GIẢI TRÌNH TỰ DNA (DNA SEQUENCING)

GIẢI TRÌNH TỰ DNA (DNA SEQUENCING) NGUYEN LE THANH (MRES) SUB-DEPARTMENT MEDICAL BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY PHAM NGOC THACH MEDICAL UNIVERSITY Giải trình tự DNA • Xác định xác trình tự chuỗi DNA vùng quy định nhiễm sắc thể • Xác định chất gene • Điều hịa • Cấu trúc • Bổ sung gì? 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC Giới thiệu sơ lược • Giải trình tự DNA: • Xác định thứ tự nucleotide (ATGC) DNA khn • Trình tự Sanger: • DNA khn khuếch đại • Huỳnh quang “dừng chuỗi” (ddNTP) đánh dấu điểm dừng • Giải trình tự hệ mới/tiếp theo – Next Generation Sequencing (NGS) • • • • Hiện đại Quy mô lớn Tốc độ cao Giá thành giảm Phương pháp (1) Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert • • • • • 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC Đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ mạch đơn Xử lí hóa học đặc hiệu  phân hủy đặc trưng loại nucleotide mạch DNA  tạo đoạn oligonucleotide có chiều dài nucleotide phát điện di Điện di gel polyacriamid  trình tự mạch đơn (G, A+G, C, C+T) Hóa chất độc hại, phóng xạ Phương pháp (2) Phương pháp enzyme sử dụng dideoxynucleotide (Trình tự Sanger): • Nguyên liệu • • • • • Mạch bổ sung DNA polymerase DNA primer dNTP ddNTP (di-deoxyribosenucleotide triphosphate) khơng có -OH  kết thúc q trình kéo dài chuỗi • Quy trình • Sao chép DNA (Clone DNA) • Gắn primer • Cho hỗn hợp DNA+primer+dNTP vào ống có chứa ddNTP riêng biệt  ống • Điện di đọc kết 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC Phương pháp (2) Trình tự Sanger • Ưu: • • • • Không độc hại M&G Có thể tự động hóa Đọc chừng 700 bp? Dễ sử dụng • Nhược • • • • 15-40 bp đầu dễ bị sai? Mất thời gian Phí đầu tư Đọc bp (300-1000bp) 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC Một số video tham khảo • https://www.youtube.com/watch?v=vK-HlMaitnE • https://www.youtube.com/watch?v=c2bAtGycqx4 Phương pháp (3) Next generation sequencing – Giải trình tự hệ • Xây dựng library: phân trình tự nucleic aicd mẫu gắn với adapter • Khuếch đại: khuếch đại trình tự (clone hay PCR) • Do có hỗ trợ máy móc, nên nhiều lần chạy phản ứng Sanger lúc • Giải chuỗi DNA ngắn: 50-70 nu Một số kỹ thuật Giải trình tự hệ phổ biến: • Pyrosequencing • Illumina – Giải trình tự tổng hợp (Sequencing by synthesis) • Giải trình tự kết nối (Sequencing by ligation) • Ion torrent: Proton / PGM sequencing 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC 11 Pyrosequencing 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC 12 Sequencing by synthesis Sequencing by ligation (SoLID) Ion Torrent (pH / Semiconductor) Sequencing Ứng dụng • Genome study • • • • Hiểu thêm loại bệnh phức tạp Nghiên cứu loài Nghiên cứu đột biến Chữa trị ung thư • Giá thành: 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC 18 Tài liệu tham khảo • https://www.youtube.com/watch?v=9YxExTSwgPM • https://youtu.be/jFCD8Q6qSTM • https://tapchisinhhoc.com/giai-trinh-tu-gen-thehe-moi.html/ Một số câu hỏi • Mục đích việc giải trình tự DNA gì? • Vai trị dideoxynucleotide q trình giải trình tự gì? • So sánh phương pháp PCR giải trình tự DNA? (Giống khác nhau, ưu nhược điểm nào?) 31/10/2018 BM HS-SHPT Y HOC 20 THANK YOU Any question? ... https://tapchisinhhoc.com/giai-trinh-tu-gen-thehe-moi.html/ Một số câu hỏi • Mục đích việc giải trình tự DNA gì? • Vai trị dideoxynucleotide trình giải trình tự gì? • So sánh phương pháp PCR giải trình tự DNA? (Giống khác nhau, ưu nhược điểm nào?)... Sanger lúc • Giải chuỗi DNA ngắn: 50-70 nu Một số kỹ thuật Giải trình tự hệ phổ biến: • Pyrosequencing • Illumina – Giải trình tự tổng hợp (Sequencing by synthesis) • Giải trình tự kết nối (Sequencing... sơ lược • Giải trình tự DNA: • Xác định thứ tự nucleotide (ATGC) DNA khn • Trình tự Sanger: • DNA khn khuếch đại • Huỳnh quang “dừng chuỗi” (ddNTP) đánh dấu điểm dừng • Giải trình tự hệ mới/tiếp