4.6 Thảo luận chế hạ đường huyết hợp chất phân lập từ chè dây đắng 105 3.5 Kết cao hỗn hợp nguồn gốc từ thực vật có khả năng hạ đường huyết 108 3.5.1 Phối hợp thảo dược để tăng hiệu điều trị ĐTĐ 108 3.5.2 Hiệu hạ đường huyết cao hỗn hợp 109 3.5.3 Hiệu cao hỗn hợp số mỡ máu chuột ĐTĐ 112 3.5.4 Hiệu cao hỗn hợp lên hàm lượng glycogen gan chuột ĐTĐ 113 3.5.5 Khả năng ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase cao hỗn hợp 114 3.6 Nghiên cứu độc tính cấp cao hỗn hợp 114 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC PL1 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR : 13 C-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon) Akt : Protein Kinase B ATP : Adenosine triphosphate CBuOH : Cao n-buthanol CC : Cao cồn CEtOAc : Cao ethylacetate CHe : Cao n-hexane COSY : Chemical Shift Correlation Spectroscopy COX-2 : cyclooxygenase DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ĐTĐ : Đái tháo đường ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch liên kết với enzym) ERK : Extracellular signal-regulated kinase (tín hiệu ngoại bào điều tiết kinase) FFA : Free fatty acid (acid béo tự do) g : Gam GLP : Glucagon like peptide GLUT : Glucose transporter (yếu tố vận chuyển glucose) Grb2 : Growth factorreceptor-bound h : Giờ HFD : High fat diet (Chế độ ăn giàu chất béo) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence vii IC50 : Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50% hoạt tính sinh học hóa sinh) IDF : International Diabetes Federation (Liên đồn Đái tháo đường Quốc tế) IFG : Impaired fasting glucose (rối loạn đường huyết lúc đói) IGT : Impaired glucose tolerance (rối loạn dung nạp glucose) IKK-beta : IkappaB kinase beta IL-1β : Interleukin-1 beta, IL- : Interleukin-6, IL-8 : Interleukin-8 iNOS : Nitric oxide synthase IR : Insulin receptor IRS : Insulin receptor substrate JNK : C-Jun NH2-terminal kinase LD50 : Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) LPS : Lipopolysaccharide m : Khối lượng MAPK : Mitogen activated protein kinase μg : Microgram μl : Microlit mg : Miligam ml : Mililit MS : Mass Spectroscopy (phổ khối lượng) ND : Normal diet (Ăn chế độ ăn bình thường) NFκB : Nuclear factor-кB NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) OD : Optical Density (Mật độ quang) P-value : Probability value (Trị số p) viii PDK1 : Phosphoinositide-Dependent Kinase PDK2 : Phosphoinositide-Dependent Kinase PGE2 : Prostaglandin E2 PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase PIP2 : phosphatidyl-Inositol-(4,5) biphosphate PIP3 : Phosphatidylinositol- (3,4,5) -triphosphate PPAR : Peroxisome proliferator activator receptor PPARγ : Peroxisome proliferator-activated receptor PTP1B : Protein tyrosine phosphatase 1B R : Receptor R2 : Hệ số tương quan Rf : Hệ số di chuyển ROS : Reactive oxygen species (các chuỗi phản ứng oxy hóa) SGLT1 : Sodium-glucose linked transporter STZ : Streptozocin TNF-α : yếu tố hoại tử khối u-alpha TV : Thực vật USD : Đô la Mỹ WHO : World Health Organization - Tổ chức Y tế giới PL29 Phụ lục 6.4 Phổ HSQC chất LĐE (cynaroside) PL30 Phụ lục 6.5 Phổ COSY chất LĐE (cynaroside) PL31 Phụ lục 6.6 Phổ DEPT chất LĐE (cynaroside) PL32 C 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' δC 163,2 103,4 182,2 161,4 99,8 164,8 95,0 157,2 105,6 121,6 113,8 146,0 150,2 116,2 119,4 100,1 73,4 76,7 69,8 77,4 60,9 b δCa 164,4 103,1 181,8 161,1 99,5 162,9 94,7 156,9 105,3 121,3 113,5 145,7 149,9 115,9 119,1 99,9 73,1 76,4 69,5 77,1 60,6 Cynaroside (LĐE) δHa(mult., J = Hz) Tương tác HMBC 6,73 (1H; s) C-10; C-7; C-4 6,44 (1H; d; 2,0 Hz) C-8; C-10; C-5 6,78 (1H; d; 2,0 Hz) C-1”; C-10 7,41 (1H; d; 2,0 Hz) C-6’; C-4’; C-2 6,91 (1H; d; 8,5 Hz) 7,45 (1H; dd; 2,0; 8,5 Hz) 5,08 (1H; d; 7,5 Hz) 3,26 (1H; m) 3,29 (1H; m) 3,18 (1H; t; 5,0 Hz) 3,43 (1H; dd; 1,5; 5,5 Hz) 3,46 (1H; d; 3,0 Hz) 3,71 (1H; d; 5,5 Hz) C-3’; C-1’ C-2’; C-4’; C-2 C-7 C-1”; C-3” C-4”; C-2” C-6”; C-3” C-3” C-3”; Bảng 6.7 Các số liệu phổ cynaroside PL33 PHỤ LỤC BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CHẤT LĐB (VERNONIOSIDE E) Phụ lục 7.1 Phổ 1H chất LĐB (vernonioside E) PL34 Phụ lục 7.2 Phổ 13C chất LĐB (vernonioside E) PL35 Phụ lục 7.3 Phổ HMBC chất LĐB (vernonioside E) PL36 Phụ lục 7.4 Phổ HSQC chất LĐB (vernonioside E) PL37 Phụ lục 7.5 Phổ COSY chất LĐB (vernonioside E) PL38 Phụ lục 7.6 Phổ DEPT chất LĐB (vernonioside E) PL39 Phụ lục 7.7 Phổ NOESY chất LĐB (vernonioside E) PL40 Phụ lục 7.8a Phổ ESI-MS chất LĐB (vernonioside E) PL41 Phụ lục 7.8b Phổ ESI-MS chất LĐB (vernonioside E) PL42 Phụ lục 7.9 Phổ HR ESI-MS chất LĐB (vernonioside E) PL43 PHỤ LỤC CHUẨN BỊ CAO HỖN HỢP NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT CĨ KHẢ NĂNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT Phới hợp thảo dược để tăng hiệu điều trị ĐTĐ Trong thí nghiệm chúng tơi tiến hành kết hợp thực vật nghiên cứu có hiệu điều trị ĐTĐ để tạo thành sản phẩm có hiệu trị ĐTĐ Các mẫu thực vật bao gồm chè dây (CD), đắng (LĐ), cỏ (CN), chuối hột (CH), đu đủ (LĐĐ), hạt đu đủ (HĐĐ), dây thìa canh (DTC) giảo cổ lam (GCL), phối hợp thực vật với nhau, sản phẩm cho khuyết thành phần theo tỷ lệ 1:1:1:1:1:1:1:1 Chuột nhắt ĐTĐ type chia thành lô, lô gồm chuột uống sản phẩm khác với liều 500 mg/kg chuột/ngày Chuột bố trí lơ thí nghiệm theo bảng Bảng Bố trí thí nghiệm chọn lọc hỗn hợp Lô ĐC Cao chiết cho chuột uống Đối chứng (10 ml/kg.) DTC + GCL + CH+ LĐĐ + HĐĐ + CN + LĐ + CD DTC + GCL + CH + LĐĐ + HĐĐ + CN + LĐ DTC + GCL + CH + LĐĐ + HĐĐ + CN + CD Lô Cao chiết cho chuột uống DTC + GCL + CH + LĐĐ + HĐĐ + CD + LĐ DTC + GCL+ CH + LĐĐ + CN + CD + LĐ DTC + GCL+ CH + HĐĐ + CN + CD + LĐ DTC + GCL+ LĐĐ + HĐĐ + CN + CD + LĐ Thí nghiệm kéo dài 21 ngày Đường huyết chuột đo lúc đói thời điểm 21 ngày Chọn lọc cao hỗn hợp có hiệu hạ đường huyết tốt chuột ...ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ XUÂN THU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE CỦA CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU HÁI TẠI MIỀN... phần nghiên cứu tác dụng trị ĐTĐ số loài thực vật miền Trung, Việt Nam, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường type hoạt chất sinh học từ số loài thực vật thu. .. 18 1.4 Cấu trúc số hợp chất phân lập từ đắng 22 2. 1 Các loại thực vật (20 loài) thu nhận miền Trung Việt Nam 46 2. 2 Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu 49 2. 3 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn 50 2. 4 Nguyên liệu