Khía cạnh khoa học trong nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh của cây trồng
Khía cạnh khoa học nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh trồng Phạm Văn Kim Bộ môn bảo vệ thực vật Trường Đại học Cần Thơ Tóm tắt Các nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh trồng dựa hiểu biết chế kháng bệnh thực vật chế kháng bệnh thực vật xếp vào hai nhóm: nhóm chế sinh hố nhóm chế cấu trúc mơ học nhóm chế sinh hóa học bao gồm tiết protein có liên quan đến bệnh cây, có 12 chất biết tên pr-1, pr-2, (β-1,3-glucanase), pr-3 (chitinase), pr-4, pr-5, pr-8, pr-11, protein bất hoạt ribosom (ribosome inactivating protein), protein chuyển hoá chất béo nstps (lipid transfer protein), amps (hevein-type), thionis plant defensins, enzim có liên quan đến kháng bệnh thực vật pal (phenylalanine ammonia lyase), peroxidase catalase nhóm chế cấu trúc mô học bao gồm phản ứng lignin hoá vách tế bào bị xâm nhiễm, hình thành papillae bên đĩa áp nấm gây bệnh, tế bào tích tụ polyphenol, h2o2 nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh thực vật tiến hành theo bước: tìm tác nhân kích thích tính kháng bệnh cây, đánh giá hiệu kích thích tính kháng bệnh tác nhân tìm hiểu chế kháng bệnh tác nhân gợi giống nhiễm bệnh bị mầm bệnh độc công bước tìm tác nhân đánh giá hiệu kích thích tính kháng bệnh thực nhà lưới đánh giá theo định lượng với thang điểm nghiên cứu từ trước bước nghiên cứu chế kháng bệnh tác nhân kích kháng gợi mơ giống nhiễm bệnh kích thích tính kháng tạo bị mầm bệnh công, thực phịng thí nghiệm sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để phát chế kháng bệnh mặt cấu trúc mô học sử dụng máy đo quang phổ để phát chế kháng bệnh cấu trúc mô học sử dụng máy đo quang phổ để phát gia tăng hoạt tính enzim β1,3-glucanase, chitinase, pal, peroxidase catalase mở đầu động vật cao cấp, miễn dịch thể mức mô học mức tế bào hiểu biết tường tận ứng dụng cách có hiệu phòng ngừa trị bệnh quan trọng người gia súc qua ứng dụng hiểu biết ngăn chặn phát triển loại trừ số loại dịch hạch, dịch bệnh đậu mùa… thực vật, hệ miễn dịch thể cách khác động vật khó nhận nên việc ứng dụng vào sản xuất nơng nghiệp cịn hạn chế loại trồng, thường quan tâm đến việc sử dụng giống kháng bệnh để đối phó với dịch bệnh loại thường nhắc đến gen kháng bệnh công cụ quan trọng chọn lọc giống để đưa sản xuất, để đối phó với dịch bệnh quan trọng nhiên có trường hợp giống bị nhiễm bệnh lại có đặc tính khác ưu việt mà loại bỏ ứng dụng kiến thức biết hệ miễn dịch thực vật để tìm biện pháp cải thiện tính nhiễm bệnh chúng để sử dụng giống có đặc tính ưu việt hay khơng? kiến thức nhân loại cho thấy bên cạnh kháng bệnh tự nhiên số giống cây, giống nhiễm bệnh kích thích để có khả kháng với bệnh kiện gọi tên kích thích tính kháng bệnh (induced resistance) thực vật kháng bệnh thực vật kích thích tính kháng bệnh trồng đến kiến thức nhân loại tiến sâu vào lĩnh vực miễn dịch thực vật bệnh bên cạnh việc tiến sâu vào khía cạnh phân tử gen khánh bệnh, nhà khoa học sâu dần vào chế kháng bệnh báo đề cập đến số chế kháng bệnh thực vật có liên quan đến chun đề kích thích tính kháng bệnh chế kháng bệnh thực vật phân hai nhóm: nhóm chế thuộc sinh hố học nhóm chế thuộc cấu trúc mô học 2.1 chế kháng bệnh thuộc sinh hoá học sau bị vi sinh vật công để gây bệnh, nơi bị xâm nhiễm tiết loạt hợp chất chống vi sinh vật (antimicrobial compounds), cac protein liên quan đến bệnh (pathogenesis related protein), enzim để làm giảm hoạt động mầm bệnh nhiều chất khác hợp chất chống vi sinh vật chia hai nhóm, nhóm phytoanticipins nhóm phytoaleuxins phytoaleuxins ký chủ tiếu để chống lại với mầm bệnh, phytoanticipins ký chủ trực tiếp tiết mà tương tác chất ký sinh ký chủ tạo (mansfied, 2001) hai nhóm chất tìm thấy giống có tính kháng bệnh cao bên cạnh tác giả phát loạt protein có liên quan đến bệnh tế bào tiết cac protein có vai trị làm giảm phát triển mầm bệnh tác động lên vách tế bào, màng nguyên sinh chất lên ribosom sinh vật protein xếp vào 18 họ protein 12 họ biết đến với tên pr-1, pr-2, pr-3, pr-4, pr-5, pr-8, pr-11, protein bất hoạt ribosom (ribosome inactivating protein), protein chuyển hoá chất béo nsltps (lipis transfer proteins), amps (hevein – type), thionins, plant defensins… vai trị protein tóm lược sau: pr-2 (β-1,3-glucanase) có vai trị phân huỷ thành phần β-1,3glucan β-1,6-glucan vách tế bào vi sinh vật (van loon, 2001) hai nhóm ezim β-1,3glucanase chitinase có tác động hỗ trợ làm tăng hiệu phân huỷ vách tế bào mầm bệnh (broekaert ctv., 2001; schlumbaum ctv., 1986 mauch ctv., 1998) hình cho thấy cách tác động 12 họ protein chống vi sinh vật kể hình sơ đồ tác động protein chống vi sinh vật lên nấm gây bệnh (broekaert ctv., 2001) bên cạnh loạt enzim khác hình thành tế bào bị mầm bệnh xâm nhiễm với vai trị chuyển hố chất độc mầm bệnh tiết trung hoà độc tính chất tế bào tiết phản ứng lại mầm bệnh, chất nồng độ cao gây hại cho tế bào phạm vi này, kế hai enzim có liên quan đến bệnh pal (phenylalanine ammonia lyase), peroxidase, catalase…pal có vai trị thúc đẩy sinh tổng hợp hợp chất polyphenol, chất quan trọng chống bệnh trồng (lawton ctv., 1980) cịn peroxidase có nhiều vai trị có vai trị khử h2o2 vai trị phối hợp với pal việc giúp lignin hoá vách tế bào bị cơng qua ngăn cản học lan xa nấm gây bệnh (legrand ctv., 1976) h2o2 tích tụ tế bào với nhiệm vụ oxyd hoá chất độc nấm tiết ra, oxyd hố polyphenol làm cho polyphenol khơng độc tế bào, h 2o2 với nồng độ độc cao lại gây hại cho tế bào peroxidaz làm giảm bớt tính độc h2o2 tế bào ký chủ bên cạnh phát gia tăng hoạt tính enzim, tác giả cịn nghiên cứu xuất tín hiệu kích kháng gợi lên tín hiệu bao gồm: salicylic acid, jasmonic acid etylen 2.2 chế kháng bệnh cấu trúc mô học moerschbacher mendgen (2001) tổng kết cho thấy có chế kháng bệnh mặt mô học, tuỳ thuộc vào cách xâm nhập nấm gây bệnh (hình 2) hình sơ đồ mơ tả cách chống lại xâm nhiễm nấm gây bệnh thực vật (vẽ theo moerschbacher mendgen, 2001) 1) tạo lớp vách tế bào chung quanh vết thương để bao vây ngăn cản xâm nhập nấm yếu, xâm nhập qua vết thương 2) rắn hoá vách tế bào cách lignin hoá vách tế bào bị nấm xâm niễm 3) hình thành papillae (vách dầy) bên đĩa áp (appressorium) để ngăn cản xâm nhập nâm gây bệnh 4) tích tụ hợp chất phenol đưa đến phản ứng tự chết tế bào để cô lập nấm gây bệnh phản ứng kháng bệnh mức cao thực vật bốn phản ứng tự vệ quan sát qua kính hiển vi quang học (moerschbacher mendgen, 2001) phản ứng lignin hoá vách tế bào tác động pal peroxidase, nhận thấy qua kính hiển vi huỳnh quang dạng vách tế bào phát huỳnh quang hình thành papillae quan sát kính hiển vi huỳnh quang (trần thị thu thuỷ ctv., 2004) tích tụ h2o2 polyphenol tế bào ký chủ cúng quan sát qua kính hiển vi quang học với phương pháp nhuộm thích hợp (trần thị thu thuỷ ctv., 2004) phản ứng công mầm bệnh cịn phức tạp phản ứng cịn có mối tương tác hỗ trợ lẫn để tạo hiệu chống bệnh cao giống kháng bệnh, bị mầm bệnh công, tế bào phản ứng tức với nhiều chế, nhiên bị mấm bệnh công, chế hoạt hố chem nên khơng đủ sức chống lại công mầm bệnh nên bị nhiễm bệnh ức chế mức phân tử nên chế không phát huy kịp thời kích thích để giải thoát cức chế trước bị nhiễm bệnh, chế kích hoạt kịp thời giúp chống với mầm bệnh trở nên kháng với bệnh, mức độ định, tuỳ thuộc vào chế kháng mà giống có kích thích tính kháng bệnh trồng tuỳ thuộc vào giống có sẵn chế kháng bệnh nào, hiệu kích thích tính kháng bệnh mức cao mức vừa có chế hình thành papillae kích thích tính kháng bệnh giúp giảm số vết bệnh (do papillae ngăn cản bớt xâm nhập nấm bệnh) khơng có phản ứng hình thành papillae, kết số vết bệnh kích kháng tương đương khơng kích kháng nhiên diện tích vết bệnh nhỏ vết bệnh khơng kích kháng phản ứng tự vệ bên tế bào bị xâm nhiễm hình thành, lignin hoá vách tế bào giúp vách tế bào rắn làm cho mầm bệnh lan chung quanh khó khăn hơn, gia tăng hoạt tính enzim β-1,3-glucanase, chitinase, pal, peroxidase tích tụ polyphenol… làm ngăn trở phát triển mầm bệnh, chí giết chết dần mịn mầm bệnh trường hợp có phản ứng kháng vừa phần sau xin gọi tắt cụm từ “kích thích tính kháng bệnh” “kích kháng” để tìm giải pháp kích kháng cho giống nhiễm với bệnh, trình nghiên cứu cần qua bước sau: - tìm tác nhân gây kích kháng thích hợp - đánh giá khả kích kháng tác nhân nghiên cứu xác nhận kích kháng tác nhân thông qua chế kháng bệnh thể sau kích kháng bị mầm bệnh cơng q trình nghiên cứu chế kích kháng thực theo hai cách: quan sát chế kháng bệnh qua kính hiển vi (cơ chế kháng cấu trúc mơ học) phân tích gia tăng hoạt tính enzim có liên quan đến kháng bệnh (cơ chế kháng sinh hoá học) tìm đánh giá khả kích kháng tác nhân gây kích kháng thiên nhiên có nhiều tác nhân gây kích kháng cho giống nhiễm bệnh loại trồng thông thường, mầm bệnh thuộc chủng yếu giống ấy, thường tạo phản ứng kích kháng (fink ctv., 1990) nhiều tác giả sử dụng nghiên cứu kích kháng nhiên tác nhân dùng để nghiên cứu, khơng thể áp dụng được, chủng mầm bệnh trở nên độc giống khác có ngồi sản xuất thực tế, việc tìm tác nhân kích khángthường đặt mục tiêu vi sinh vật không gây hại cho laọi trồng không độc hại cho môi trường thí dụ, nghiên cứu tìm tác nhân kích kháng chống bệnh đạo ôn (pyricularia grisea) lúa, trần vũ phến ctv (2003) tìm chủng nấm colletotrichum sp (đến chủng nấm xác định sporothrix sp.) gây kích kháng tốt chủng nấm gây bệnh cho cỏ lồng vực ruộng lúa, không ký sinh lúa loại trồng khác lăng cảnh phú phạm văn kim (2002) tìm chủng vi khuẩn flavimonas oryzihabitans, tác nhân gây kích kháng giúp lúa kháng vừa với bệnh đạo ôn bên cạnh vi sinh vật, chất trích từ số lồi thực vật gây kích kháng cho trồng phạm văn kim ctv (2003) báo cáo chất trích từ năm loại thực vậtcó khả kích kháng bệnh đạo ơn lúa hố chất khơng phải thuốc bảo vệ thực vật nguồn cung cấp tác nhân kích kháng quan trọng cho nhà nghiên cứu phạm văn kim ctv (2004) phát 10 hố chất có khả kích kháng giúp giống lúa nhiễm bệnh kháng với bệnh đạo ôn mức độ khác mặt thể hiệu kích kháng phân kích kháng chỗ (localized induced resistance) kích kháng lưu dẫn (systemic acquired resistance) kích kháng chỗ kích kháng gợi tính kháng bệnh nơi kích thích, cịn phần khác khơng có hiệu kích kháng lưư dẫn kích thích tác động lên một phận phận khác nhận hiệu kháng bệnh thực tế, kích kháng lưu dẫn hữu ích kích kháng chỗ quan tâm nghiên cứu nhiều để phát tác nhân có khả gây kích kháng, nghiên cứu cần chọn giống chủng mầm bệnh thích hợp (giống nhiễm với chủng mầm bệnh sử dụng thí nghiệm) bố trí điều kiện nhiệt độ ẩm độ hồn tồn thích hợp với phát triển mầm bệnh, thí nghiệm bón phân đạm với mức thích hợp cho lây bệnh nhân tạo trồng kích kháng vài phát triển đầy đủ sau vài ngày, tiêm chủng nhân tạo vơí mầm bệnh tương ứng tất đưa vào điều kiện tối hảo để ủ bệnh bệnh đánh giá khơng kích kháng cách cẩn thận theo thang đánh giá nghiên cứu trước để có số liệu xác thí nghiệm cần có nghiệm thức là: giống kháng không kích kháng, giống nhiễm khơng kích kháng giống nhiễm có kích kháng số liệu sau phân tích thống kê cho biết hiệu kích kháng tác nhân kích kháng tương ứng nghiên cứu tìm hiểu chế kích kháng có hai hướng nghiên cứu tìm hiểu chế kích kháng: - quan sát thay đổi mô nơi bị mầm bệnh xâm nhiễm - tìm hiểu tăng hoạt tính enzim có liên quan đến kháng bệnh mơ kích kháng 4.1 quan sát thay đổi mô để đánh giá hiệu kích kháng thí nghiệm bố trí với lần lặp lại nghiệm thức: đối chứng kháng (giống kháng bệnh khơng kích kháng), đối chứng nhiễm (giống nhiễm bệnh khơng kích kháng) giống nhiễm bệnh có kích kháng sau kích kháng lây bệnh nhan tạo lấy mẫu để quan sát vào nhiều thời điểm tuỳ laọi loại bệnh mẫu định hình tẩy diệp lục tố, sau có khơng nhuộm màu theo nhu cầu quan sát trực tiếp qua kính hiển vi quang học thích hợp cho mục đích để khảo sát tăng cường lignin hoá vách tế bào, nơi bị mầm bệnh xâm nhiễm, số tế bào có vách phát sáng đém kính hiển vi huỳnh quang so sánh số liệu nghiệm thức giống nhiễm có kích kháng, giống nhiễm khơng kích kháng giống kháng khơng kích kháng giúp thấy chế tăng cường lignin hố kích kháng gợi qua kính hiển vi huỳnh quang, papillae hình thành nơi bị đĩa áp nấm xâm nhiễm cúng phát sáng phát để khảo sat tích tụ polyphenol tế bào bị xâm nhiễm, mẫu nhuộm màu với toluidine blue o quan sát kính hiển vi quang học tế bào có tích tụ polyphenol có màu xanh lá, từ nhạt đến sậm để khảo sát tích tụ h2o2, mẫu nhuộm với dab (3,3’ – diaminobenzidine) trước tẩy diệp lục tố quan sát kính hiển vi quang học tế bào có tích tụ h 2o2 ngả màu nâu đỏ, từ nhật đến sậm gia tăng tế bào có chế so với đối chứng nhiễm khơng kích kháng chứng tỏ tác nhân nghiên cứu có tạo chế kháng bệnh kích kháng 4.2 nghiên cứu gia tăng hoạt tính enzym có liên quan đến kích kháng loạt enzym, tế bào kích kháng tiết tế bào bị mầm bệnh xâm nhiễm, phân tích phát thí nghiệm bố trí với nghiệm thức đối chứng kháng (giống kháng khơng kích kháng), đối chứng nhiễm (giống nhiễm khơng kích kháng) giống nhiễm có kích kháng sau cơng bệnh cách lây bệnh nhân tạo, thí nghiệm thu thập lần từ 72 sau lây bệnh nhân tạo thời gian thu mẫu dàu tuỳ thuộc vào loại mầm bệnh, loại thí nghiệm loại enzym cần phân tích dịch trích mẫu thí nghiệm đo độ quang truyền dịch trích so sánh với enzym tinh dòng chuẩn, với máy đo quang phổ (spectrophotometer) loại enzym thường quan tâm pal (phenylalanine ammonia lyase), β-1,3glucanase, chitinase, peroxidase catalase loại enzym có vai trị quan trọng kháng bệnh trồng hiệu số độ quang truyền so với enzym chuẩn, nghiệm thức có kích kháng thời điểm, so sánh với hệ số quang truyền thời điểm tương ưng đối chứng kháng đối chứng nhiễm gia tăng hoạt tính enzym, cao đối chứng nhiễm (khơng kích kháng) phát vào vài thời điểm giúp xác nhận hiệu kích kháng tác nhận có tạo hiệu gia tăng hoạt tính nhiều laọi enzym kể so với đối chứng nhiễm khơng kích kháng xem có hiệu kích thích trồng tương ứng kháng với bệnh nghiên cứu kết chứng minh tác nhân nghiên cứu có tạo chế kháng bệnh giống nhiễm bệnh, tức đích thực tác nhân gây kích kháng kết luận việc tìm tác nhân kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn trồng đối phó với loại bệnh q trình nghiên cứu lâu dài, nghiêm túc có sở khoa học giới việc nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh trồng tiến hành từ lâu, việt nam bắt đầu gần nên thiếu kinh nghiệm cần tiếp tục học hỏi thêm dù nghiêm túc việc nghiên cứu để kết đạt có giá trị khoa học ứng dụng sản xuất nơng nghiệp kích thích tính kháng bệnh đạo ơn hại lúa khía cạnh mơ học trần thị thu thuỷ huỳnh minh châu, phạm văn kim, h j lyngs jorgensen and e de neergaard đặt vấn đề bệnh đạo ôn nấm pyricularia grisea (cooke) sacc gây (giai đoạn hữu tính magnaporth grisea), bệnh quan trọng lúa đồng sông củu long (đbscl) hai biện pháp để đối phó với bệnh sử dụng giống kháng thuốc hoá học biện pháp hoá học cho kết nhanh ảnh hưởng đến mơi trường, cịn sử dụng giống kháng an tồn đơi khơng thành cơng thay đổi nhanh nịi nấm gây bệnh (noda ctv, 1998) đó, để hạn chế việc sử dụng thuốc cần phải kết hợp với kỹ thuật “kích thích tính kháng lưu dẫn cây” kỹ thuật sử dụng loại vi sinh vật khơng gây hại cho mơi trường loại hố chất khơng có tác dụng diệt vi sinh vật gây bệnh không gây nhiễm mơi trường có tác dụng kích thích trồng tạo tính kháng bệnh kỹ thuật ngiên cứu ứng dụng thành công giới số loại trồng dưa leo, cà chua, lúa mạch lúa (hammerschmidt at al., 1995; ozeretskovskaya, 1995; jorgensen et al., 1998; manandhar et al., 1998) kích thích tính kháng bệnh trồng (gọi tắt kích kháng) mơn bảo vệ thực vật, trường đại học cần thơ hợp tác với môn sinh học thực vật, trường đại học nông nghiệp thú y hoàng gia, đan mạch nghiên cứu từ năm 1998 đến 2006 để quản lý bệnh đạo ôn hại lúa đbscl (phạm văn kim ctv., 2003) kết nghên cứu tìm lồi vi sinh vật có khả kích thích tính kháng bệnh đạo ôn hại lúa vi khuẩn flavimonas oryzihabitans (lăng cảnh phú, 2000), nấm colletotrichum sp (trần vũ phến ctv., 2003) nhiều loại hố chất khơng độc hại môi trường salicylic acid, benzoic acid, clorua đồng,… (diệp đông tùng, 2000; trịnh ngọc thuý, 2000, phạm văn dư ctv., 2003, phạm văn kim ctv., 2003) để hiểu sâu chế kích kháng số hoá chất, nhiều thống số tác giả sử dụng để đánh giá hiệu chất kích kháng khía cạnh mơ học bao gồm phát sáng tế bào quan sát kính hiển vi huỳnh quang, tổng hợp chất polyphenol h2o2 tế bào phương pháp quan sát phát phản ứng rtế bào có xâm nhiễm mầm bệnh phát sáng tế bào kính hiển vi huỳnh quang có nhiều dang phát sáng cấu trúc phát sáng thành lập đĩa áp (appressorium) gọi fluorescent papillae (fp), vị trí thời điểm xuất fp dùng để xác định vị trí xâm nhiễm (penetration site) thời điểm xâm nhiễm nấm fp hợp chất bao gồm lignin, callose phenol tạo để chống lại xâm nhiễm nấm bệnh cờu trúc fp tìm thấy lúa bị xâm nhiễm nấm piricularia grisea với tần suất thấp ( 60% xem giống có tính kháng ổn định tốt giống kháng tốt ir 72870 om 3968 – – giống nhiễm nhẹ mtl 384, mtl 389, om 3539, om 3428 om 3419 số giống chủ lực tỉnh nên giảm bớt tối đa giống trường hợp số giống > giống, khơng có giống chủ lực chiếm > 15% diện tích gieo trồng vùng để tránh áp lực bệnh mạnh trồng giống nhiễm tạo điều kiện cho quần thể ấm bệnh thay đổi trồng giống kháng 27 ... việc tìm tác nhân kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn trồng đối phó với loại bệnh trình nghiên cứu lâu dài, nghiêm túc có sở khoa học giới việc nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh trồng tiến hành... kích kháng thích hợp - đánh giá khả kích kháng tác nhân nghiên cứu xác nhận kích kháng tác nhân thơng qua chế kháng bệnh thể sau kích kháng bị mầm bệnh cơng q trình nghiên cứu chế kích kháng. .. cơng trình nghiên cứu khả kích kháng hố chất khía cạnh mơ học quan sát từ năm 2000 – 2005 phương pháp nghiên cứu hố chất khảo sát khả kích thích tính kháng bệnh đạo ơn khía cạnh mơ học bao gồm