Slide bài giảng XÁC ĐỊNH COLIFORMS TỔNG SỐVÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNHBẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

XÁC ĐỊNH COLIFORMS TỔNG SỐ VÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Phạm Thị Vinh Hoa Bộ mơn Dinh dưỡng – Vệ sinh an tồn thực phẩm TẠI SAO CẦN KIỂM TRA COLIFORMS TỔNG SỐ? - Vi sinh vật thị mức độ ATVSTP nước: • • • khả có mặt VSV gây bệnh khác mẫu bị ô nhiễm mẫu bẩn chưa xử lý tốt - Không thị mức độ ATVSTP nước cho yếu tố hóa học Coliform bacteria are microbes found in the digestive systems of warm-blooded animals, in soil, on plants, and in surface water These microbes typically not make you sick; however, because microbes that cause disease are hard to test for in the water, "total coliforms" are tested instead If the total coliform count is high, then it is very possible that harmful germs like viruses, bacteria, and parasites might also be found in the water http://www.cdc.gov/healthywater/drinking/private/wells/testing.html Coliforms  Coliforms tổng số: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter  Coliforms phân: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter (chiếm 60% - 90% coliforms tổng số) Hơn 90% coliforms phân Escherichia (E.coli) American Public Health Association Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 18th Edition, 1992 Table 9225:I, p 9-66 ESCHERICHIA COLI (E.COLI) - Hình que, Gram-âm, khơng sinh bào tử - Lên men đường lactose sinh acid 44oC - Sự có mặt E.coli khẳng định nhiễm khuẩn từ phân http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli MỤC TIÊU HỌC TẬP Sau học, học viên có khả năng: - Trình bày nguyên lý phương pháp MPN - Trình bày phạm vi áp dụng, nguyên tắc bước tiến hành xác định Coliforms tổng số định lượng E.coli giả định thực phẩm - Nhận định kết NỘI DUNG BÀI GIẢNG Phạm vi áp dụng & nguyên lý phương pháp Phương pháp MPN Chuẩn bị thí nghiệm Các bước tiến hành Đọc kết PHẠM VI ÁP DỤNG & NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Phạm vi áp dụng Thực phẩm thức ăn chăn nuôi Các mẫu môi trường khu vực sản xuất xử lý thực phẩm Nguyên lý phương pháp Coliforms: Định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí ni cấy mơi trường tăng sinh chọn lọc 30oC, 37oC phù hợp phép thử khẳng định E.coli: Định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí tạo thành Indol từ tryptophan nuôi cấy canh thang tăng sinh chọn lọc 44oC phương pháp tính số có xác suất lớn (Most Probable number -MPN) PHƯƠNG PHÁP MPN  Nguyên tắc: xác suất thống kê phân bố VSV độ pha loãng khác mẫu  Mỗi độ pha loãng lặp lại nhiều lần (3 lần)  Các độ pha loãng chọn lựa cho lần lặp lại có số lần dương tính âm tính  Số lần dương tính ghi nhận so sánh với bảng thống kê  giá trị ước đoán số lượng VSV mẫu PHƯƠNG PHÁP MPN  Hai hệ thống MPN: - Hệ thống ống - Hệ thống 15 ống  Đặc điểm: - VSV mục tiêu phải có biểu đặc trưng môi trường nuôi cấy: sinh hơi, đổi màu môi trường - Cho phép định lượng mật độ VSV thấp thể tích mẫu lớn PHƯƠNG PHÁP MPN Hệ thống ống Hệ thống 15 ống 10 ml môi trường PHƯƠNG PHÁP MPN Lựa chọn độ pha lỗng để tính kết Thứ tự ưu tiên chọn từ  Chọn nồng độ thấp có tất ống (+)  chọn nồng độ nhỏ để tính Ví dụ có nhiều nồng độ chọn khơng có ống (+)  chọn nồng độ lớn khơng có ống (+) nồng độ lớn để tính Ví dụ 4, Nếu nồng độ nhỏ nồng độ lớn có tất ống (+)  chọn nồng độ mẫu nhỏ dãy Ví dụ Chọn nồng độ thấp dãy, có ống (+) Ví dụ Chỉ nồng độ đầu tiền có ống (+)  chọn thêm nồng độ pha loãng để tính nồng độ khơng có ống (+) Ví dụ 6, Mẫu Số ống (+) 33210 33330 22110 33000 22010 30000 20000 tổ hợp chọn PHƯƠNG PHÁP MPN Kết quả: Số VSV (MPN/ml) = kết tra bảng x (f/10) Trong đó: f: độ pha lỗng thấp chọn (10n) Ví dụ: 10-3 Tra Kết quả: 10-4 bảng 10-5 14x103/10=1,4x103 (MPN/ml) PHƯƠNG PHÁP MPN Tra bảng Mac Crady để suy mật độ VSV MPN/ 100ml 10-1 Tra 10 Kết -2 10-3 bảng 70x101/10=70 (MPN/ml) PHƯƠNG PHÁP MPN Số VSV = 70 MPN/ml PHƯƠNG PHÁP MPN Kết quả? CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM Flask Brilliant green bile broth Pipette EC broth Thuốc thử Indol (Kovacs) Peptone water - Dụng cụ, Môi trường phải khử trùng - Môi trường phải kiểm chứng LTS broth CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM Chủng chuẩn + Chứng âm: Salmonella typhimurium ATCC 14028 + Chứng dương: Escherichia coli ATCC 25922 Các chủng phải trạng thái hoạt hoá CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Bước 1: Đồng mẫu Cân 10 g/10ml mẫu + 90 ml dd peptone bình tam giác  nồng độ 10-1 Bước 2: Pha loãng mẫu Hút 1ml mẫu + 9ml dd peptone ống nghiệm  nồng độ 10-2 Pha loãng tiếp tục để nồng độ 10-3 10-4 … Bước 3: Nuôi cấy môi trường tăng sinh/chọn lọc Đổ 1ml mẫu + 9ml dd Tryptose Lauryl Sunfat ống nghiệm  nuôi cấy 37±1oC/24-48h kết (+): sử dụng lactose sinh khí CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Bước 4: Nuôi cấy môi trường chọn lọc Cấy chuyển từ ống LTS (+) sang: Coliforms: Canh thang mật lactose lục sáng (mật bị khơ) E.coli: EC broth (44oC) kết (+): sử dụng lactose sinh khí Bước 5: Thử sinh hóa khẳng định cho E.coli Cấy chuyển từ ống dd EC (+) sang trypton  nuôi cấy 44oC/48h  nhỏ 0.5ml dd Kovacs vào ống nuôi cấy kết (+): tạo vòng Indol màu đỏ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Thử nghiệm khả sinh Indol Mục đích Phát VSV có khả sinh indol  VSV có hệ emzym tryptophanase 44oC / 24h Thuốc thử Kovac’s Chủng VSV MT canh trypton Pứ dương tính Pứ âm tính Sơ đồ bước xác định coliforms tổng số Sơ đồ bước định lượng E.coli ĐỌC KẾT QUẢ (+) (-) (-) Coliforms/E.coli MT LTS (+) ĐỌC KẾT QUẢ (-) (+) E.coli MT EC (-) (-) (+) Coliforms MT mật lactose lục sáng ĐỌC KẾT QUẢ (+) (-) E.coli sinh Indol ... parasites might also be found in the water http://www.cdc.gov/healthywater/drinking/private/wells/testing.html Coliforms  Coliforms tổng số: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter  Coliforms. .. that cause disease are hard to test for in the water, "total coliforms" are tested instead If the total coliform count is high, then it is very possible that harmful germs like viruses, bacteria,... bacteria are microbes found in the digestive systems of warm-blooded animals, in soil, on plants, and in surface water These microbes typically not make you sick; however, because microbes that