Nghiên cứu phân lập và tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường type 2 của các hoạt chất sinh học từ một số loại thực vật thu hái tại miền trung TT

1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng tình trạng tăng đường huyết mãn tính, hậu thiếu hụt giảm hoạt động insulin kết hợp hai Hậu tăng glucose huyết biến chứng nghiêm trọng đe dọa đến tính mạng người bệnh Trên toàn cầu, tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ năm 2016 8,5% dân số trưởng thành (422 triệu người) số dự đoán tăng lên tới 9,9% vào năm 2045 Các trường hợp tử vong liên quan đến bệnh ĐTĐ phổ biến nước có thu nhập thấp trung bình, nơi có 80% trường hợp tử vong xảy Tổ chức Y tế Thế giới cho bệnh ĐTĐ bảy nguyên nhân hàng đầu gây tử vong vào năm 2030 Các lồi thực vật ln nguồn nguyên liệu thuốc quý giá, nhiều loại thuốc có sẵn thị trường có nguồn gốc trực tiếp gián tiếp từ chúng Có 1200 loài thực vật sử dụng y học cổ truyền có tác dụng chống đái tháo đường, nhiên có khoảng 450 nghiên cứu để khám phá tác dụng chúng công bố Cây chè dây (Ampelosis cantoniensis (H & A.) PL.), họ Nho (Vitacae) nghiên cứu nhiều thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa, nhiên chưa có cơng trình khoa học nghiên cứu hoạt tính chống ĐTĐ Bênh cạnh đó, đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ cúc (Asteraceae) có cơng trình nghiên cứu giới khả chống ĐTĐ, nhiên nghiên cứu chưa nhiều chưa mang tính tồn diện Vì vậy, việc tìm kiếm loại thuốc trị đái tháo đường từ thực vật tự nhiên hấp dẫn chúng có chứa hợp chất có khả thay an toàn điều trị ĐTĐ Trên tảng đó, để góp phần nghiên cứu tác dụng trị ĐTĐ số loài thực vật miền Trung, Việt Nam, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường type hoạt chất sinh học từ số loài thực vật thu hái miền Trung” Mục tiêu luận án - Sàng lọc số thực vật có tác dụng hạ đường huyết mơ hình chuột ĐTĐ type xác định thực vật có tác dụng hạ đường huyết tốt - Phân lâp hợp chất, xác định cấu trúc hóa học làm rõ chế hoạt động hạ đường huyết chúng - Kết hợp thực vật nghiên cứu có hiệu điều trị ĐTĐ để tạo thành cao hỗn hợp có hiệu trị ĐTĐ, từ nghiên cứu chế hạ đường huyết xác định độc tính cấp cao hỗn hợp Nội dung luận án - Thu thập số mẫu thực vật miền Trung tham khảo có tác dụng điều trị ĐTĐ Tách chiết mẫu thực vật cồn 70°, sàng lọc tác dụng hạ đường huyết cao chiết mơ hình chuột ĐTĐ type - Chiết phân đoạn chè dây đắng dung mơi có độ phân cực khác thử nghiệm khả hạ đường huyết cao phân đoạn chuột ĐTĐ type - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ phân đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt Nghiên cứu chế hạ đường huyết hợp chất phân lập qua việc đánh giá hiệu ức chế enzyme α-glucosidase α-amylase với thử nghiệm ảnh hưởng chúng đến trình sinh cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6 IL-8 (các cytokine tiền viêm ngun nhân gây nên tình trạng kháng insulin), cytokine kháng viêm (IL-10) tác dụng khôi phục biểu hai protein pIRS-1 pY20 tế bào bào (đây hai protein cần thiết cho đường truyền tín hiệu insulin) - Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết cao hỗn hợp, tác dụng cao hỗn hợp lên nồng độ cholesterol, triglyceride, hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase α-amylase, hàm lượng glycogen gan chuột ĐTĐ type xác định độc tính cấp hỗn hợp cao Những đóng góp luận án Sau phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu nước giới nhận thấy kết nghiên cứu luận án có đóng góp cho khoa học thực tiễn sau: Trong nghiên cứu có loại thực vật (chè dây, hạt đu đủ, đu đủ, thân cỏ đắng) lần nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết Việt Nam, riêng với mẫu chè dây chưa có cơng trình giới nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết đối tượng chưa nhắc đến dân gian công dụng Từ phân đoạn CEtOAc cao chiết chè dây phân lập hợp chất tinh sạch, quercetin khơng phải chất lần phân lập chè dây Lần nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α-amylase αglucosidase hợp chất phân lập từ chè dây Hợp chất phloretin (được tách từ chè dây) lần nghiên cứu tác dụng giảm tính kháng insulin tế bào 3T3-L1 gây TNF-α tác dụng khôi phục biểu hai protein pIRS-1 pY20 tế bào Từ phân đoạn CBuOH cao chiết đắng phân lập xác định chất đắng vernonioside VN (LĐB) Chất này, vernonioside VN (LĐB), chất lần phân lập từ đắng lần phân lập từ thiên nhiên Vernonioside VN lần nghiên cứu khả ức chế trình sinh tổng hợp cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6, IL-8 không ức chế cytokine kháng viêm IL-10 Cao chè dây (với liều uống 500mg/kg) ngồi tác dụng hạ đường huyết cịn có tác dụng phục hồi tuỵ gan chuột ĐTĐ type bị tổn thương Lần phát triển cao hỗn hợp khơng có hiêu tốt hạ đường huyết chuột ĐTĐ type (giảm 64.40% so với thời điểm h) mà cịn có tác dụng giảm nồng độ cholesterol triglycide, ngăn chặn suy giảm glycogen mô gan ức chế hoạt động enzym αglucosidase α-amylase Cấu trúc luận án Luận án gồm 138 trang Phần mở đầu 04 trang, kết luận kiến nghị 04 trang, cơng trình cơng bố 01 trang, tài liệu tham khảo 18 trang phụ lục Nội dung luận án chia làm 03 chương: Chương 1: Tổng quan gồm 40 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu gồm 21 trang Chương 3: Kết thảo luận 50 trang CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề liên quan đến bệnh ĐTĐ (khái niệm tác động), bệnh sinh ĐTĐ type 2, thảo dược điều trị ĐTĐ CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu: gồm 20 loại thực vật khác bao gồm: chè dây, vằng, nếp, chuối hột, bùm bụp, hạt đu đủ, đu đủ, sung, ké đầu ngựa, thân nở ngày đất, râu bắp, đắng, sa kê, thân giảo cổ lam, thân dây thìa canh, sen, thân lược vàng, vỏ quế, húng quế, thân cỏ Các mẫu thực vật thu hái chủ yếu vào tháng 7-9 vào năm 2016-2017, số mẫu mua địa phương - Đối tượng nghiên cứu: + Chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g, đuợc cung cấp sở chăn nuôi Suối Dầu - Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế Nha Trang + Tế bào đại thực bào Raw 264.7 tế bào mỡ 3T3-L1 cung cấp phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme Đại học Quốc gia Hà Nội 2.2 Hóa chất Streptozotocin (Sigma), kit ELISA định lượng Insulin (Thermo), Pioglite (Ấn Độ), D-glucose (Trung Quốc), enzym α-glucosidase (Sigma), α-amylase (Sigma), silicagel (0,04-0,063 mm-Merck) Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck), silicagel pha đảo RP-18 (30-50 m- YMC, Fujisilisa, Chemical Ltd), mỏng pha đảo R-18 (Merck), dung môi loại (Merk Trung Quốc), LPS (lipopolysacharide-Sigma), Kit ELISA IL-6, TNF-α, IL-10, Kháng thể 𝛽-Actin, p-IRS1, and pY20 primary antibodies, Anthrone 2.3 Thiết bị nghiên cứu Máy đo đường huyết One Touch (JOHNSON&JOHNSON-Mỹ), que thử đường huyết One Touch (Trung Quốc), hệ thống phân tích Elisa (Thermo Scientific-Mỹ), cột sắc ký cỡ khác (Trung Quốc, Đức), kính hiển vi (Olympus-Nhật), máy quay chân không Buchi (Đức), máy cắt tiêu (Thermo Scientific-Mỹ), thiết bị xác định cấu trúc thiết bị thông thường khác 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp chiết xuất: xử lý mẫu, chiết mẫu cồn 700, chiết thu phân đoạn dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethylacetate, n-buthanol 2.4.2 Phương pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 2: nuôi chuột béo chế độ ăn giàu chất béo (35% chất béo, 34% carbohydrat, 20% protein 11% thành phần khác- HFD-high fat diet), xác định số hóa sinh (cholesterol, triglyceride), gây chuột nhắt ĐTĐ type thực nghiệm cách tiêm STZ với liều 120 mg/kg, định lượng đường huyết, nghiệm pháp dung nạp glucose, định lượng insulin máu chuột kỹ thuật ELISA 2.4.3 Sàng lọc tác dụng hạ đường huyết 20 mẫu thực vật chuột nhắt ĐTĐ type 2: cách cho chuột ĐTĐ type uống cao chiết với liều 500 mg/kg trọng lượng chuột mẫu đối chứng (uống nước cất); chuột uống 21 ngày theo dõi đường huyết 2.4.4 Kỹ thuật làm tiêu đúc cắt gan tụy chuột 2.4.5 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết cao chiết phân đoạn mẫu chè dây, đắng chuột nhắt ĐTĐ type 2.4.6 Khảo sát khả năng ức chế in-vitro enzyme α-glucosidase αamylase hợp chất phân lập từ chè dây đắng 2.4.7 Đánh giá tác động lên biểu cytokines gây viêm cải thiện tính kháng insulin dựa dòng tế bào bào Raw 264.7 3T3-L1: quy trình ni hoạt hóa tế bào, đánh giá độc tố hợp chất tinh tới khả sống Raw 264.7 3T3-L1, dánh giá khả sản xuất cytokine ELISA kit, phương pháp đánh giá khả ức chế kháng insulin tế bào, đánh giá biểu protein IRS1 Y20, 2.4.8 Chuẩn bị cao hỗn hợp thảo dược có khả năng hạ đường huyết: phối hợp thảo dược để tăng hiệu điều trị ĐTĐ, xác định hàm lượng glycogen 2.4.9 Phương pháp phân lập chất: sắc ký lớp mỏng; sắc ký cột 2.4.10 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Phương pháp phổ khối lượng, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2.4.11 Xử lý số liệu: Các thí nghiệm lặp lại với số lần thích hợp Xử lý số liệu phần mềm SPSS (Version 22) với phép thử thống kê phù hợp CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết mẫu Kết tách chiết 20 mẫu thực vật cho thấy mẫu thực vật khác cho phần trăm tách chiết khác Lá chè dây dây thìa canh cho phần trăm tách chiết cao tương ứng 26,00% 22,62% Lược vàng hạt đu đủ có phần trăm tách chiết tương đối thấp 11,25% 9,25% 3.2 Mơ hình chuột nhắt ĐTĐ type thực nghiệm Chuột chia thành nhóm nhóm ăn thường (ND) nhóm ăn thức ăn giàu chất béo (có 35% chất béo), hay cịn gọi nhóm ni béo (HFD) Sau tuần ăn thức ăn giàu béo (A), nhóm chuột đo số mỡ máu, tiến hành tiêm STZ để gây ĐTĐ sau 10 ngày tiêm STZ, chúng đo nồng độ insulin so sánh với nhóm ND để khẳng định chuột ĐTĐ type Hình 3.1: Mơ hình gây chuột nhắt ĐTĐ type thực nghiệm Ghi chú: *p < 0,05, (giá trị p t-test lơ thí nghiệm lơ đới chứng thời điểm) A Trọng lượng chuột hai nhóm ND HFD; B Sự khác biệt số mỡ máu chuột nhóm ND HFD; C Nồng độ glucose máu chuột béo sau tiêm STZ so sánh với nhóm chứng; D Nồng độ insulin huyết tương lơ chuột khác Kết hình 3.1 cho thấy thay đổi trọng lượng thể chuột sau tuần cho ăn (A), nhóm chuột ni chế độ ăn nhiều chất béo (HFD) có trọng lượng trung bình 60,42 ± 1,03 g, tăng gấp ba lần so với ban đầu (20,69 ± 0,36 g) gần gấp đơi so với nhóm ăn thức ăn tiêu chuẩn (ND) thời điểm (38,95 ± 0,68 g) Chỉ số chất béo đo nồng độ cholesterol chất béo trung tính (B) chuột HFD tăng đáng kể mặt thống kê so sánh với lơ chuột ND (p