BƯỚC ÐẦU NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN Helicobacter pylori -CỦA CHITOSAN

BƯỚC ÐẦU NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN Helicobacter pylori -CỦA CHITOSAN NguyỄn HỮu ÐỨc* HỒ thỊ Tú Anh** ÐẶT VẤN ÐỀ Năm 1983, Marshall và Warren phát hiện một loại vi khuẩn hiện diện ở niêm mạc dạ dày (1) trước đặt tên là Campylobacter pylori sau đặt tên là Helicobacter pylori. Người ta đã xác lập mối liên hệ giữa vi khuẩn này với bệnh viêm loét dạ dày-tá tràng, và đặt vấn đề tiệt trừ H. pylori như liệu pháp quan trọng trong điều trị viêm loét. Ðã có một số phác đồ điều trị kết hợp thuốc chống tiết acid hoặc thuốc bảo vệ tế bào với các kháng sinh như: amoxycillin, tetracyclin, metronidazol, clarithromycin. (2,3) Tuy số lượng thuốc dùng trong điều trị viêm loét dạ dày-tá tràng có khá nhiều, đa dạng và có nhiều tiến bộ trong điều trị nhưng việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới, đặc biệt từ các hợp chất thiên nhiên nhằm khắc phục các tác dụng phụ do thuốc là hóa chất tổng hợp vẫn được đặt ra. -Chitosan, hợp chất được điều chế từ nguồn thiên nhiên là vỏ tôm cua, đã được nghiên cứu sử dụng trong lĩnh vực y dược. Chitosan đã được ghi nhận có tính bảo vệ niêm mạc. (4) Ðặc biệt, ở nước ta chitosan đã được nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn. (5) Trong công trình nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu điều chế chitosan theo phương pháp thủy nhiệt có sửa đổi và thử tác dụng ức chế pepsin (in vitro), tác dụng bảo vệ tế bào (in vivo) của sản phẩm điều chế. Kết quả cho thấy, cùng sử dụng lượng giống nhau (100mg), chitosan có tác dụng ức chế pepsin tốt hơn sucralfate, trên mô hình ethanol chitosan dùng liều 500mg/kg có tác dụng chống loét tương đương với sucralfate dùng liều 60mg/kg. (6) Tiếp tục công trình trên, trong phạm vi đề tài này, chúng tôi thử tác dụng kháng khuẩn H. pylori của chitosan. vật liệu và phương pháp 1. Nguyên liệu 1.1. Chitosan: điều chế từ vỏ tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) theo phương pháp thủy nhiệt có sửa đổi và được kiểm nghiệm tính dược dụng. (6) Chitosan được điều chế thành 2 dạng: - Dạng hỗn dịch (chitosan HD 2%): hòa tan bằng cách đun cách thủy chitosan trong dung dịch HCl 1%, sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH 1% để có pH 7-8, chitosan dạng kết tủa mịn được tạo thành. Rửa kết tủa cho đến khi không còn ion clorid. Khuấy chitosan kết tủa trong nước cất để tạo hỗn dịch 2%. - Dạng dung dịch gel trong (dung dịch chitosan gel 1,7% pH6): thêm HCl 3% vào chitosan dạng hỗn dịch đã được pha ở nhiều nồng độ khác nhau để đạt pH6, đun cách thủy để hòa tan. Ðã chọn được nồng độ 1,7% để có chitosan dạng dung dịch gel trong. 1.2. Vi khuẩn thử nghiệm: - Escherichia coli ATCC 25922. - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Hai chủng vi khuẩn trên đạt tiêu chuẩn quốc tế do Bộ môn Vi sinh, Khoa Dược, Trường ÐH Y Dược TP.HCM cung cấp. - Helicobacter pylori: 20 chủng H. pylori được phân lập và nuôi cấy từ mẫu mô sinh thiết niêm mạc hang vị dạ dày của các bệnh nhân nội soi tại phòng khám Ða khoa, ÐHYDTP.HCM. Mẫu mô được lấy theo đúng tiêu chuẩn chọn mẫu, được bảo quản trong dd NaCl 0,9% ở 4oC và cấy trước 4 giờ kể từ khi lấy. 2. Phương pháp 2.1. Phương pháp nuôi cấy H. pylori: Mẫu mô sinh thiết được nghiền nát giữa 2 tấm lam vô trùng và được cấy vào các hộp thạch chứa môi trường thạch máu gồm các thành phần: (7) Columbia agar, 7% máu cừu, 4% huyết thanh bào thai bê, amphotericin B (20 µg/ml), acid nalidixic (10 µg/ml) , vancomycin (3µg/ml). Các hộp thạch được đem ủ ở nhiệt độ 37 o C trong điều kiện vi hiếu khí được tạo bởi bao tạo khí Campy-Pak. Ðọc kết quả sau 5-7 ngày, khuẩn lạc là những khúm nhỏ, đường kính 1-2 mm, màu xám trong suốt. Thử các phản ứng để định danh vi khuẩn: urease, catalase, oxidase. Chọn khuẩn lạc mọc tốt, nhiều, đem hoạt hóa trong môi trường lỏng để làm thử nghiệm. 2.2. Thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn: - Thử trên E. coli và P. aeruginosa: Chitosan HD 2% và dd chitosan gel 1,7% pH6 được pha trong môi trường thạch dinh dưỡng (2ml dd chitosan pha trong 8ml thạch dinh dưỡng). Vi khuẩn được pha thành huyền dịch trong canh cấy lỏng dinh dưỡng với đậm độ 10 6 vi khuẩn/ml, được cấy trên dĩa thạch, đem ủ 37 o C/24giờ. Xác định vi khuẩn mọc nhiều, ít hay không mọc để kết luận vi khuẩn có nhạy cảm với chế phẩm. - Thử trên H. pylori: Chế phẩm chitosan được pha loãng trong môi trường thạch máu với các nồng độ như sau (Bảng 1): H. pylori -được pha thành huyền dịch trong canh cấy lỏng dinh dưỡng với đậm độ 10 6 vi khuẩn/ml và được cấy trên dĩa thạch có chứa chitosan. Các hộp thạch được ủ ở môi trường vi hiếu khí tạo bởi Campy-Pak ở 37 o C trong 3 ngày. Ðọc kết quả để xác định vi khuẩn nhạy cảm hay không nhạy cảm với chế phẩm. -Bảng 1. Nồng độ chitosan trong môi trường thạch máu Môi trường thạch máu (ml) Dd chitosan gel 1,7% (ml) Nồng độ chitosan (mg/ml) 9,5 0,5 0,85 9,0 1,0 1,7 8,0 2,0 3,4 6,0 4,0 6,8 Kết quả 1. Thử trên E. coli và P. aeruginosa: (Bảng 2) Bảng 2. Sự nhạy cảm của E. coli và P. aeruginosa đối với chế phẩm chitosan STT Chất thử nghiệm Nồng độ chitosan trong thạch dinh dưỡng E. coli P. aeruginosa 1 Chitosan HD 2% 4mg/ml +++ +++ 2 Dd chitosan gel 1,7% pH6 3,4mg/ml - - 3 Nước acid HCl pH6 +++ +++ Ghi chú: +++: vi khuẩn mọc mạnh : vi khuẩn bị ức chế hoàn toàn 2. Thử trên H. pylori: (Bảng 3) Bảng 3. Phân bố độ nhạy cảm của 20 chủng H. pylori -đối với chế phẩm chitosan ở các nồng độ khác nhau MIC của chitosan (mg/ml) 0,85 1,7 3,4 6,8 >6,8 Số chủng H. pylori thử nghiệm (n=20) 1 3 2 5 9 Bàn luận 1. Trước khi xác định sự nhạy cảm của H. pylori đối với chitosan, tiến hành thử nghiệm trên E. coli và P. aeruginosa là 2 loại vi khuẩn Gram (-) điển hình. Do chitosan là một polymer không tan trong nước nên được điều chế thành 2 dạng: dạng hỗn dịch trong nước 2% và dạng dung dịch gel 1,7% pH6. Kết quả của Bảng 2 cho thấy chitosan ở dạng dd gel 1,7% pH6 được pha loãng nồng độ 3,4 mg/ml ức chế E. coli và P. aeruginosa trong khi chitosan dạng hỗn dịch không cho tác dụng này. Trong một công trình khảo sát tác dụng kháng khuẩn của chitosan thực hiện trong nước trước đây, các tác giả cho biết đã dùng dung dịch chitosan 4% và xác định nồng độ ức chế tối thiểu đối với E. coli và P. aeruginosa là 2/1000. (5) Như vậy, để có tác dụng kháng khuẩn, chitosan cần ở trạng thái phân tán tốt trong môi trường và theo thử nghiệm này, chitosan được điều chế ở dạng dd gel pH6. Chúng tôi đã chọn pH6 vì theo một số tác giả nước ngoài, niêm mạc dạ dày là nơi ẩn trú của H. pylori có pH từ 5 đến 6, một chất kháng H. pylori tốt khi hoạt tính kháng khuẩn của nó thể hiện tốt ở pH acid của niêm mạc. (8) Từ kết quả thử trên, E. coli và P. aeruginosa, chitosan ở dạng dd gel 1,7% pH6 được chọn để thử trên H. pylori. 2. Dựa vào phương pháp pha loãng trong thạch để thử trên H. pylori, pha loãng dd chitosan dạng gel và khảo sát 4 nồng độ nằm trong khoảng gần với nồng độ đã thử với E. coli và P. aeruginosa (3,4 mg/ml). Khảo sát- trên 20 chủng H. pylori đã được phân lập và nuôi cấy, bảng 3 cho thấy chitosan với khoảng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: Minimum Inhibitory Concentration) từ 0,85 đến 6,8 mg/ml có thể ức chế một số chủng H. pylori. Tiệt trừ H. pylori trong viêm loét dạ dày-tá tràng hiện nay đã được thế giới công nhận. Vì vậy, một thuốc được nghiên cứu trong điều trị bệnh lý này thường được khảo sát xem có tác dụng kháng H. pylori hay không- Ngay như các thuốc trị viêm loét chống tiết acid đã được sử dụng trong lâm sàng lâu nay cũng được nghiên cứu thêm về hoạt tính kháng H. pylori . (9) Theo McNulty, một thuốc kháng H. pylori lý tưởng là thuốc có tác dụng kháng khuẩn vừa tại chỗ vừa toàn thân, bền vững với môi trường acid của niêm mạc và thấm được vào niêm mạc dễ dàng, đồng thời ít gây độc tính và tác dụng phụ. Bismuth subcitrate dạng keo mặc dù có tính kháng H. pylori khá tốt (MIC: 4-50 µg/ml), (10) nhưng do chỉ cho tác dụng tại chỗ nên trong điều trị tiệt trừ H. pylori phải kết hợp 2 kháng sinh khác. Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi ghi nhận chitosan có tác dụng bảo vệ tế bào đối với niêm mạc và trong thử nghiệm này, chitosan chứng tỏ phần nào có tác dụng ức chế H. pylori. Ðây chỉ là khảo sát sơ bộ in vitro nhưng kết quả thu được cho phép tiếp tục nghiên cứu kỹ hơn trong tương lai về tác dụng trị viêm loét dạ dà-tá tràng theo quan điểm hiện nay, đặc biệt tác dụng kháng H. pylori. Với ưu điểm là hợp chất được điều chế từ nguồn thiên nhiên là vỏ tôm phế thải có sẵn ở nước ta, hy vọng chitosan sẽ ít gây các tác dụng phụ bất lợi như các hóa chất tổng hợp. Chitosan rất có triển vọng trở thành tác nhân có tác dụng tại chỗ phối hợp với các thuốc khác để điều trị viêm loét dạ dày-tá tràng. KẾT LUẬN Từ kết quả thử có tác dụng ức chế trên E. coli và P. aeruginosa, chitosan ở dạng dd gel 1,7% pH6 được chọn để thử tính kháng khuẩn H. pylori. Khảo sát 20 chủng H. pylori được phân lập và nuôi cấy, chitosan dùng ở dạng dd gel 1,7% pH6 có tác dụng ức chế một số chủng H. pylori với khoảng MIC từ 0,85 đến 6,8mg/ml. Ðây chỉ là các kết quả bước đầu, chúng tôi còn tiếp tục nghiên cứu kỹ hơn vấn đề này. Tóm tắt Bước đầu thử nghiệm in vitro xác định tính nhạy cảm của các chủng H. pylori phân lập được tại TP. Hồ Chí Minh đối với chitosan qua 2 giai đoạn: 1. Thử trên E. coli và P. aeruginosa để xác định dạng bào chế thích hợp của chitosan dùng khảo sát tính kháng khuẩn là dung dịch gel 1,7% pH6. 2. Thử trên 20 chủng H. pylori phân lập được tại TP. Hồ Chí Minh theo phương pháp pha loãng trong thạch (5) cho thấy chitosan ở dạng dung dịch gel 1,7% pH6 có tác dụng ức chế một số chủng H. pylori với khoảng nồng độ ức chế tối thiểu từ 0,85 đến 6,8mg/ml. Summary PRELIMINARY STUDY ON EFFECT AGAINST HELICOBACTER PYLORI OF CHITOSAN The preliminary in vitro susceptibilities of clinical isolates of Helicobacter pylori to chitosan were determined in 2 stages: 1. By testing for inhibitory activity against E. coli and P. aeruginosa, we have determined the suitable form of chitosan producing antibacterial activity was 1.7% transparent chitosan gel solution pH6. 3. The in vitro susceptibilities of 20 clinical H. pylori isolates to 1.7% transparent chitosan gel solution pH6 were determined by an agar dilution technique. The MIC values of chitosan against some H. pylori isolates ranged from 0.85 to 6.8mg/ml. CẢM ƠN Chúng tôi chân thành cảm ơn PTS. Nguyễn Văn Thanh (BM Vi sinh, Khoa Dược, ÐHYD TP.HCM), PGS.PTS. Nguyễn Thanh Bảo (BM Vi sinh, Khoa Y, ÐHYD TP.HCM), BS. Lục Thị Vân Bích (TT Ðào Tạo và Bồi dưỡng CBYT TP.HCM) đã tận tình giúp đỡ thực hiện đề tài này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Marshall B. J., Warren J. R., Lancet i ,1273-1275, (1983). 2. Lam S. K., Talley N. J., Journal of GE and Hepatology 13, 1-12, (1998). 3. Malfertheiner P., Journal of GE and Hepatology 9, 1-2, (1997). 4. Knapczyk J., "Chitin and Chitosan Sources, Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Applications", Elsevier Applied Science, New York, 657-663, (1989). 5. Nguyễn thị Ngọc Tú và cs, Tạp chí Dược học 7, 19-21, (1998). 6. Nguyễn Hữu Ðức và cs, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật Y Dược chào mừng 300 năm Sàigòn-TP. HỒ CHÍ MINH 11-1998, 451-454, (1998) 7. Lục Thị Vân Bích và cs, Y học TP.HCM, Số đặc biệt Hội nghị KH Trường ÐHYD TP.HCM., (1997). 8. McNulty C. A. M., Dent J. C., Ford G. A., Wilkinson S. P., Journal of Antimicrobial Chemotherapy 22, 729-738, (1988). 9. Tomoyoki Iwahi et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy , 35(3), 490-496, (1991). 10. De Cesare Cavlli S., Basso O., "Drugs in Gastroenterology", Raven Press, New york, 217- 231,- (1991). . điều chế thành 2 dạng: - Dạng h n dịch (chitosan HD 2%): h a tan bằng cách đun cách thủy chitosan trong dung dịch HCl 1%, sau đó trung h a bằng dung dịch. định dạng bào chế thích h p của chitosan dùng khảo sát tính kháng khuẩn là dung dịch gel 1,7% pH6. 2. Thử trên 20 chủng H. pylori phân lập được tại TP. H