MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT GVHD: Trần Thị Dung SVTH: Nguyễn Thị Hoàng Yến 61103239 Nguyễn Văn Cư 61103020 Huỳnh Thị Mai Thy 61103315 Mục lục:  I Giới thiệu phương pháp Southern blot  II Nguyên lý nguyên tắc • 1.Nguyên lý • 2.Ngun tắc  III Tạo mẫu dị • 1.Tạo mẫu dị nhờ Plasmid • 2.Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR • 3.Đánh dấu Probe  IV Quy trình phương pháp Southern Blot • 1.Giai đoạn • 2.Giai đoạn • 3.Giai đoạn  V Ứng dụng I Giới thiệu phương pháp Southern blot Phương pháp lai Southern blot phương pháp lai DNA tế bào với mẫu dò DNA Phương pháp cho phép nghiên cứu DNA gen, kiểm tra kết chuyển gen kiểm tra có mặt gen gen tế bào Southern blot - kĩ thuật chủ yếu việc phân tích cấu trúc gene, phát triển vào thập niên 1970 Edwin Southern MRC phân genome động vật hữu nhũ Edinburgh (Southern, 1975) Edwin Southern Phương pháp Southern Blot triển khai nhờ số kỹ thuật tảng công nghệ sinh học phân tử như: Tách chiết gen PCR Thẩm tích phân tử acid nucleotide lên màng lai Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu) … Đến nay, kỹ thuật lai Southern cải tiến nhiều, chủ yếu bao gồm: Tăng độ nhạy Giảm số bước trình lai Giảm thời gian thực Vẽ kĩ thuật ngày đơn giản nhiều II Nguyên lý Nguyên tắc Nguyên lý Dựa vào nguyên tắc bổ sung cặp Màng lai Dựa nguyên nucleotide: A-T, nitrocellulose tắc biến tính G-C ( đoạn hay nylon có khả hồi tính phân polynucleotide tiếp nhận tử DNA mạch đơn có DNA trình tự bổ sung) Ngun tắc Địi hỏi Phản ứng lai đọan DNA cần nhiệt độ (RNA) biết cao hóa trình tự để chất gây biến làm mồi tính DNA “Probe”, Probe ( NaOH, đánh Formandehyt) dấu Các vật liệu, trang thiết bị máy móc xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR III Tạo mẫu dò (probe) Tạo mẫu dò nhờ Plasmid Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR  Cắt plasmid DNA  Thiết lập mồi đánh tách chiết từ tế bào dấu phóng xạ vào loại enzyme mồi  Gắn DNA vào plasmid  Biến tính mẫu DNA điều kiện mơi thành sợi đơn  Gắn mồi vào sợi trường phù hợp  Thực biến nạp vào đơn  Tổng hợp sợi DNA tề bào vi khuẩn  Nhân tế bào vi kuẩn  Biến tính để tách chọn lọc  Tách plasmid từ tế bào chuỗi vừa tổng hợp chọn lọc thành sợi đơn  Tách mẫu dò (đoạn DNA)  tiếp tục quay gắn mồi  Đánh dấu mẫu dò vào sợi đơn Đánh dấu mẫu dị Gồm có phương pháp: Phương pháp Nick-translation Phương pháp random priming Phương pháp đánh dấu oligonucleotide Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe) Phương pháp Nick-translation  DNAse I tạo khía DNA nhiều vị trí ngẫu nhiên khác  DNA polymerase với hoạt tính exonuclease 5’-3’, cắt mạch DNA theo chiều 5’-3’ theo khía tạo sẵn, đồng thời, tổng hợp bù đoạn thiếu với tham gia nucleotide đánh dấu (thường dATP)  Kết DNA đánh dấu 2 Phương pháp random priming  DNA kép biến tính nhiệt thành mạch đơn  Hỗn hợp oligonucleotide tổng hợp thêm vào, trở thành mồi (primer) cho DNA polymerase tổng hợp mạch bổ sung  Một loại nucleotide bổ sung vào đánh dấu, nên mạch tổng hợp đánh dấu Phương pháp đánh dấu oligonucleotide Các oligonucleotide tổng hợp dạng mạch đơn đánh dấu đầu 5’ nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase với diện nucleotide đánh dấu Sau phản ứng nuclotide tự loại bỏ sắc kí lọc gel, sắc kí lỏng cao áp (HPLC),… Phương pháp tạo mẫu dị RNA (riboprobe)  Trước hết, trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải đưa vào vector có mang promoter  Vector cắt thành dạng mạch thẳng; sau đó, RNA polymerase thích hợp thêm vào phản ứng với nucleotide đánh dấu  RNA polymerase phiên mã trình tự DNA promoter, tạo lượng lớn RNA đánh dấu  Sau phản ứng, vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I phân hủy, enzyme loại bỏ qua tách chiết phenol RNA tinh sắc kí lọc gel IV Quy trình phương pháp Southern blot Giai đoạn •• Tách chiết làm biến tính DNA thành sợi đơn Giai đoạn •• Chuyển DNA từ gel agarose lên lai (nylon nitrocellulose) Giai đoạn • Lai với mẫu dị kiểm tra kỹ thuật phóng xạ tự ghi Giai đoạn Tách chiết DNA cần nghiên cứu DNA cắt enzyme giới hạn (RE) thành đoạn kích thước khác Sản phẩm cắt điện di gel agarose DNA kép xử lý với kiềm (NaOH 0.4M), biến tính thành DNA mạch đơn gel • Kiềm giúp cho cực âm gốc thymine DNA gắn kết với cực dương gốc amino có màng, biến tính DNA mạch kép thành DNA mạch đơn, đồng thời, loại tất RNA cịn sót lại • Chỉ có DNA đơn chuyển lên màng lai Giai đoạn Chuyển DNA vừa biến tính lên màng lai (màng nylon nitrocellulose) Nguyên tắc trình: Là mao dẫn dung mơi (thường NaOH/NaCl)qua lớp gel từ nơi nước cao sang nơi nước thấp, mang theo DNA đính lên màng lai xếp lớp gel Quá trình diễn vài dùng thiết bị thấm hút chân khơng Tương tác ion màng lai (tích điện dương) DNA (tích điện âm) tạo lực hút, gắn kết DNA lên màng lai Trong q trình chuyển, vị trí DNA khơng thay đổi Màng lai sau q trình trên, xử lý nhiệt (800 giờ) chiếu tia UV (vài phút) để cố định DNA màng Cách tiến hành:  Đặt gel lên giá chuyển máy Bloting để chuyển nguyên vẹn sợi DNA biến tính  Dung dịch dẫn chuyển NaOH 0.4M  Màng lai giữ cố dịnh đoạn DNA chuyển lên từ gel điện li Giai đoạn Lai DNA cố định màng lai với mẫu dị (probe) có đánh dấu phóng xạ (32P), biotin mẫu dị phát quang sinh học Q trình dựa nguyên tắc bổ sung probe với DNA cố định Cuối cùng, nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi (đối với probe đánh dấu phóng xạ), phương pháp so màu (với probe đánh dấu biotin) hay dựa vào phát quang (với probe phát quang sinh học) để định vị DNA-probe Sau trình lai, màng lai rửa để loại probe không bắt cặp chuyên biệt với DNA màng IV Ứng dụng  Southern blot sử dụng để đánh giá copy gen genome, xác định intron, exon, đoạn bị đột biến thêm đoạn…  Khi sử dụng DNA marker khác làm mẫu dò, phân biệt lồi, lồi đồng hình  Southern blot – RFLP : giúp phát đa dạng chiều dài đoạn cắt RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền vị trí nhận biết RE dẫ đến sai biệt chiều dài đoạn DNA tạo từ RE Địng thời RFLP cịn sử dụng để xác định huyết thống, lập đồ giới hạn gene  Truy tìm tội phạm dựa vào dấu vết trường  Chuẩn đoán bệnh thai nhi Tài liệu tham khảo: • Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương • www.Wikipedia.org THE END THANKS FOR WATCHING ! ... gen tế bào Southern blot - kĩ thuật chủ yếu việc phân tích cấu trúc gene, phát triển vào thập niên 1970 Edwin Southern MRC phân genome động vật hữu nhũ Edinburgh (Southern, 1975) Edwin Southern. .. IV Quy trình phương pháp Southern Blot • 1.Giai đoạn • 2.Giai đoạn • 3.Giai đoạn  V Ứng dụng I Giới thiệu phương pháp Southern blot Phương pháp lai Southern blot phương pháp lai DNA tế bào với... dụng  Southern blot sử dụng để đánh giá copy gen genome, xác định intron, exon, đoạn bị đột biến thêm đoạn…  Khi sử dụng DNA marker khác làm mẫu dị, phân biệt lồi, lồi đồng hình  Southern blot