So sánh tỷ lệ tạo phôi nang, tỷ lệ phôi nang tốt và tỷ lệ chuẩn bội của phôi nang nuôi cấy bằng hai phương pháp: Nuôi đơn hoặc nuôi cấy nhóm. Đối tượng và phương pháp: Thuần tập tiến cứu trên 224 phôi thu được từ 36 cặp vợ chồng làm thụ tinh trong ống nghiệm có thực hiện xét nghiệm di truyền tiền làm tổ bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới tại Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản, Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh Hà Nội từ 01/10 đến hết 31/10/2020.
Tạp chí y dợc học quân số 6-2021 NH HƯỞNG CỦA NI CẤY ĐƠN VÀ NI CẤY NHĨM TỚI TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA PHƠI NANG Nguyễn Thị Liên Hương1, Hà Mai Linh1 Phí Thị Tú Anh1, Lê Hồng1 TĨM TẮT: Mục tiêu: So sánh tỷ lệ tạo phôi nang, tỷ lệ phôi nang tốt tỷ lệ chuẩn bội phôi nang nuôi cấy hai phương pháp: nuôi đơn nuôi cấy nhóm Đối tượng phương pháp: Thuần tập tiến cứu 224 phôi thu từ 36 cặp vợ chồng làm thụ tinh ống nghiệm có thực xét nghiệm di truyền tiền làm tổ phương pháp giải trình tự gen hệ Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản, Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh Hà Nội từ 01/10 đến hết 31/10/2020 Kết quả: Tỷ lệ tạo phôi nang, tỷ lệ phôi nang tốt tỷ lệ phơi chuẩn bội nhóm ni cấy đơn 53,5%, 76,1% 43,8%, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với ni cấy nhóm (45,7%, 71,3% 30,8%) (p > 0,05) Kết luận: Tỷ lệ tạo phôi nang tỷ lệ phôi nang chuẩn bội phương pháp ni cấy đơn có xu hướng cao so với ni cấy nhóm, nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê * Từ khố: Tỷ lệ tạo phôi nang; Tỷ lệ phôi nang tốt; Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ; Nuôi cấy đơn; Nuôi cấy nhóm Effects of Group and Single Cultures on the Developmental Potential and Genetic Characteristics of Blastocysts Summary Objectives: Comparison of blastulation rate, good quality blastocysts formation rate, and euploidy rate between two different embryo culture methods: Single culture and group culture Subjects and methods: A prospective cohort study on 224 blastocysts obtained from 36 couples undergoing in vitro fertilization with preimplantation genetic testing by next-generation sequencing at the Assisted Reproductive Technologies, Tam Anh General Hospital, Hanoi, from 01/10 - 31/10/2020 Results: The blastocyst formation rate, the percentage of good blastocysts, and the rate of euploid embryos in the single culture group were 53.5%, 76.1%, and 43.8%, respectively, with no statistically significant difference in comparison with group culture (45.7%, 71.3%, and 30.8%) (p > 0.05) Conclusion: Blastulation and euploidy rate of embryos cultured by a single method tended to be higher than that of group culture, however, the difference was not significant * Keywords: Blastulation rate; Good blastocyst rate; Preimplantation genetic testing; Single culture; Group culture Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh Người phản hồi: Hà Mai Linh (linhhm@tamanhhospital.vn) Ngày nhận bài: 24/6/2021 Ngày báo đăng: 1/7/2021 35 Tạp chí y dợc học quân số 6-2021 ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi cấy phôi giai đoạn quan trọng chu kỳ thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) Một hệ thống nuôi cấy phôi tốt tạo điều kiện cho phôi phát huy tối đa tiềm phát triển Hệ thống ni cấy phơi bao gồm nhiều thành tố, đó, phương pháp ni cấy phơi cho yếu tố tác động tới khả phát triển phôi Hiện nay, phương pháp nuôi cấy phôi sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm hỗ trợ sinh sản ni cấy đơn ni cấy nhóm Trong đó, nuôi cấy đơn phương pháp nuôi cấy độc lập phơi giọt mơi trường ni cấy có phủ dầu Ở phương pháp ni cấy nhóm, nhiều phơi sử dụng chung nguồn môi trường nuôi cấy phơi tiếp xúc khơng tiếp xúc học với Nếu ni cấy nhóm dường có lợi cho phát triển phôi nhờ yếu tố tự tiết cận tiết [3] ni cấy đơn lại phương pháp ni cấy bắt buộc để áp dụng phương pháp xét nghiệm di truyền tiền làm tổ không xâm lấn Ở phương pháp này, dịch môi trường nuôi cấy sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho phân tích đặc điểm di truyền phôi Báo cáo Makieva năm 2020 cho thấy phơi nang ni cấy đơn có tỷ lệ chuẩn bội nhiễm sắc thể (NST) thấp rõ rệt so với phơi ni cấy nhóm Trong đó, nghiên cứu Saborido (2019) lại 36 khơng thấy có khác biệt tỷ lệ phôi chuẩn bội, tỷ lệ làm tổ, tỷ lệ thai lâm sàng tỷ lệ sinh sống hai phương pháp nuôi cấy [4] Theo tìm hiểu chúng tơi, có hai nghiên cứu báo cáo ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy phôi tới tỷ lệ lệch bội phôi nang hai công bố nghiên cứu hồi cứu với yếu tố nhiễu khó kiểm sốt Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tiến cứu với mục tiêu: So sánh tỷ lệ tạo phôi nang, tỷ lệ phôi nang tốt tỷ lệ chuẩn bội phôi nang nuôi cấy phương pháp nuôi cấy đơn với phôi nuôi cấy nhóm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 224 phôi thu từ 36 cặp vợ chồng làm thụ tinh ống nghiệm có thực xét nghiệm di truyền tiền làm tổ phương pháp giải trình tự gen hệ Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản, Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh Hà Nội từ 01/10 đến hết 31/10/2020 * Tiêu chuẩn lựa chọn: Người vợ có tuổi 35 có tiền sử sảy thai/ thai lưu ≥ lần làm IVF thất bại ≥ lần có phơi tốt ngày * Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân (BN) có định làm PGT- A kết hợp PGT- M PGT- SR, bệnh nhân có tiền sử bất thường di truyền sinh mang bất thường di truyền BN có nỗn tinh trùng bất thường nặng T¹p chí y dợc học quân số 6-2021 Phng pháp nghiên cứu * Thiết kế nghiên cứu: Thuần tập tiến cứu * Quy trình nghiên cứu: - Bệnh nhân đủ tiêu chuẩn nghiên cứu chia ngẫu nhiên thành nhóm dựa phương pháp ni cấy phơi đơn hay nhóm - Nỗn sau tiêm tinh trùng vào bào tương (intracytoplasmic sperm injection ICSI) đưa vào đĩa cấy có chứa giọt mơi trường ni cấy liên tục (Irvine, Hoa Kỳ) có phủ dầu cân tủ cấy CO2 qua đêm, nỗn/ giọt mơi trường Ni cấy nỗn phơi tủ cấy CO2, kiểm tra chất lượng thụ tinh 17 sau ICSI, kiểm tra chất lượng phôi ngày hai 44 sau ICSI kính hiển vi soi - Vào chiều ngày thứ ba sau ICSI, phôi hỗ trợ thoát màng tia laser chuyển đĩa cấy Nếu BN thuộc nhóm ni cấy đơn, phơi nuôi cấy riêng rẽ phôi giọt mơi trường ni cấy liên tục có phủ dầu Trong đó, BN thuộc nhóm ni cấy nhóm, - phôi nuôi cấy giọt môi trường loại - Vào chiều ngày 5, 7, phôi đưa khỏi tủ cấy đánh giá chất lượng Khi đạt độ nở từ BL1 trở lên theo phân loại Gardner, phôi tiến hành sinh thiết kính hiển vi đảo ngược có gắn hệ thống vi thao tác laser Từ đến 10 phôi bào cắt khỏi lớp tế bào nuôi - Phôi sau sinh thiết trữ đông lại phương pháp thủy tinh hóa (sử dụng hệ mơi trường Cryotech, Nhật Bản) Các mẫu phơi bào sau sinh thiết phân tích di truyền phương pháp giải trình tự gen hệ (tách chiết ADN tế bào phôi khuếch đại ADN kit Veriseq PGS, giải trình tự ADN máy giải trình tự Miseq - Illumina phân tích kết giải trình tự phần mềm BlueFuse) - Đánh giá chất lượng phôi nang dựa hệ thống phân loại Gardner có hiệu chỉnh theo tiêu chuẩn phịng thí nghiệm thụ tinh ống nghiệm Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh - Phôi đánh giá chuẩn bội có đầy đủ 24 nhiễm sắc thể theo kết phân tích di truyền phương pháp giải trình tự gen hệ * Chỉ tiêu nghiên cứu: - Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu (tuổi, nguyên nhân vô sinh, loại vô sinh, nồng độ AMH, AFC, số noãn chọc hút được, số nỗn ICSI, số phơi ngày 2) - So sánh tỷ lệ tạo phôi nang/số phôi ngày 2, tỷ lệ phôi nang tốt/tổng số phôi nang hai phương pháp ni đơn ni nhóm - So sánh tỷ lệ chuẩn bội phôi nang nuôi cấy hai phương pháp ni đơn ni nhóm * Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 22.0 37 T¹p chÝ y dợc học quân số 6-2021 KT QU NGHIấN CỨU Đặc điểm chung BN nghiên cứu Ni cấy đơn Ni cấy nhóm n = 10; n (%) n = 26; n (%) 38 (4,3) 37 (5,0) Do vợ (60,0) 17 (65,4) Do chồng (10,0) (7,7) Cả hai (10,0) Không rõ nguyên nhân (20,0) (26,9) Nguyên phát (10,0) (3,8) Thứ phát (90,0) 25 (96,2) Nồng độ AMH 3,2 (3,9) 1,4 (2,2) 0,39 AFC 14 (20,0) (7,0) 0,09 Số noãn chọc hút 8,5 (15,8) (6,3) 0,25 Số noãn ICSI 6,5 (8,8) (5,0) 0,31 (7,0) 4,5 (2,0) 0,16 Đặc điểm BN Tuổi p 0,62 Nguyên nhân vô sinh 0,42 Loại vô sinh Số phôi ngày 0,47 Các biến định lượng mô tả dạng trung vị (IQR), biến định tính mơ tả theo tỷ lệ phần trăm Khơng có khác biệt đáng kể đặc điểm BN hai nhóm nghiên cứu Phần lớn cặp vợ chồng nghiên cứu điều trị muộn nguyên nhân từ vợ đa số vô sinh thứ phát So sánh tỷ lệ tạo phôi nang hai phương pháp ni đơn ni nhóm Tạo phơi nang Khơng tạo phôi nang Tổng số phôi Nuôi đơn 46 (53,5) 40 (46,5) 86 (100,0) Ni nhóm 63 (45,7) p 0,25 75 (54,3) 138 (100,0) OR (95%CI) 1,15 (0,80 - 2,35) Tỷ lệ tạo phơi nang có xu hướng cao nhóm phơi ni cấy đơn, nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Ngày Ngày Ngày Tổng Nuôi đơn n (%) 31 (67,4%) 12 (26,1%) (6,5%) 46 (100,0%) Ni nhóm n (%) 39 (61,9%) 22 (34,9%) (3,2%) 63 (100,0%) p 0,49 Tỷ lệ phôi tạo nang ngày 5, ngày ngày khơng có khác biệt nhóm nghiên cứu 38 Tạp chí y dợc học quân số 6-2021 So sánh tỷ lệ phôi nang tốt hai phương pháp ni đơn ni nhóm Ni đơn n (%) Ni nhóm n (%) Phơi nang tốt Phơi nang trung bình - xấu Tổng số phơi 35 (76,1%) 11 (23,9%) 46 (100,0%) p OR (95%CI) 0,58 45 (71,3%) 18 (28,7 %) 63 (100,0%) 1,27 (0,53 - 3,04) Khơng có khác biệt tỷ lệ phôi nang tốt hai nhóm So sánh đặc điểm di truyền phơi nang ni cấy đơn ni cấy nhóm Tuổi phôi sinh thiết Phương pháp nuôi cấy Ngày Ngày Ngày Tổng Nuôi đơn n (%) 21 (65,6%) (25,0%) (9,4%) 32 (100,0%) Ni nhóm n (%) 37 (71,2%) 13 (25,0%) (3,8%) 52 (100,0%) p 0,58 Khơng có khác biệt tỷ lệ phơi sinh thiết ngày 5, ngày ngày nhóm nghiên cứu Chuẩn bội Lệch bội Khảm Khơng có kết Tổng số phôi Nuôi đơn n (%) 14 (43,8) 14 (43,8) (9,4) (3,1) 32 (100,0) Nuôi nhóm n (%) 16 (30,8) 30 (57,7) (9,6) (1,9) 52 (100,0) p 0,62 Tỷ lệ phôi chuẩn bội có xu hướng cao nhóm ni cấy đơn, nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê BÀN LUẬN Tỷ lệ tạo phôi nang chất lượng phôi nang nuôi cấy hai phương pháp Theo kết nghiên cứu chúng tôi, phôi nuôi cấy đơn có xu hướng phát triển tới giai đoạn phơi nang nhiều so với ni cấy nhóm (53,5% so với 45,7%) nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Tỷ lệ phôi nang tốt nhóm nghiên cứu khơng có khác biệt rõ ràng Nghiên cứu Lazaro (2010) cho thấy nhóm BN > 35 tuổi, khác biệt tỷ lệ phôi nang hữu dụng phôi nuôi cấy đơn phơi ni cấy nhóm khơng đáng kể [4] Mặt khác, báo cáo Ebner năm 2010 lại nhận thấy phơi ni cấy nhóm có tỷ lệ tạo phôi nang tỷ lệ phôi nang tốt cao có ý nghĩa thống kê so với ni cấy đơn [2] Tuy nhiên, nghiên cứu tác giả Ebner khơng giới hạn tuổi BN (tuổi trung bình 31,6 - tương đối thấp so với nghiên cứu chúng tôi), tác giả sử dụng phương pháp thụ tinh noãn (bao gồm ICSI IVF cổ điển) 100% noãn nghiên cứu thực phương pháp ICSI Tỷ lệ chuẩn bội phôi nang nuôi cấy hai phương pháp Kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ chuẩn bội phơi nang ni cấy đơn có 39 T¹p chÝ y dợc học quân số 6-2021 xu hng cao hn so với phơi ni cấy nhóm, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Tương tự vậy, nghiên cứu Saborido (2019) nhận thấy khơng có khác biệt tỷ lệ phôi chuẩn bội, tỷ lệ làm tổ, tỷ lệ thai lâm sàng tỷ lệ sinh sống hai phương pháp nuôi cấy [4] Mặt khác, báo cáo Makieva (2020) lại cho thấy phôi ni cấy đơn có tỷ lệ chuẩn bội thấp 7,1% so với ni cấy nhóm [5] Ngun nhân khác biệt nhóm tác giả đưa phơi ni cấy riêng lẻ có phơi dư vào nhóm ni cấy nhóm chất hồi cứu nghiên cứu tiềm ẩn số yếu tố gây nhiễu khó kiểm sốt Thực tế tự nhiên, chu kỳ buồng trứng người phụ nữ tạo noãn trưởng thành, sẵn sàng thụ tinh với tinh trùng Đường sinh dục nữ theo sinh lý nuôi dưỡng phơi thời kỳ thai sản Vì vậy, phôi tự nhiên không chịu ảnh hưởng phơi khác ni cấy nhóm Bên cạnh đó, ngồi tác động tích cực từ yếu tố cận tiết ngoại tiết, ảnh hưởng tiêu cực từ phôi chất lượng chưa nghiên cứu rõ ràng Ở nghiên cứu này, chưa tìm thấy khác biệt hiệu hai phương pháp nuôi cấy tới chất lượng phôi khả phát triển, hình thái lẫn đặc điểm di truyền, có lẽ cỡ mẫu nghiên cứu cịn nhỏ Để khẳng định kết luận này, cần nghiên cứu với cỡ mẫu lớn KẾT LUẬN Nghiên cứu 224 phôi thu từ 36 BN làm thụ tinh ống nghiệm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh tháng 10/2020 nhận thấy: 40 - Tỷ lệ tạo phôi nang phương pháp nuôi cấy đơn 53,5% cao khơng đáng kể so với ni cấy nhóm (45,7%) (p > 0,05) - Tỷ lệ phôi nang tốt hai phương pháp nuôi cấy tương đương nhau, 76,1% nhóm ni cấy đơn 71,3% với phương pháp ni cấy nhóm - Tỷ lệ phơi nang chuẩn bội hai phương pháp 43,8% nuôi cấy đơn 30,8% ni cấy nhóm, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê TÀI LIỆU THAM KHẢO Carmona Saborido L., Guillén González V., Santana Martín A., et al Effect on group culture vs individual culture on viability and embryo ploidy in pgt-a treatments Reproductive BioMedicine Online 2019; 39:e42 Ebner T., Shebl O., Moser M., et al Group culture of human zygotes is superior to individual culture in terms of blastulation, implantation and life birth Reprod Biomed Online 2010; 21(6):762-768 Huang L., Bogale B., Tang Y., et al Noninvasive preimplantation genetic testing for aneuploidy in spent medium may be more reliable than trophectoderm biopsy Proc Natl Acad Sci USA 2019; 116(28):14105-14112 Rebollar-Lazaro I., Matson P The culture of human cleavage stage embryos alone or in groups: Effect upon blastocyst utilization rates and implantation Reprod Biol 2010; 10(3):227-234 Srl N Comparison of ploidy outcomes between grouped and single embryo culture in preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) cycles , accessed: 14/11/2020 ... tỷ lệ tạo phôi nang, tỷ lệ phôi nang tốt tỷ lệ chuẩn bội phôi nang nuôi cấy phương pháp nuôi cấy đơn với phôi nuôi cấy nhóm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 224 phôi thu... sánh tỷ lệ tạo phôi nang/ số phôi ngày 2, tỷ lệ phôi nang tốt/tổng số phôi nang hai phương pháp nuôi đơn ni nhóm - So sánh tỷ lệ chuẩn bội phôi nang nuôi cấy hai phương pháp ni đơn ni nhóm * Xử lý... Khơng có khác biệt tỷ lệ phôi nang tốt hai nhóm So sánh đặc điểm di truyền phơi nang ni cấy đơn ni cấy nhóm Tuổi phơi sinh thiết Phương pháp nuôi cấy Ngày Ngày Ngày Tổng Nuôi đơn n (%) 21 (65,6%)