Khảo sát thành phần loài phụ và thành phần kiểu huyết thanh của các chủng salmonella nhiễm trong thực phẩm - P1

Khảo sát thành phần loài phụ và thành phần kiểu huyết thanh của các chủng salmonella nhiễm trong thực phẩm

Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Theo dõi và tổng kết trong nhiều năm các nhà khoa học trên thế giới đều xác định nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm trong ăn uống là do nhiễm vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm, như vi khuẩn gây bệnh lao, sốt thương hàn và dịch tả… Ở Canada hàng năm có khoảng trên 2 triệu người bị ngộ độc do thức ăn, nếu tính trung bình theo dân số thì cứ 11 người có 1 người mắc bệnh Ở Mỹ có khoảng 13 triệu người ngộ độc thức ăn trong năm và cứ 18 người có 1 người mắc bệnh do thực phẩm, trong đó 85% số ca ngộ độc thức ăn là do nguyên nhân vi sinh [16]

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vẫn ngày càng gia tăng ở nhiều nước, trong đó

Salmonella là tác nhân đứng hàng thứ hai chỉ sau Campylobacter Do đó, các quy định

về an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam và hầu hết các nước trên thế giới đều

không cho phép có sự hiện diện bất kỳ chủng Salmonella nào có mặt trong thực phẩm

mà không phân biệt chủng đó độc lực hay không đối với con người [13, 14]

Đến nay có khoảng 2500 kiểu huyết thanh của Salmonella đã được xác định nhưng chỉ một số ít có khả năng gây bệnh cho người Thực vậy, Salmonella là vi

khuẩn phân bố rất rộng trong tự nhiên Chúng có khả năng nhiễm vào bất cứ công đoạn nào của quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, nhất là thực phẩm tươi sống

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy không phải tất cả các dòng Salmonella nhiễm

trong thực phẩm đều có khả năng gây nguy hiểm cho con người Ngược lại chỉ có một

tỉ lệ rất ít các Salmonella trong thực phẩm có khả năng gây ngộ độc, các dòng này tập trung chủ yếu trong các loài phụ S enterica I Nhưng các phương pháp để phân tích Salmonella trong thực phẩm hiện nay chỉ xác định đến giống không phân biệt loài hay

kiểu huyết thanh đã tạo ra một hàng rào cản thương mại cho các nhà sản xuất, kinh doanh thực phẩm và làm hạn chế việc trao đổi thực phẩm giữa các quốc gia và khu vực

Tuy nhiên, để phân biệt Salmonella có khả năng gây bệnh với các Salmonella

khác là một việc làm khó khăn, cho đến nay vẫn chưa có một phương pháp hay chuẩn mực nào để phân biệt các nhóm này với nhau Hướng đến mục tiêu nghiên cứu tìm ra

phương pháp phân biệt giữa Salmonella có khả năng gây bệnh với Salmonella lành

tính, trong khóa luận này tập trung vào nội dung khảo sát, đánh giá tỉ lệ lây nhiễm

tương đối giữa các loài phụ và kiểu huyết thanh của Salmonella nhiễm trong thực

phẩm

1.2 Mục đích

Nhằm khảo sát thành phần loài phụ và thành phần kiểu huyết thanh của các

chủng Salmonella nhiễm trong các nhóm thực phẩm như thịt gia súc, thịt gia cầm,

trứng, thủy hải sản và các loại rau

1.3 Nội dung

Khảo sát tỉ lệ hiện diện các chủng Salmonella trên các nhóm thực phẩm và tỉ lệ xuất hiện tương đối của Salmonella enterica I và Salmonella spp trong thực phẩm

bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập truyền thống

Xác định các thành phần loài phụ của Salmonella phân bố trong các nhóm thực

Salmonella

Do thời gian và kinh phí thực hiện đề tài có hạn nên đây chỉ là những đánh giá

khởi đầu tỉ lệ nhiễm và định ra các kiểu huyết thanh của các loài phụ Salmonella giúp

ngăn ngừa một cách hiệu quả ngộ độc thực phẩm Các kết quả thu được cũng là thành quả bước đầu tiếp cận với công tác nghiên cứu trong phòng thí nghiệm nên nội dung chắc chắn còn rất nhiều thiếu sót do đó khóa luận không thể tránh khỏi những khiếm khuyết Rất mong nhận được sự nhận xét, đánh giá quý báu và sự đóng góp chân thành của quý thầy cô, các anh chị và các bạn để khóa luận được xúc tích hơn, hoàn thiện hơn

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đại cương về Salmonella

2.1.1 Giới thiệu chung về Salmonella

Cho đến nay đã phát hiện có khoảng 500 loài vi sinh vật khác nhau có thể gây

bệnh thương hàn và phó thương hàn cho người và gia súc Salmonella có thể gây nhiều

bệnh truyền nhiễm cho động vật như phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu và ngựa, bệnh bạch lỵ gà, bệnh thương hàn chuột, bệnh viêm ruột bò Những bệnh kể trên do

Salmonella gây ra người ta gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên phát, ngoài ra có thể phát hiện được Salmonella trong chất bài tiết của động vật lành [8, 11, 16]

Những Salmonella thường gây ngộ độc thường gặp là S typhimurium, S choleraesuis và S enteritidis [12, 22] Do đó việc chuẩn đoán chính xác các loại trực

khuẩn này ở động vật có một ý nghĩa rất quan trọng về mặt bảo vệ sức khỏe, vệ sinh công cộng, dự phòng bệnh truyền nhiễm [11, 16]

chung quanh thân, trừ S gallinarum và S pullorum gây bệnh cho gia cầm Salmonella

dễ dàng nuôi cấy ở 37oC trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển các khuẩn lạc có đường kính 2 – 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất [1, 11, 13]

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella

2.1.1.2 Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh

Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thế giới, Trung tâm Kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center),

giống Salmonella được chia làm hai loài: S enterica và S bongori Trong đó S bongori gồm tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S enterica

được chia làm 6 loài phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI (Bảng 2.1) Các loài và loài phụ này có thể phân biệt được bằng phản ứng sinh hóa Trong mỗi loài phụ có nhiều kiểu huyết thanh [7, 18, 29]

Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống

Salmonella Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia

dựa trên kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi Phần lớn các kiểu huyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác

được đặt tên riêng như Enteritidis (S enteritidis), Typhi (S typhi), Paratyphi (S paratyphi), Typhimurium (S typhimurium)…[1, 15, 21, 32]

Bảng 2.1 Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh [28 ]

S enterica

S bongori

S enterica enterica (I) S enterica salamae (II) S enterica arizonae (IIIa) S enterica diarizonae (IIIb) S enterica houtenae (IV) S enterica indica (VI)

(V)

1454 489

94 324

70 12 20

Loài phụ S enterica I hầu như chiếm đa số (99%), nó được tìm thấy ở hầu hết

các động vật máu nóng Loài phụ này chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu

huyết thanh của Salmonella có khả năng xâm nhập và gây nhiễm cao cho người và

động vật máu nóng, trong khi đó các loài phụ khác hầu như ở động vật máu lạnh và môi trường Như vậy có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết thanh không được phân lập từ bệnh phẩm của người, đây là một tỉ lệ rất có ý nghĩa để các cơ quan chức năng

xem xét và sữa đổi các tiêu chuẩn hiện hành về Salmonella trong thực phẩm tạo điều

kiện thuận lợi cho các nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm [3, 28, 33]

2.1.1.3 Sự phân bố của Salmonella

Salmonella phân bố rộng rãi trong tự nhiên và thường xuyên phân lập được từ

ống tiêu hóa của động vật và người bị nhiễm trùng Ngoài ra, chúng cũng được phân lập từ đất, không khí, nước sông hồ, nước biển và trong thực phẩm [13, 15]

2.1.1.4 Đặc điểm nuôi cấy

Salmonella có thể phát triển ở nhiệt độ 5oC – 45oC, điều kiện tối thích cho sự sinh trưởng của chúng là 37oC và ở điều kiện cực đoan như nhiệt độ quá thấp hoặc quá

cao Salmonella mất khả năng di động Ở dưới 5oC chúng ngừng phát triển, ở 60oC chỉ sống được trong khoảng 1 giờ, ở 70oC bị chết sau 10 phút, ở độ sôi của nước bị chết tức thì [10]

pH thích hợp cho sự tăng trưởng nằm trong khoảng trung tính là 6,8 – 7,2 Khoảng pH dành cho sự phát triển của vi khuẩn là 4,1 – 9 trong thực phẩm acid thấp, nhưng trong rau cải vi khuẩn không phát triển được ở pH từ 5,5 – 5,7 Độ ẩm dưới 0,94% hay nồng độ muối vượt quá 8% có thể ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của

Salmonella [17, 25]

2.1.1.5 Đặc điểm sinh hóa

Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó người ta có thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác Các chủng Salmonella sinh acid do lên men glucose, mannitol, dulcitol nhưng không lên men lactose (trừ S arizona) và sucrose, không có khả năng tách amine từ trytophan Chúng không sinh

indol hoặc acetoin và phân giải urea Phần lớn các chủng sinh hydrogen sulfide (H2S) và tách carboxyl (de-carboxylate) từ ornithine và lysine Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu đuợc một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfite, selenite, sodium tetrathionate Những chất này được dùng để chọn lọc chúng từ mẫu thực phẩm và nước [1, 21]

2.1.1.6 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố a Cấu trúc kháng nguyên

Khi nghiên cứu về huyết thanh học của vi khuẩn Salmonella, người ta đặc biệt chú ý đến đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn này Salmonella có 3 loại kháng nguyên

là kháng nguyên O (kháng nguyên thân – somatic), kháng nguyên H (kháng nguyên tiêm mao – flagella) và kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt – capsule) [11, 31, 37]

Kháng nguyên O: có hơn 60 loại được ký hiệu bằng số 1, 2, …12, được bao bọc

bởi bề mặt của vi khuẩn tạo thành một lớp không đều Chia kháng nguyên O thành 34 nhóm A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, L, M, N, O, P, Q,

R, S, T,U, V, W, X, Y, Z, 49, 50 Mỗi nhóm huyết thanh gồm một số loại vi khuẩn có

kháng nguyên O cấu tạo bởi một thành phần nhất định Ví dụ trong nhóm A, S

paratyphi A, kháng nguyên O gồm 3 phần (1), 2, 12 trong đó thành phần 1 khi có khi không, thành phần 2 là thành phần đặc biệt dùng để phân biệt về mặt huyết thanh học với các nhóm khác Kháng nguyên O gồm chuỗi lipoplysaccharide-protein trên bề mặt tế bào Loại kháng nguyên này được coi là nội độc tố của vi khuẩn, nó có đặc tính ổn định đối với nhiệt 100o

C trong 2 giờ, alcol Ngoài ra kháng nguyên O còn có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao quản [3, 7, 11]

Kháng nguyên H: có bản chất là protein, rất kém bền vững so với kháng nguyên O Là loại protein không bền nhiệt, bị diệt ở 70oC hay dưới tác dụng của cồn, các enzyme tiêu hủy protein, nhưng chịu được formol Kháng nguyên H gắn liền với roi của vi khuẩn nên kháng nguyên này chỉ hiện diện trên các chủng có tiêm mao Kháng nguyên tiêm mao H có thành phần khác nhau tùy vào kiểu huyết thanh Kháng nguyên H có chứa 2 pha:

Pha 1 là pha đặc hiệu do chất kháng nguyên đặc hiệu của loài vi khuẩn tạo thành, bao gồm 28 loại kháng nguyên tiêm mao, biểu thị bằng chữ La tinh: a, b, c, g, m…[11, 31]

Pha 2 là pha không đặc hiệu: nhiều loại Salmonella chứa pha này, gồm hơn 6

loại biểu thị bằng số Ả rập 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay chữ La tinh e, n, x… Đến nay người ta

có khuynh hướng không đặt tên các chủng Salmonella nữa, mà chỉ biểu thị bằng công thức kháng nguyên O và kháng nguyên H, ví dụ S 6, 8: r – 1, 5 [11, 31]

Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng Sự ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả năng cắt roi của vi khuẩn

Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệu cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết thanh [7]

Kháng nguyên Vi: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl

Kháng nguyên này chỉ được xác định trên 3 kiểu huyết thanh: S typhi, S paratyphi và S dublin Kháng nguyên Vi của một số chủng S typhi đặc biệt có sức đề kháng tốt đối với nhiệt độ cao hơn các chủng Salmonella thông thường khác (Heyns và ctv 1959; Euzeby, 1997) [18] Khi kháng nguyên Vi bị mất thì ngay lập tức S typhi

cũng chết

Hình 2.2 Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella

Tất cả 3 loại kháng nguyên này đều được sử dụng để chuẩn đoán bệnh thương hàn trong phòng xét nghiệm cận lâm sàng

Kháng nguyên O biểu hiện chủ yếu lúc bệnh mới khởi phát Kháng nguyên H biểu hiện mạnh lúc bệnh sắp kết thúc

Kháng nguyên Vi biểu hiện mạnh ở những người mang vi khuẩn mãn tính.Pili

Bảng 2.2 Cấu trúc kháng nguyên của một số loài Salmonella [19, 21]

Nhóm vi khuẩn

Loại vi khuẩn Kháng nguyên thân O Kháng nguyên tiêm mao H

A … B …

C1

D

S paratyphi A S typhimurium S abortivo equina S choleraesuis S typhi suis S typhosa S enteritidis S dublin S gallinarum S pullorum S typhi

1, 2, 12 1, 4, (5), 12 1, 4, 5, 12 6, 7 6, 7 6, 7 1, 9, 12, Vi 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12, (Vi)

a i (c) c d g, m g, p - d

(1, 5) 1, 2 e, n, x 1, 5 1, 5 (1, 7) - 1, 2

( ): có thể biến đổi, -: hiện diện từ sự biến đổi của trực khuẩn thể

b Độc tố đường ruột

Salmonella sản sinh hai loại nội độc tố là độc tố ruột gây xung huyết, mụn loét

và độc tố thần kinh gây ra các triệu chứng thần kinh [5, 17]

2.1.1.7 Sức đề kháng của vi khuẩn

Salmonella có sức đề kháng tốt, có thể sống ngoài cơ thể trong thời gian lâu

Trong đất hoặc nước có thể tồn tại từ 1 – 5 tuần, trong phân 1 – 2 tháng, trong nước đá hay thực phẩm đông lạnh có thể tồn tại 2 – 3 tháng [11]

Ở môi trường bên ngoài vi khuẩn Salmonella sống được khá lâu, trong ruột

bánh mì sống được 25 đến 30 ngày, trong bơ từ 3 – 7 ngày, ở pho mát 36 ngày, ở mỡ đến 3 tháng, trong thực phẩm bảo quản lạnh ở nhiệt độ - 18oC chúng có thể sống được vài tháng [10]

Tuy nhiên lại khá mẫn cảm với các thuốc sát trùng như: phenol 5%, cloramin 1%, clorua thủy ngân 0,2% chúng bị chết sau vài phút [10]

2.1.2 Các đặc điểm gây bệnh của Salmonella

2.1.2.1 Điều kiện gây bệnh

Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Salmonella đều bị ngộ độc Bởi vì Salmonella gây ngộ độc cho người phải có các điều kiện:

Thức ăn phải nhiễm một lượng lớn vi khuẩn sống, khoảng 106 – 107 để có thể vượt qua được tính acid cao của dạ dày và cạnh tranh với quần thể vi sinh vật tự nhiên trong ruột mới có khả năng biệu hiện bệnh Còn nếu lượng tế bào không đủ lớn thì sẽ bị cơ thể thải ra ngoài và không gây biểu hiện bệnh [15, 17]

Vi khuẩn trong thức ăn đi vào cơ thể sẽ phát triển và khi chết sẽ tiết ra một lượng lớn độc tố [17, 30]

Tùy thuộc vào sức chống đỡ của cơ thể chủ Trẻ em và người già, người ốm yếu, chức năng gan suy yếu và các bệnh về máu đều làm giảm sức đề kháng bệnh [ 17, 30]

Chủng Salmonella: không phải mọi chủng Salmonella nhiễm vào đều có biểu hiện bệnh mà chỉ một số như: S typhi, S paratyphi, S enteritidis… mới gây bệnh cho

người, biểu hiện của bệnh cũng khác nhau tùy từng kiểu huyết thanh [15, 26, 28]

2.1.2.2 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, sau đó theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết Do đó trong thời kỳ đầu, lấy máu người bệnh truyền cấy sẽ phát hiện vi khuẩn Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra độc tố Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu Ngoài ra, vi khuẩn trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và giảm chức

năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể Như vậy, Salmonella gây bệnh là do độc tố ruột

(enterotoxin) và có lẽ còn do cytotoxin và neurotoxin [17]

2.1.2.3 Các kiểu bệnh chính do vi khuẩn Salmonella

Các kiểu huyết thanh Salmonella thường có biểu hiện bệnh với những triệu

chứng lâm sàng không giống nhau được tóm tắt ở Hình 2.3

Viêm ruột: S enteritidis và S typhimurium thường gây bệnh viêm dạ dày, viêm

ruột, bệnh gây ra do tình trạng vệ sinh thực phẩm kém Biểu hiện bệnh đặc trưng là buồn nôn, đau bụng và tiêu chảy Vi khuẩn không vào máu Bệnh thường khu trú ở ruột [1, 2, 10, 34]

Nhiễm trùng máu: S choleraesuis là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu, vi

khuẩn vào cơ thể bằng đường miệng, xâm nhập vào máu gây bệnh, khu trú ở phổi, xương, màng não Ví dụ như xương, gây biến chứng là bệnh viêm khớp kinh niên, xảy ra vào 3 – 4 tuần sau khi bắt đầu phát bệnh mạnh mẽ [1, 2, 6]

Các bệnh gây ngộ độc bằng độc tố của S enteritidis, S typhimurium, S

choleraesuis không sốt, gây ói mửa Cơ thể trở lại bình thường khi được điều trị, không gây thành dịch.[2, 34]

Bệnh thương hàn: S typhi gây ra bệnh sốt thương hàn, S paratyphi A, S paratyphi B (S schottmuleri) gây bệnh phó thương hàn Triệu chứng bệnh cũng giống

như sốt thương hàn, nhưng ở mức độ nhẹ hơn Bệnh phát triển thành dịch và người bệnh nằm viện lâu [2, 6, 18]

Hình 2.3 Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thường gặp

2.1.2.4 Nguồn lây nhiễm

Thực phẩm bị nhiễm bệnh là nguồn gây bệnh dễ dàng và nhanh nhất do vi khuẩn có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, nhất là thực phẩm chưa nấu chín, rau tươi, quả, rau salát, bánh bao, bánh rán, sữa chưa thanh trùng, nhuyễn thể, tôm, cua sống trong khu vực có nguồn nước thải ô nhiễm cao do nguồn phân người và động vật

Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt,

trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy hải sản Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp [13, 15, 16]

Enterobacteriaceae

Salmonella

S choleraesuis S enteritidis S typhimurium S paratyphi A, B, C S typhi

2.1.2.5 Triệu chứng gây bệnh

Triệu chứng bệnh do Salmonella biểu hiện phụ thuộc vào số lượng và tỉ lệ vi

khuẩn nhiễm vào thực phẩm Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, có khi vài giờ nhưng cũng có khi vài ngày Các dấu hiệu đầu tiên là bệnh nhân thấy nhức đầu, chán ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy Thân nhiệt tăng lên 38 – 40oC trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát bệnh và tùy thuộc mức độ nặng nhẹ mà kéo dài 3 – 7 ngày Bệnh nặng gây ra viêm dạ dày , ruột Vi khuẩn tồn tại trong ống tiêu hóa từ 6 – 8 tháng và tiếp tục bài thải ra môi trường bên ngoài Vi khuẩn thải giảm 50% ở tuần thứ hai và còn 15% vào tuần thứ 4 [17]

2.1.2.6 Phòng ngừa

Đối với gia súc, phải nuôi dưỡng tốt, thú được kiểm tra tình trạng sức khỏe trước khi giết, và tách phủ tạng trắng cẩn thận để tránh vấy nhiễm cho các phần khác

Đối với thực phẩm, phải tránh sự vấy nhiễm Salmonella từ người và động vật bị

bệnh thương hàn, nước, côn trùng, động vật mang trùng bị nhiễm bệnh Tuân thủ triệt để quy trình vệ sinh thực phẩm và cải thiện vệ sinh môi trường trong quá trình sản xuất Xử lý nhiệt độ hoặc các phương pháp khác để diệt vi khuẩn như nấu nướng kỹ hoặc thanh trùng pasteur Ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn trong thực phẩm bằng cách bảo quản đông lạnh thích hợp hoặc các phương pháp khác

Đối với công nghiệp thực phẩm và thương nghiệp: áp dụng quy chế vệ sinh thực phẩm trong sản xuất, bảo quản, vận chuyển, phân phối và phục vụ người tiêu thụ Định kỳ khám sức khỏe cho người làm công tác tiếp xúc với thức ăn, phát hiện kịp thời những người lành mang vi khuẩn

2.2 Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đối với Salmonella2.2.1 Salmonella trong thực phẩm

Thực phẩm có giá trị dinh dưỡng càng cao càng dễ bị nhiễm vi sinh vật phân

giải Đồng thời với sự phân giải thực phẩm do Salmonella bao giờ cũng kèm theo sự

xuất hiện các sản phẩm gây ngộ độc cho người sử dụng

Thực phẩm gây ngộ độc thường là thức ăn có nguồn gốc động vật như thịt gia súc gia cầm Thịt là nguyên nhân gây ngộ độc chiếm 68% ở Anh và 88% ở Pháp Ngoài ra có thể ngộ độc do ăn trứng, cá, sữa nhưng tỉ lệ ít hơn nhiều Thực phẩm bị

nhiễm Salmonella thường không làm thay đổi tính chất lý hóa và trạng thái cảm quan

của thực phẩm, vì thế rất khó bị phát hiện Nhìn chung, thực phẩm gây ngộ độc thường có độ ẩm cao, pH không acid, đặc biệt là thức ăn đã nấu chín dùng làm thức ăn nguội như món đông, patê, xúc xích, dồi tiết thường là nguyên nhân của những vụ ngộ độc

thức ăn do Salmonella [25, 36]

Ngoài ra, hoa quả và các loại rau ăn sống mặc dù có rửa sạch trước khi ăn

nhưng không thể hết nguy cơ nhiễm Salmonella do chúng có thể phát triển thành số

lượng lớn hơn nhiều nếu không qua chế biến, nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng phân bón hữu cơ cho rau quả và sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm [16]

2.2.2 Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm

Theo CDC, mỗi năm nước Mỹ có khoảng 40 000 người là nạn nhân của vi

khuẩn Salmonella, tuy nhiên con số này có thể còn cao hơn 30 lần Số người tử vong vì nhiễm Salmonella hằng năm vào khoảng 600 người Hầu hết số người bị vi khuẩn

này tấn công đều có biểu hiện tiêu chảy, sốt và chuột rút ở bụng Bệnh kéo dài 4 – 7 ngày.[23]

Ở Hà Lan, từ năm 1996 đến năm 2001, có 13 970 trường hợp bị ngộ độc do

Salmonella, trong đó S enteritidis chiếm tới 43,6%, S typhimurium chiếm 32%, S typhi chiếm 0,8% Ở các loài động vật được dùng làm thực phẩm thấy tỉ lệ nhiễm S typhimurium cũng khá cao như ở bò là 32,9%, lợn chiếm 66,4%, riêng gia cầm chỉ có 5,3% nhưng có tỉ lệ nhiễm S enteritidis tới 20,3% [27]

Ở Việt Nam, theo thống kê năm 2001 của Bộ Y tế thì trong quý III có 1684 trường hợp mắc bệnh thương hàn làm chết người

2.2.3 Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm

Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các

nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu

thực phẩm nhất định Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng

Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế

4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml

đối với tất cả các loại thực phẩm Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT

của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc

phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm như Bảng 2.3 Ủy Ban Châu Âu quy

định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào

Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những

bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả Hiện nay đã có

nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như

thử nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ đã là chuyện bình thường Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần

tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella [1]

Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella

Bảng 2.3 Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại

thực phẩm theo Thông tƣ 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế

Thịt và các cơ quan nội tạng dùng làm thực phẩm muối, sấy khô, hun khói

TCVN 5153:90

Điều đáng lưu ý là chỉ tiêu Salmonella không phân biệt chủng có gây bệnh hay

không Trong thực tế các phòng phân tích vi sinh thực phẩm chỉ thực hiện các xét

nghiệm để phát hiện Salmonella spp., không làm xét nghiệm để phân biệt loài hay định

danh chủng gây bệnh Đây là một rào cản lớn cho các nhà sản xuất và xuất nhập khẩu thực phẩm

2.3 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy

Đây là phương pháp định tính và kết quả được báo cáo là có hay không phát

hiện Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm Do quy định không cho phép có

mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện, cho nên mẫu lấy tối thiểu phải 25 g và

quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng

nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình bảo quản chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn

các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella [5, 9,15]

Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh

chọn lọc, phân lập và khẳng định Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp

2.3.1 Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment)

Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc

họ Enterobacteriaceae; riêng FDA của Mỹ thì thường sử dụng Lactose broth cho một

số nhóm thực phẩm [4, 13]

Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù hợp Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi [9]

2.3.2 Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment)

Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng

cách ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập

Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng là

Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite Cystein Broth (SC) [15, 24]…Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác Một vài nghiên cứu gần đây của AOAC (Association of Official Analytical Communities - Hiệp hội các nhà phân tích của Mỹ) cho rằng mặc dù môi trường Selenite Cystein

Broth có chứa selenite ức chế mạnh các vi khuẩn khác ngoại trừ Salmonella nhưng

muối sodium biselenite có thể gây ưng thư khi tiếp xúc với cơ thể người nên hạn chế sử dụng và thấy rằng môi trường RV có thể thay thế cho các loại môi trường trên để phân tích mẫu Canh RV có tác dụng ức chế vi khuẩn khác nhờ vào MgCl2 bằng cách tác động lên thành tế bào vi khuẩn và nhờ vào màu xanh malachite ức chế các vi khuẩn Gram dương [14]

Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi trường tối ưu

chung cho tất cả các dòng Salmonella Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác Ví dụ: S typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT; S dublin không phát triển được trong môi trường RV Ngoài ra, mỗi môi trường

chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37o

C trong 22 – 24 giờ [5, 15, 24]

Ngày nay, các yêu cầu về vệ sinh thực phẩm đều khuyếch khích các phòng thí

nghiệm sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc Salmonella để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các serotype Salmonella trong mẫu [19, 22]

2.3.3 Giai đoạn phân lập (isolation)

Đây là bước tách biệt Salmonella trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng

Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric Agar (HE)…Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình

thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau [8, 15, 16, 24]

Một số đặc điểm chính của các môi trường trên là với sự hiện diện của nấm

men, đường, peptone tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng Salmonella và Shigella yếu ớt

Sự sản sinh ra H2S cũng có thể xảy ra nhờ sự hiện diện của sắt thiosufate và sắt citrate đã thể hiện bởi những khuẩn lạc có tâm đen do sự tạo nên sulfua sắt Trên các môi

trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu khuẩnlạc đặc trưng khác nhau Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng tròn, trong suốt, có hay không có

tâm đen Một số dòng Salmonella có khả năng sinh H2S, trừ S typhi thì khuẩn lạc

trong suốt và không có tâm đen [19, 20]

Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay

không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc

vi khuẩn Salmonella Một số chủng có thể sinh khuẩn lạc màu lục với môi trường

xung quanh ít nhiều có màu đen [16, 20]

Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc Một số Salmonella xuất hiện

khuẩn lạc màu lục trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose

gây ra vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh; dưới 1% Salmonella không điển hình,

chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục [9, 37]

Trên môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen Một số loài Salmonella có thể phát triển thành khuẩn lạc

có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn toàn có màu đen

Một cách điển hình, có mộ số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có hoặc

không có tâm đen [9, 20]

Cũng như bước tăng sinh chọn lọc, việc sử dụng hai hay nhiều môi trường phân lập sẽ cho phép gia tăng sự phát hiện số lượng các kiểu huyết thanh khác nhau trong mẫu, trong đó môi trường XLD được khuyến khích sử dụng

Hơn nữa, qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào

Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi chúng bằng một trong các môi

trường như Tryticase Soya Agar (TSA) hay Brain Heart Infusion (BHI) để nhân sinh khối và được dùng tiếp cho các phản ứng sinh hóa và phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh về sau

2.3.4 Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa

Đây là bước xác nhận các dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường

phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng Các biểu hiện sinh

hóa của Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase

(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+) Nếu các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá

Vi khuẩn sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm

sinh hóa nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella

Thử nghiệm trên môi trường Triple Sugar Iron agar (TSI) hay Kligler Iron Agar

(KIA) để phân biệt các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae Môi trường TSI hay

KIA thường dùng để khảo sát sự lên men đường glucose, lactose và khả năng sinh khí H2S, khí H2 và CO2 của vi khuẩn Trong môi trường có chất chỉ thị màu phenol red dùng để phát hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn Đây là môi trường rắn, được chuẩn bị trong ống nghiệm ở thể nghiêng sâu Về cơ chế, đường glucose luôn được vi sinh vật sử dụng trong điều kiện yếm khí tương đối, vì vậy ở phần đáy ở ống nghiệm nuôi cấy luôn tạo ra nhiều acid và làm thay đổi màu của môi trường từ đỏ sang vàng,

đồng thời sản sinh ra gas Đối với Salmonella do không sử dụng đường lactose và

sucrose nên sự phân hủy các acid amin rất mạnh trong điều kiện hiếu khí, sau 24 giờ ủ, làm trung hòa hay chuyển kiềm mặt thạch nghiêng làm chúng có màu đỏ Khi có màu

đen xuất hiện ở vùng nối hai phần nghiêng và sâu là do Salmonella có khả năng khử

sulfate có trong môi trường, tạo thành khí H2S Chất này phản ứng với Fe2+

(ferrous sulfate) để tạo thành kết tủa sulfua sắt màu đen Nếu có sinh hơi thì có những bọt khí xuất hiện sâu trong ống thạch [5, 29]

Thử nghiệm lên men đường mannitol: Salmonella có khả năng lên men đường

mannitol sinh acid sẽ làm giảm pH, do môi trường có chất chỉ thị màu phenol red nên chuyển từ màu đỏ thành màu vàng [5]

Thử nghiệm Lysine Decarboxylase (LDC): với phản ứng tím LDC, các vi

khuẩn Salmonella có khả năng tạo enzyme lysine decarboxylase trong môi trường có

lysine, ngoại trừ một vài chủng của S gallinarum và S choleraesuis Vì cơ chế lên

men decarboxylase có thể tác động lên nhóm carboxyl (-COOH) của acid amin sinh ra amin và khí CO2 Do trong môi trường LDC broth có chứa các thành phần như chất chỉ thị màu bromocresol purple, chất pyridoxal, lysine monohydrochloride và 1% glucose Các sản phẩm cuối cùng của hệ enzyme này sẽ chuyển pH sang kiềm, môi trường có màu tím hoặc xanh và có sinh khối Phản ứng âm tính được thể hiện ở màu vàng của môi trường [20]

Thử nghiệm Urea phenol red broth: Salmonella không phân giải được urea

thành NH3 nên không làm thay đổi pH, môi trường sau khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên màu tím ban đầu Phản ứng dương tính môi trường có màu đỏ hồng [5, 20, 29]

Khi các phản ứng sinh hóa phù hợp với Salmonella thì có thể kết luận các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella spp Bất kỳ một trong bốn phản ứng sinh hóa trên không phù hợp thì không phải là Salmonella

2.3.5 Phản ứng huyết thanh ngƣng kết trên phiến kính để định nhóm hay loại vi khuẩn

Salmonella có 3 loại kháng nguyên: kháng nguyên O bền với nhiệt, được dùng

để chia thành nhóm, kháng nguyên H không bền với nhiệt dùng để định loại, kháng nguyên Vi không bền với nhiệt thường che lấp ngăn chặn phản ứng kháng nguyên O

Từ những mẫu phân lập dương tính Salmonella, tiến hành định serotype để xác định

những nhóm nào thường hiện diện trong các loại nhóm thực phẩm cũng như cung cấp thêm những thông tin đánh giá về tình hình vệ sinh do những nhóm vi khuẩn

Salmonella nào nhiễm nhiều nhất từ đó có ý nghĩa trong vấn đề vệ sinh an toàn thực

phẩm

Vì có hàng ngàn serotype Salmonella, nên việc xác định Salmonella không phải

là đơn giản Người ta đi vào các nhóm hỗn hợp, rồi đến các nhóm đơn giản dần Có những nhóm hỗn hợp O như OMA, OMB, OMC, OMD… Nhóm OMA gồm các nhóm thường gặp nhất: A, B, E, L Nhóm OMB gồm C, F, G, H Nhóm OMC gồm I, J, K, M, N, O, P… Kháng huyết thanh sản xuất tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh có kháng huyết thanh O đa giá, OMA, OMB, kháng huyết thanh O đơn giá như các nhóm A, B, D, E, và C Muốn xác định serotype nào cần phải thử ngưng kết với kháng huyết

thanh H Ví dụ: S typhi và S enteritidis đều có thể gây nhiễm trùng máu, nên khi

ngưng kết với kháng huyết thanh O nhóm D xong chúng ta phải làm

thêm kháng huyết thanh H: nếu ngưng kết với H : d kết luận là S typhi, nếu ngưng kết với H : g, m thì kết luận là S enteritidis [14]

Trước hết ta dùng huyết thanh ngưng kết đa giá (Polyvalent O antiserum), loại

này chứa tất cả kháng thể O của Salmonella từ A đến F, ngưng kết nhanh, hoàn toàn hầu hết vi khuẩn thuộc giống Salmonella Nếu dương tính, sau đó tiếp tục làm phản

ứng gốc vi khuẩn đó với huyết thanh ngưng kết nhóm (grouping antiserum) từ A đến F, sự ngưng kết này sẽ xảy ra nhanh và hoàn toàn nếu huyết thanh ngưng kết và gốc vi khuẩn cùng nhóm [2]

Nếu làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá vô nghiệm ta phải thực hiện phản ứng với huyết thanh ngưng kết Vi Trường hợp kết quả phản ứng dương tính với huyết thanh ngưng kết Vi, chứng tỏ gốc vi khuẩn có kháng nguyên Vi che lấp phản ứng của kháng nguyên O với kháng thể O, do đó ta phải đun cách thủy huyền trọc vi khuẩn ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút để loại bỏ kháng nguyên Vi khỏi bề mặt tế bào Sau khi để nguội, làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá và huyết thanh ngưng kết nhóm C và D Nếu kết quả âm tính với cả hai loại huyết thanh ngưng kết đa

giá và Vi, gốc vi khuẩn không phải là Salmonella [2]

2.3.6 Các phản ứng sinh hóa xác định các loài phụ Salmonella

Để xác định các loài phụ Salmonella phải tiến hành các phản ứng sinh hóa được

trình bày trong Bảng 2.4