ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Kỹ thuật vi nhân giống trồng - Ni cấy mơ q trình ni cấy vơ trùng invitro phận tách rời thực vật nhằm: nhân giống cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối cho sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, trì bảo vệ nguồn gen quý… - Nhân giống invitro gọi vi nhân giống kỹ thuật sử dụng q trình ni cấy phận thực vật điều kiện vơ trùng ống nghiệm bình chứa - Vi nhân giống có điều kiện: + Có mảnh cắt nhỏ thực vật + Sạch vi sinh vật + Được nuôi cấy vô trùng Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật + Nuôi cấy đỉnh phân sinh + Phát sinh phơi vơ tính + Tạo mơ sẹo (callus) + Nuôi cấy lát mỏng + Vi ghép nhân giống + Nuôi cấy túi phấn + Nuôi cấy dung hợp protoplast thực vật + Chuyển nạp gen thực vật a Ni cấy đỉnh phân sinh Q trình sinh trưởng gồm giai đoạn: Giai đoạn phôi sinh: mơ phân sinh đỉnh hình thành mầm quan phân chia để tạo nên mô riêng biệt Giai đoạn sinh trưởng: q trình sinh trưởng nhanh chóng nên mầm quan đạt đến kích thước tối đa trở nên hình dạng xác định Giai đoạn phân hóa tế bào: hóa gỗ vách tế bào Các u xuất hiện, sau phát triển thành mầm lá, Ở nách có chồi nách Chồi nách thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân Quá trình tổng hợp DNA virus thực vật khơng xảy đỉnh sinh trưởng số chế không rõ Nên mô đỉnh sinh trưởng mô virus nhiễm virus Do vậy, kỹ thuật giúp virus Do vùng mô phân sinh nhỏ, kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng thực kính lúp Các đỉnh sinh trưởng kích thước 0,1 đến 0,15mm tạo 100% số bệnh tỷ lệ giảm dần đến kích thước mm Mẫu nhỏ khó tái sinh khả sống sót giảm Kích thước thường sử dụng 0.2 đến 1mm Ngoài ra, xử lý nhiệt giúp loại bỏ virus đỉnh phân sinh Hoặc số hóa chất diệt virus mơi trường ni cấy ribavirein Khi tạo đủ rễ, dùng làm nguyên liệu để tạo dòng bệnh phục vụ cho sản xuất Môi trường nuôi cây: Cytokinin 0.05 – 0.5 mg/l, Auxin: 0.01 – 0.1mg/l b Nuôi cấy mơ thực vật cách phát sinh phơi vơ tính - Phát sinh phơi vơ tính q trình tạo phôi từ tế bào mô soma hệ thống nuôi cấy Invitro - Giai đoạn 1: chọn giống có vật liệu ni cấy thích hợp: tạo callus, tạo huyền phù tế bào tạo protoplast - Giai đoạn 2: Cảm ứng khả tạo phôi tế bào nuôi cấy + Chuyển tế bào cần cảm ứng vào mơi trường ni cấy có nồng độ auxin cao Loại Auxin thường dùng 2,4-D hỗn hợp sữa dừa với nồng độ thấp NAA + Sau 1, tuần tế bào tiền phơi xuất Sau khối tế bào lớn lên, tiền phơi lớn chuyển sang mơi trường phân hóa Các tế bào nhỏ cấy chuyền để tiếp tục sản xuất phơi vơ tính - Giai đoạn 3: Phân hóa thành thục phơi vơ tính Sau tạo phơi vơ tính mơi trường auxin cao chuyển qua mơi trường phân hóa có Nito cao khơng chứa auxin Phơi vơ tính xuất từ tế bào đơn khối tế bào nuôi cấy, phát triển tính phân cực giống trình tạo phơi bình thường Ta bổ sung acid abscisic vào mơi trường làm tăng tính đồng đẩy mạnh phát triển bình thường phôi - Giai đoạn 4: Tạo con: Các phôi vơ tính thành thục đưa lên thạch khơng có chứa auxin có chứa cytokinin nồng độ thấp để tái sinh hoàn chỉnh - Giai đoạn 5: Đưa vừa ươm Sau có đầy đủ phận: lá, rễ Cần đưa vườn ươm chăm sóc khác c Nuôi mô thực vật phương pháp tạo mô sẹo (callus) - Mô sẹo: khối tái sinh vô tổ chức từ mẫu 2,4-D để tối dễ hình thành mơ sẹo - Khối Callus: + Tốc độ phân chia tế bào lúc đầu chậm, phải cần hỗ trợ auxin (tạo rễ) + Phase phân chia tế bào lại nhanh với sinh tổng hợp nhanh chóng DNA, RNA, Protein + Tiếp theo ngừng từ từ tốc độ phân chia tế bào + Phase phân hóa thành tế bào nhu mơ tế bào mô dẫn - Tỷ lệ Cytokinin/Auxin biễn diễn cho q trình tạo chồi/rễ mơ sẹo Nếu tỷ lệ vừa tạo chồi vừa tạo rễ d Nuôi cấy mô thực vật nuôi cấy lát mỏng e Nuôi cấy mô thực vật phương pháp vi ghép f Nuôi cấy mô thực vật phương pháp nuôi túi phấn g Nuôi cấy dung hợp protoplast tế bào thực vật Protoplast tế bào lớp vỏ cellulose cách xử lý enzyme cellulase Nó cịn màng sinh chất bao quanh chất ngun sinh Lai vơ tính q trình lai hai protoplast thành nhờ PEG dung hợp nhờ xung điện Q trình hấp thu đại phân tử DNA, RNA, Protein, virus, vi khuẩn, quan tử h Chuyển gen Thực vật - Nhờ VK Agrobacterium - Đặc điểm: vi khuẩn hình que, gram âm, có nhiều đất + Họ Rhizobiaceae: tạo khối u thực vật + Họ A Rhizogenes: gây bệnh rễ tóc - Sinh học phân tử: + Có Plasmid Ti họ Rhizobiaceae có chiều dài từ 120 – 150 kb Quyết định đặc tính gây u Trong đặc tính tương tự có Plasmid Ri họ A Rhizogenes gây rễ tóc + Một phần DNA Plasmid Ti Ri gọi DNA T hay gọi DNA vận chuyển Nó gắn vào gen gen thực vật làm xuất khối u rễ tóc Nhờ đặc tính mà ứng dụng plasmid Ti Ri làm vector chuyển gen để thay đổi tính trạng di truyền thực vật mà muốn Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật - Nuôi cấy mô tế bào tách rời tế bào thực vật môi trường dinh dưỡng tựa thể sống, giúp tế bào phân chia, biệt hóa thành mơ, quan, tăng trưởng thành hồn thiện Những kỹ thuật dùng để nuôi cấy tế bào, mô hay quan thực vật điều kiện vô trùng - Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô thuật ngữ miêu tả cách thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm môi trường điều kiện vô trùng Mơi trường ống nghiệm có chứa thành phần dinh dưỡng muối khoáng, vitamin, hormone sinh trưởng đường Cơng cụ dùng q trình ni cấy mô tế bào thực vật Để nuôi mô tế bào thực vật địi hỏi phải có phịng ni cấy với điều kiện môi trường vô trùng vài điều kiện thiết yếu theo giống giống khác Phịng ni cấy mơ cần có tủ cấy vài dụng cụ thủy tinh như: Ống đong, pipet, bình tam giác, cốc thí nghiệm, ống nghiệm, lọ thủy tinh, phễu, bình đun mơi trường Cơng cụ sử dụng ni cấy gồm có: Dao, kéo, phanh, đĩa cấy, … Hết thảy làm từ thép không gỉ, chiều dài tùy vào độ dài bình ống nghiệm nuôi cấy Những công cụ khử trùng nồi hấp tiệt trùng hay đốt nóng kỹ trước lúc sử dụng Mọi công cụ dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật phải đảm bảo đạt tiêu chuẩn, có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng Những bước, quy trình ni cấy mơ tế bào thực vật Chọn lựa khử trùng mẫu cấy Chọn mẹ đạt chuẩn giống để làm nguyên liệu nhân giống Chú ý chọn mẹ có phẩm chất vượt trội, bệnh hết nên chọn trồng nhà kính hay trồng theo tiêu chuẩn đặc biệt Thời điểm chọn mẫu cấy: Lấy vào giai đoạn tăng trưởng mạnh mẹ Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy môi trường đặc biệt để tạo thể nhân giống in vitro Gồm hai thể nhân giống in vitro: Thể chồi, thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro theo đặc điểm nhân giống tự nhiên trồng Nhân giống in vitro Nhân giống mẫu cấy từ thể chồi Môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi, nồng độ chất tăng trưởng giảm thấp để phù hợp cho trình nhân giống kéo dài Cây nhân giống in vitro có tình trạng sinh lý trẻ trì thời gian vơ hạn Tái sinh hồn chỉnh in vitro Cây giống cấy mô nuôi dưỡng tăng trưởng ống nghiệm lúc đủ tiêu chuẩn kích thước đặc tính để tăng trưởng tốt điều kiện tự nhiên Chuyển in vitro sang vườn ươm Cây cấy mô đạt yêu cầu chiều cao, rễ phát triển hoàn chỉnh đưa dưỡng nhà lưới nhằm thích nghi với mơi trường tự nhiên ... có chồi nách Chồi nách thực chất có cấu tạo khơng khác đỉnh sinh trưởng thân Q trình tổng hợp DNA virus thực vật không xảy đỉnh sinh trưởng số chế không rõ Nên mô đỉnh sinh trưởng mô virus nhiễm... quan thực vật điều kiện vô trùng - Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô thuật ngữ miêu tả cách thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm môi trường điều kiện... từ thép không gỉ, chiều dài tùy vào độ dài bình ống nghiệm ni cấy Những công cụ khử trùng nồi hấp tiệt trùng hay đốt nóng kỹ trước lúc sử dụng Mọi công cụ dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật phải