Tìm hiểu hoạt tính enzim proteaza ở vi khuẩn bacillus subtilis

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC ===  === TÌM HIỂU HOẠT TÍNH CỦA ENZIM PTOTEZA Ở VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Dương Tuệ Sinh viên thực : Phan Thị Huyền VINH - 2011 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực đề tài, tơi nhận giúp đỡ quý báu, bảo tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn Dương Tuệ, người thầy ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo tổ môn di truyền – vi sinh – phương pháp giảng dạy, giáo viên phụ trách, kĩ thuật viên phịng thí nghiệm tạo điều kiện sở vật chất hướng dẫn giúp đỡ đóng góp ý kiến cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin cảm ơn gia đình bạn bè ln hỗ trỡ, giúp đỡ cho tinh thần, vật chất lẫn cơng sức tơi hồn thành tốt để tài Trong trình thực đề tài, thời gian kinh nghiệm hạn chế nên đề tài khơng tránh khỏi thiếu sót nội dung hình thức, mong nhận góp ý thầy, cô giáo, bạn bè để đề tài hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Vinh, tháng năm 2011 sinh viên Phan Thị Huyền Mục lục Mở đầu I Đặt vấn đề II Mục tiêu III Nhiệm vụ Chƣơng I: Tổng quan tài liệu 1.1 Cở sở khoa học 1.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis: 1.1.2 Tổng quan enzim 1.1.3 Các chế phẩm enzim 1.1.4 Các enzim vi sinh vật, sinh tổng hợp phương pháp 1.1.5 Enzim proteaza vi sinh vật 11 1.1.6 Sự phân giải protein 12 1.1.7 Đặc tính ứng dụng proteaza 13 1.2 Tình hình nghiên cứu nước giới 15 1.2.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn enzim proteaza nước 15 1.2.2 Tình hình nghiên cứu giới 16 Chƣơng II: Đối tƣợng thời gian phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 20 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp thu xử lý bảo quản mẫu 20 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn 21 2.2.3 Phương pháp phân loại vi khuẩn 22 2.2.4 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn môi trường tăng sinh 22 2.2.5 Phương pháp xá định số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 24 2.2.6 Phương pháp xác đinh tốc độ tăng trưởng theo Black man 26 2.2.7 Phương pháp quan sát tế bào 26 2.2.8 Phương pháp nghiên cứu yêu tố 26 2.2.9 Phương pháp xác đinh yếu tố 27 2.2.10 Phương pháp xác đinh hoạt tính 28 2.2.11 Phương pháp phân lập 29 Chƣơng III: Kết nghiên cứu 3.1 Đặc điểm chung vi khuẩn 30 3.1.1 Phân loại 30 3.1.2 Hình thái 30 3.2 Số lượng, vi khuẩn Bacillus subtilis 31 3.3 Kết nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng 32 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 32 3.3.2 Ảnh hưởng độ ẩm 35 3.3.3 Ảnh hưởng PH 37 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố đến hoạt tính enzim 40 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 40 3.4.2 Ảnh hưởng độ ẩm 43 3.4.3 Ảnh gưởng PH 45 3.5 Ảnh hưởng mật độ đến hoạt tính enzim 48 3.6 Xây dựng quy trình thu nhận làm enzim 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: Kết luận 53 Kiến nghị 53 Tài liệu tham khảo 54 MỞ ĐẦU I: ĐẶT VẤN ĐỀ Enzim chất xúc tác sinh học ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực công nghiệp kinh tế quốc dân như: Cơng nghiệp thực phẩm, y học, hóa phân tích… Người ta thu nhận enzim từ nhiều nguồn khác từ động vật, thực vật, vi sinh vật Tuy nhiên enzim lấy từ động vật, thực vật không ưu enzim vi sinh vật hoạt tính thấp, xúc tác không đa dạng, không chủ động điều khiển để thu nhận enzim Vì khơng thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn chế phẩm enzim thõa mãn nhu cầu đời sống Như vậy, nguồn nguyên liệu sinh học vi sinh vật nguồn nguyên liệu dồi hứa hẹn khắc phục hạn chế trên, thực tế chứng tỏ ưu việt nguồn nguyên liệu vi sinh vật (hóa sinh công nghiệp - Lê Ngọc Tú, 2005) - Vi sinh vật nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzim - Hệ enzim vi sinh vật vơ phong phú đa dạng - Hệ enzim vi sinh vật có hoạt tính mạnh - Thu enzim từ vi sinh vật có khả tăng cường sinh tổng hợp enzim nhờ chọn giống tạo biến chủng có hoạt lực cao - Việc nuôi vi sinh vật dễ dàng Từ ta thấy việc tách chiết enzim từ vi sinh vật thuận lợi có ý nghĩa lớn Mà vi sinh vật có khả cho khối lượng enzim lớn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, có enzim proteaza Proteaza enzim có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác nhau, công nghiệp chế biến thịt, công nghiệp sữa, sản xuất tơ tằm, y học… có đóng góp to lớn đời sống người Hiện giới việc nghiên cứu, thu nhận enzim proteaza từ vi sinh vật phát triển, tìm tịi nghiên cứu khả ứng dụng vơ vàn enzim protein Cịn Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu việc sử dụng enzim proteaza chủ yếu tập trung vào enzim proteaza động vật, thực vật enzim proteaza từ vi sinh vật nghiên cứu Cơng nghệ enzim nước ta cịn mẻ, giai đoạn hưởng ứng ngày hồn thiện, việc sâu vào tìm hiểu enzim proteaza từ vi sinh vật ứng dụng vấn đề mang tính thời đại cấp thiết Xuất phát từ ưu việt cấp thiết enzim proteaza chiết xuất từ vi sinh vật nói chung từ vi khuẩn Bacillus subtilis nói riêng nên chúng tơi chọn đề tài: “Tìm hiểu hoạt tính enzim proteza vi khuẩn Bacillus subtilis” Nhằm mong muốn góp phần đưa điều kiện tối thích cho việc sử dụng thực tiễn phục vụ đời sống người II: MỤC TIÊU Do thấy vai trò proteaza từ vi khuẩn Bacillu subtilis nên thực đề tài nhằm mục tiêu: - Ni cấy từ phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để thu nhận enzim Nghiên cứu số đặc điểm sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis hướng tới việc điều khiển sinh trưởng, phát triển vi khuẩn theo mục đích sử dụng - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzim proteaza để tìm điều kiện tối thích nhằm sử dụng enzim thực tiễn - Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối Bacillus subtilis để thu nhận enzim - Rèn luyện cho thân số kỹ làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học III: NHIỆM VỤ Để đạt mục tiêu nhiệm vụ đề tài gồm: - Thu thập, xử lý, bảo quản mẫu - Pha chế môi trường nuôi cấy, nuôi phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis - Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis - Thực thí nghiệm ảnh hưởng số điều kiện lên hoạt tính enzim, từ tìm điều kiện tối thích cho hoạt tính enzim proteaza gồm: Nhiệt độ, pH, độ ẩm (RH) - Nghiên cứu tác dụng xúc tác enzim proteaza - Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối vi sinh vật thu nhn enzim Ch-ơng 1: Tổng quan tài liƯu 1.1 C¬ së khoa häc: 1.1.1 Vi khn Bacillus subtilis: Vi khuÈn Bacillus subtilis thuéc lo¹i trùc khuÈn (Bacillus) vi khuẩn có dạng hình que, nhuộm Gram d-ơng, cã kÝch th-íc (0,5-1)*(1-4) µm, cã néi bµo tư, sèng hiếu khí kị khí không bắt buộc Chúng sinh bào tử gần nhhình cầu để tồn trạng thái ngủ đông Bacillus subtilis loại vi khuẩn tiếng làm hỏng thức ăn, bào t nã cã thĨ sèng sãt ®é nãng cïng cùc th-ờng thấy nấu thức ăn tác nhân làm h- hỏng bánh mì [2] Hệ enzim Bacillus subtilis phong phú đa dạng gồm: Proteaza, Amylaza, Glucoamylaza, Glucanaza, Celluloza, Dextranaza, Pectinaza [21] Quan s¸t d-ới hính hiển vi Bacillus subtilis đơn lẻ có dạng hình que, phần lớn que có bào tử hình oval có khuynh h-ớng phình đầu Th-ờng quan sát thấy tập đoàn vi khuẩn rộng lớn, có hình dạng bất định Bacillus subtilis tác nhân gây bệnh cho ng-ời, gây ô nhiễm thực phẩm nh-ng gây ngộ độc thực phẩm, sinh enzim phân giải protein subtilisin Là loài sống phổ biến đ-ợc thấy nhiều môi tr-ờng đất bụi rậm Chúng có khả phân giải hợp chất hữu thải từ thức ăn d- thừa phế thải nhờ có khả tổng hợp enzim phân huỷ hợp chất hữu nh- : Poteaza, Amylaza Chúng có khả tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số l-ợng vi sinh vật gây bệnh phát triển mức nh-: Vibrio, Aeromonas Vi khuẩn Bacillus subtilis đà đ-ợc ứng dụng nhiều nghành công nghiệp đặc biệt công nghiệp sản xuất enzim nh- Proteaza, Amylaza, [2] Đà có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis chÕ biÕn thùc phÈm, trÝch ly c¸c chÊt tõ thùc vËt, tõ c©y thc [3] 1.1.2 Tỉng quan vỊ enzim: 1.1.2.1 Giíi thiƯu chung vỊ enzim: Nhãm enzim Proteaza xúc tác trình thủy phân liên kết peptid (CO-NH-) phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối axitamim HN2 - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - COOH + H2O R1 R2 Rx H2N - CH - COOH + H2N - CH - CO…NH - CH - COOH R1 R2 Rx Proteaza cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên đ-ợc phân bố rỗng rÃi nhiều đối t-ợng từ sinh vËt ®Õn ®éng vËt, thùc vËt So víi proteaza động vật thực vật proteaza vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Tr-ớc hết proteaza vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gåm nhiỊu enzim rÊt gièng vỊ cÊu tróc, khối l-ợng hình dạng phân tử nên khó tách đ-ợc dạng tinh khiết Cũng phức hệ gồm nhiều enzim khác nên proteaza vi sinh vật th-ờng có tính đặc hiệu rỗng rÃi cho sản phẩm thủy phân triệt để 1.1.2.2 Phân loại enzim proteaza: Proteaza đ-ợc chia thành hai loại: endopeptidaza exopeptidaza: Peptidaza (proteaza) Exopeptida za aminopeptid aza Carboxype ptidaza Endopeptida za Serine proteaza Cystein proteaza Aspartic proteaza Metallo proteaza - Dùa vµo vị trí tác động lên chuỗi polypeptide, exopeptidaza đ-ợc phân thành hai loại : + Aminopeptidaza : xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự chuỗi polypeptide để giải phóng aminoaxid, dipeptide tripeptide + Carboxypeptidaza : xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu C chuỗi polypeptide giải phóng aminoaxit dipeptide - Dựa vào động học chế xúc tác, endopeptidaza đ-ợc chia thành nhóm: + Nhóm serinproteaza: proteaza cã nhãm -OH cđa gèc serine trung t©m hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng hoạt động xúc tác enzim + Nhóm cysteinproteaza : proteaza co nhóm -SH trung tâm hoạt động Vi cỏch b trớ thớ nghim nhiệt độ khác phương pháp nêu Kết thu được trình bày bảng 3.5: Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzim proteaza Nhiệt o độ ( C) Thời Vịng phân giải (µm) gian P(%) Vp(%) (h) d (µm) D(µm) 20 24-72 24,75 56,50 126,26 66,14 30 24-72 32,80 78,03 137,89 94,22 40 24-72 18,50 39,40 112,97 43,54 50 24-72 12,50 24,30 94,40 24,58 60 24-72 0,00 0,00 0,00 0,00 Ở đây: d: Đường kính vịng phân giải 24h D: Đường kính vịng phân giải 72h Từ bảng 3.5 ta thấy rằng: Với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn sau: - Ở 200C hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis có vịng phân giải đạt 126,26%, tốc độ phân giải enzim đạt 66,16% - Ở 30 0C hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải enzim đạt 137,89%, tốc độ phân giải đạt 94,22% - Ở 400C hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 112,97%, tốc độ phân giải enzim đạt 43,54% - Ở 500C hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 94,40%, tốc độ phân giải enzim đạt 24,58% - Ở 600C enzim proteaza bị hoạt tính 41 Như ta thấy nhiệt độ 300C enzim proteaza có hoạt tính mạnh có vịng phân giải đạt 137,89%, tốc độ phân giải đạt 94,22%, tiếp hoạt tính 200C đạt 126,26%, tốc độ phân giải enzim 66,14%, đến nhiệt độ 400C, 500C hoạt tính enzim giảm dần Và enzim bị hoạt tính 600C Từ ta thấy nhiệt độ tối thích (T.opt) cho hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis 300C, sau 200C Ở 200C hoạt tính enzim thua khơng nhiều so với hoạt tính enzim 300C Chứng tỏ hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn hoạt động mạnh nhiệt độ tương đối thấp Tóm lại muốn ni vi khuẩn Bacillus subtilis để chiết xuất enzim proteaza có hoạt tính mạnh nên ni 300C Vp(%) Biểu đồ cho thấy rõ kết bảng 3.5: 100 90 80 70 60 nhiệt độ 50 40 30 20 10 20 30 40 50 60 nhi ệt độ Biểu đồ 3.4: So sánh hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Baciliius subtilis nhiệt độ khác 42 Qua biểu đồ lần cho ta thấy: Ở nhiệt độ 30oC hoạt tính enzim mạnh nhất, thấp 60oC enzim bị hoạt tính, sau hoạt tính trung bình 20oC, cịn 40, 50oC hoạt tính enzim giảm dần Chứng tỏ nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzim proteaza 30oC, sau 20, 40oC, 50oC 60oC bị hoạt tính 3.4.2 Ảnh hưởng độ ẩm: Hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis phụ thuộc nhiều vào độ ẩm Độ ẩm cao thấp ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển vi khuẩn từ ảnh hưởng đến hoạt tính enzim proteaza, làm cho vi khuẩn tiết enzim hoạt tính enzim thấp Vì tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm lên hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis để tìm hiểu ngưỡng độ ẩm tối ưu cho hoạt tính enzim, từ làm sỏ điều chỉnh độ ẩm thích hợp q trình sản xuất sử dụng enzim công nghiệp đạt hiệu cao Chúng tơi tiến hành bố trí thí nghiệm sau: Đặt lơ thí nghiệm tủ sinh trưởng Growth cabinet ( hãng Contherm sản xuất), điều chỉnh nhiệt độ 30oC độ ẩm khác 25, 50, 75, 100% Mỗi công thức lặp lại lần Đo đường kính khuẩn lạc đường kính vịng phân giải từ xuất đến ngày thứ từ xác định hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn.với cách bố trí thí nghiệm độ ẩm khác phương pháp nêu Kết thu được trình bày bảng 3.6: Bảng 3.6: Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis: 43 Độ ẩm (RH) Thời Vịng phân giải gian (µm) (h) d (µm) D (µm) P(%) Vp(%) 25 24-72 7,80 12,50 60,25 9,79 50 24-72 15,50 27,40 76,77 24,79 75 24-72 31,08 76,02 144,59 93,62 100 24-72 25,30 59,70 135,96 71,66 Ở đây: d : Đường kính vịng phân giải 24h D: Đường kính vịng phân giải 72h Từ bảng 3.6 cho thấy: Cùng với điều kiện thí nghiệm khác độ ẩm hoạt tính enzim proteaza lại khác Sau nuôi cấy 24-72h ghi kết thí nghiệm sau: - Ở RH =25%: Hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 60,25%, tốc độ phân giải 9,79% - Ở RH =50%: Hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 76,77%, tốc độ phân giải enzim 24,79% - Ở RH =75%: hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 144,59%, tốc độ phân giải enzim đạt 93,62% - Ở RH =100% : hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 135,96%, tốc độ phân giải enzim 71,66% Như vậy: RH =75% enzim proteaza vi khuẩn có hoạt tính mạnh có vịng phân giải 144,59%, tốc độ phân giải đạt 93,62%, tiếp RH =100% Ở RH=50% hoạt tính trung bình hoạt tính yếu 25% Từ ta thấy độ ẩm thích hợp cho hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillusssubtilis 75%, sau 100% hoạt tính 25% 44 Do muốn ni vi khuẩn để thu enzim cần ni độ ẩm thích hợp 75% Vp(%) Biểu đồ cho ta thấy rõ kết 3.6: 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 độ ẩm 25 50 75 100 độ ẩm Biểu đồ 3.5: So sánh hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis độ ẩm khác Qua biểu đồ cho ta thấy RH=75% hoạt tính enzim vượt trội so với độ ẩm khác, thấp RH =25%, tiếp RH=100% đến 50% Do để ni vi khuẩn chiết xuất enzim nên ni độ ẩm 75% 3.4.3 Ảnh hưởng pH: pH hưởng đến tốc độ sinh trưởng, phát triển vi khuẩn từ ảnh hưởng đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis Nếu mơi trường có pH q cao thấp enzim proteaza vi khuẩn tiết có hoạt tính khơng cao Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis để tìm ngưỡng pH tối ưu cho tốc độ phân giải enzim proteaza 45 Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis môi trường MPA điều kiện nhiệt độ thích hợp 30oC độ ẩm tối thích 75% điều kiện pH khác từ (3-9), công thức lặp lại lần Đo đường kính khuẩn lạc đường kính vịng phân giải từ xuất đến ngày thứ ba xác định tốc độ phân giải chất enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis Kết thu được trình bày bảng 3.7 pH Thời Vịng phân giải gian (µm) P(%) Vp(%) (h) d(µm) D(µm) 24-72 7,50 10,03 33,73 5,27 24-72 10,10 16,02 58,61 12,33 24-72 25,20 52,30 107,53 56,45 24-72 30,70 66,90 117,91 75,41 24-72 21,50 43,60 102,79 46,04 24-72 20,40 35,50 74,01 31,45 24-72 12,30 20,50 66,66 17,08 Bảng 3.7 : Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis Ở đây: d: Đường kính vịng phân giải 24h D: Đường kính vịng phân giải đo 72h Qua bảng 3.7 cho ta thấy: - Với pH=3 hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 33,73%, tốc độ phân giải chất enzm đạt 5,27% 46 - Với pH= hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 58,61%, tốc độ phân giải enzim 12,33% - Với pH=5 hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 107,53%, tốc độ phân giải 56,45% - Với pH=6 hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 117,91%, tốc độ phân giải enzim 75,41% - Với pH=7 hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 102,79%, tốc độ phân giải 46,04% - Với pH=8 hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 74,01%, tốc độ phân giải enzim 31,45% - Với pH=9 hoạt tính enzim proteaza có vịng phân giải đạt 66,66%, tốc độ phân giải đạt 17,08% Từ cho ta thấy : pH=6 hoạt tính enzim mạnh nhất, ngưỡng pH thích hợp cho hoạt động phân giải enzim proreaza Sau đến pH=5, pH=7, pH=8 hoạt tính thấp pH=9 pH=4, yếu pH=3 Như vậy: hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis có khả xúc tác khoảng pH từ 3-9, chứng tỏ enzim có hoạt tính khoảng pH tương đối rộng Và ngưỡng pH thích hợp cho hoạt tính enzim từ 5-7, thích hợp pH=6, cịn hoạt tính yếu pH=3 Do dùng vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất chế phẩm enzim nên ni cấy vi khuẩn pH tối ưu (pH=6) 47 Vp(%) Biểu đồ cho ta thấy rõ kết bảng 80 70 60 50 40 pH 30 20 10 pH Biểu đồ 3.7: So sánh hoạt tính enzim độ pH khác vi khuẩn Bacillus subtilis Qua biểu đồ cho ta thấy: đường biểu diễn hoạt tính enzim theo pH có xu hướng lên cao lại xuống thấp dần Ở pH=6 hoạt tính enzim proteaza có chiều cao lớn nhất, thấp pH=3, sau pH=5 pH=7, pH=8 có chiều cao trung bình, thấp pH=9 pH=4 Như khoảng từ 5-7 enzim hoạt động tốt cao pH=6 3.5 Ảnh hƣởng mật độ đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis: Mật độ yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzim Vì nhiều vi khuẩn sản sinh nhiều enzim Chúng tiến hành nuôi cấy vi khuẩn môi trường MPA điều kiện thích hợp, từ dịch huyền phù có mật độ tương ứng 1NTU (1 đơn vị độ đục), ta pha độ pha loãng khác từ 10-2 đến 10-8, công thức lặp lại lần [1g] Sau bố trí thí nghiệm theo phương pháp nêu đo máy quang phổ ta thu kết sau: 48 Mật độ Hoạt độ (%) 10-2 86,00 10-3 80,55 10-4 70,83 10-5 56,25 10-6 46,15 107 30,00 10-8 12,50 Bảng 3.8 : Liên quan mật độ đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis Qua bảng ta thấy: với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis mật độ liên quan đến hoạt tính enzim proteaza sau: Ở mật độ 10-2 enzim có hoạt tính mạnh với 86%, sau hoạt tính enzim proteaza giảm dần theo mật độ vi khuẩn, 10-3 80,55% nhỏ mật độ 10-8 với 12,5% Chứng tỏ nhiều vi khuẩn sản sinh nhiều enzim Ở với mật độ ≥ 10-5 hoạt tính đạt > 56% Chứng tỏ hoạt tính proteaza Bacillus subtis mạnh Biểu đồ cho ta thấy rõ kết bảng 3.8: 49 90 80 70 60 hoạt độ 50 40 Series1 30 20 10 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8 mật độ Biểu đồ 3.7:Liên quan mật độ đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis Qua biểu đồ lần cho ta thấy: mật độ 10 -2 enzim có hoạt tính mạnh nhất, sau giảm dần độ pha lỗng thấp độ pha loãng 10-8 Vì thực tế người ta tính mật độ đủ để hoạt tính tối đa, nhằm tiết kiệm enzim enzim thương phẩm 3.6 Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối Bacillus subtilis để thu nhận enzim Sản xuất sinh khối khâu quan trọng công nghệ vi khuẩn Bacillus subtilis Để có nhiều vi khuẩn Bacillus subtilis sử dụng ta phải sản xuất sinh khối, làm tăng số lượng vi khuẩn cần thiết đạt tiêu chuẩn Đồng thời điều giúp bảo quản chủng vi khuẩn Bacillus subtilis lâu dài huy động sử dụng lúc Từ kết thu bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 xây dựng quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis 50 Sơ đồ minh họa quy trình: Lấy mẫu đất Làm sạch, xử lý bảo quản Pha chế môi trường MPA (vô trùng) Nuôi cấy (1) Phân lập Cấy chuyền để nhân giống Nuôi cấy (2) Sản phẩm (Sinh khối Bacillus subtilis tinh khiết) Giải thích quy trình: - Lấy mẫu: Để lẫy mẫu chúng tơi xác định vị trí khác thuộc hai chân ruộng cách 500m Tại chân ruộng thứ có hai vị trí thu mẫu vùng thu mẫu 1, vùng thu mẫu Tại vị trí thu mẫu chúng tơi tiến hành thu mẫu nghiên cứu Dùng dao vô trùng lấy 1kg đất độ sâu 0-30cm thuộc chỗ khác trộn lại, lấy giấy bóng mờ khử trùng bao gói 51 - Bảo quản mẫu: Bọc mẫu vào báo, cho vào túi polyetylen đặt vào tủ lạnh để bảo quản - Môi trường: Chúng sử dụng môi trường MPA, vô trùng 1atm, thời gian 30 phút - Nuôi cấy (1): Nuôi cấy nhiệt độ tối ưu 30oC, điều kiện pH = độ ẩm (RH) thích hợp 75%, Ở điều kiện vi khuẩn sinh trưởng phát triển mạnh - Phân lập: Để tuyển chọn chủng vi khuẩn khiết tiến hành phân lập tủ phân lập vô trùng tia tử ngoại - Cấy chuyền: Để tạo lượng vi khuẩn cần thiết tiến hành cấy chuyền tủ cấy vô trùng - Nuôi cấy (2): Nuôi cấy điều kiện thích hợp với nhiệt độ 30oC, pH=6 độ ẩm 75% Đây điều kiện mà vi khuẩn sinh trưởng, phát triển tốt - Thu sản phẩm: Sản phẩm bao gói bảo quản tủ lạnh Với quy trình này, việc sản xuất sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm thu nhận enzim điều thực thực tiễn sản xuất 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: A Kết luận: Vi khuẩn Bacillus subtilis đất chân ruộng phong phú Trong gam đất có tới 216.969.697 tế bào vi khuẩn (khoảng > 216,9 triệu tế bào/1g đất) Khuẩn lạc Bacillus subtilis không màu, xù xì, lõm giữa, khơng có sản phẩm tiết Bacillus subtilis sinh trưởng, phát triển nhanh điều kiện thuận lợi nhiệt độ tối thích T(opt) 30oC, pH(opt) RH(opt) 75 Như sở ta điều khiển sinh trưởng, phát triển chúng theo nhu cầu sử dụng Bacillus subtilis nguồn sản sinh proteaza quan trọng, enzim proteaza có hoạt tính cao, có tốc độ phân giải nhanh Hoạt tính enzim proteaza chịu ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm Nhiệt độ tối thích T(opt) 30oC, pH(opt) 6, RH(opt) 75% Để có hoạt tính cao mật độ vi khuẩn cần có 10-2 Và khoa học để tối ưu hóa quy trình cơng nghệ sử dụng sản xuất, đời sống, đặc biệt chế biến thực phẩm ứng dụng y học B.Kiến nghị: Do thời gian điều kiện nghiên cứu cịn hạn chế nên chúng tơi tiến hành số nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, độ ẩm, pH đến sinh trưởng, phát triển hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis Đề tài cần nghiên cứu điều kiện khác ảnh hưởng lên sinh trưởng hoạt tính enzim prpteaza Để khai thác hết tiềm vi khuẩn Bacillus subtilis, có điều kiện cần nghiên cứu enzim khác ứng dụng công nghệ chế biến thực phẩm, công nghệ xử lý môi trường 53 Tài liệu tham khảo: Tài liệu tiếng việt Lê Xuân Phương, (2001) Vi sinh vật học công nghiệp – nhà xuất Đại Học Xây Dựng Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu, (1982) Enzim vi sinh vật tập1 – nhà xuất Bản Khoa Học Kỹ Thuật Lê Ngọc Tú, (2005) Hố sinh cơng nghiệp- Nhà xuất Khoa Học Kĩ Thuật Lưu Thị Minh Nguyệt, (2007) “Phân tích proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis hệ hai pha polyethylene glycol/ potasium phosphate” Đồ án tốt nghiệp Lưu Thị Minh Nguyệt, (2007) “Phân tích proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis hệ hai pha polyethylene glycol / potasium phosphate” Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Xuân Hiền, “Nghiên cứu khả chịu nhiệt bào tử enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis” – khoá luận tốt nghiệp Đại Học –Bách Khoa Đà Nẵng Nguyễn Lân Dũng, (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 1-2-3 Nxb Khoa Học Kĩ Thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, (1976) Thực tập vi sinh vật học, xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng, (2001) Sinh học vi sinh vậtNhà xuất Giáo Dục Nguyễn Văn Mùi, (2002) Xác định hoạt độ enzim –Nhà xuất Khoa Học Kĩ Thuật Hà Nội 10 Nguyễn Dương Tuệ, (2003) Các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Đại Học Vinh 11 Nguyễn Dương Tuệ, (2005) Công nghệ vi sinh vật học - Đại Học Vinh 54 12 Trần Cẩm Vân, (2001) Giải tích vi sinh vật học - Đại Học Quốc Gia Hà Nội 13 Trần Xuân Nghạch, (2007) Công nghệ enzm - Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng 14 “ Thu nhận khảo sát số chế phẩm enzim proteaza từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis” đề tài Trần Giang Vũ Vi 15 Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ, tập 9-số11- năm (2006) 16 Tạp chí cơng nghệ sinh học, tập 15-sơ2-năm 2007 17 Tạp chí cơng nghệ sinh học, tập 15- số 3- 2007 18 Vũ Ngọc Bội, (2004) Luận án tiến sĩ sinh học : “ Nghiên cứu trình thuỷ phân protein cá enzim proteaza từ Bacillus subtilis” - Đại Học Quốc Gia TPHCM- ĐHKHTN Tài liệu tiếng nước ngoài: 19 Prof Dr.David B.Fankhauser (2007) Spectrophotometer 20 Prof Dr.David B.Fankhauser (2001)- Spreading Technigne for planting bacteria 21 Prof Dr.David B.Fankhauser (2007)- Single Colony isolation 22 D.R.Rashyap, S.chandra, A.kaul, R.Tewari, “Production, purification and characterization of pectimase from a Bacillus SP.DT 17” World Joural of Microbiology and Biotechnology vol16, 2002 Tài liệu mạng: 23 http: // Sinh vien da nang.com 24 http: // Tu dien sinh hoc viet nam 25 http: // Bai giang Violet Vn/present / show / entry – id/728575 / cm- id/1209763 26 http: // www Huaf.edu.vn/dien dan/viewtopic 55 ... 200C Ở 200C hoạt tính enzim thua khơng nhiều so với hoạt tính enzim 300C Chứng tỏ hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn hoạt động mạnh nhiệt độ tương đối thấp Tóm lại muốn ni vi khuẩn Bacillus subtilis. .. tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus subtilis: 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ: Nhiệt độ không ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển mà bên cạnh cịn ảnh hưởng đến hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus. .. 50oC hoạt tính enzim giảm dần Chứng tỏ nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzim proteaza 30oC, sau 20, 40oC, 50oC 60oC bị hoạt tính 3.4.2 Ảnh hưởng độ ẩm: Hoạt tính enzim proteaza vi khuẩn Bacillus