Bai giang Sinh hoc phan tu

Primosome hình thành tại oriC xảy ra như sau: – DnaA gắn vào oriC tại vị trí được gọi là dnaA box và phối hợp với HU protein tách một đoạn DNA kế cận về phía trái của dnaA box – DnaB gắn[r]

2/22/2016 Chương Sự tổ chức thể động vật Sự tổ chức thể động vật SỰ TỔ CHỨC CƠ THỂ tiết I CÁC LOẠI MÔ ĐỘNG VẬT • Biểu mô • Mô liên kết • Mô • Mô thần kinh II CÁC CƠ QUAN VÀ HỆ CƠ QUAN Ở ĐỘNG VẬT 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH Dẫn nhập Nguyễn Hữu Trí Học thuyết tế bào Tế bào là đơn vị trung tâm các tổ chức sinh học: Tế bào là đơn vị sự sống Tất cả các sinh vật sống cấu tạo tế bào Chỉ tế bào sống có thể sinh sản và tạo tế bào Matthias Schleiden 1838: Thực vật cấu tạo tế bào Theodor Schwann 1839: Động vật cấu tạo tế bào Rudolf Virchow 1858: Mỗi tế bào bắt nguồn từ tế bào khác 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí Sự đa dạng tế bào Tế bào các quan khác thể có khác hình dạng, kích thước và chức năng: hồng cầu hình cầu; tế bào thần kinh có nhiều nhánh; tế bào biểu bì hình khối, dẹt… Tế bào Thể tích tế bào thường cố định và không phụ thuộc vào kích thước thể Tuy hình dạng, kích thước và chức các tế bào các quan khác khác nhau, song các tế bào có thành phần bản: màng tế bào, tế bào chất, nhân tế bào 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Mô động vật Mô động vật (Tissues) • Mô là nguyên liệu để xây dựng nên các quan thể đa bào • Có loại mô • • • • Biểu mô (Epithelial) Mô liên kết (Connective) Mô (Muscle) Mô thần kinh (Nerve) Mô là tập hợp yếu tố có cấu trúc tế bào đã chuyển hoá và các yếu tố không có cấu trúc tế bào để thực các chức định 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH Khối u (tumor) gồm cụm tế bào không có chức Khối u có thể là lành tính (benign), xâm lấn sang các mô bao quanh và trở thành ác tính (malignant) Các tế bào khối u có thể di cư, di (metastatic), đến các vị trí khác thể Khối u ác tính và di chính là ung thư (cancerous) Tế bào thường phân cực, có cực và cực gốc, liên kết chặt chẽ với nhau, khe gian bào hẹp Mặt biểu mô thường dựa vào màng là màng biệt hóa từ mô liên kết kế cận Không có mạch máu vào (trừ mệ lộ màng tai trong), không có dây thần kinh vào (trừ niêm mạc khứu giác) Chất dinh dưỡng thấm qua màng để nuôi biểu mô Có khả tái sinh mạnh nhờ phân bào nhanh để hàn gắn vết thương (biểu bì da, biểu mô con) Bề mặt biểu mô bài xuất hấp thụ thường biệt hóa cao (lông rung- vi nhung) Tế bào biểu mô phủ chuyển hóa để trở thành tế bào que, tế bào nón, thủy tinh thể mắt – tế bào có lông rung tai – sừng – móng – tóc – – sắc bào 22/02/2016 11:56 CH 11 Biểu mô là loại mô xếp thành lớp dày bao phủ mặt ngoài hay mặt các quan, ngoài biểu mô còn tạo thành các tuyến nội tiết hay ngoại tiết Về mặt cấu tạo, biểu mô hay nhiều lớp tế bào xếp khít tạo thành, tế bào là thành phần cấu tạo chủ yếu, còn chất gian bào thì không đáng kể Nguyễn Hữu Trí Biểu Mô (Epithelial Tissue) Đặc điểm cấu tạo Nguyễn Hữu Trí I Biểu mô Ung thư là gì? 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí Phân loại biểu mô theo cấu tạo Dựa vào hình dạng lớp tế bào trên cùng • Biểu mô dẹt (Squamous) • Biểu mô khối (Cuboidal) • Biểu mô trụ (Columnar) 22/02/2016 11:56 CH 12 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Phân loại biểu mô theo cấu tạo Phân loại biểu mô theo cấu tạo Dựa vào số lượng lớp tế bào Hai loại biểu mô khác Biểu mô đơn (Simple): lớp tế bào Biểu mô biến dạng (Transitional) Biểu mô tầng (Stratified): Có lớp tế bào Biểu mô giả tầng (Pseudostratified) 22/02/2016 11:56 CH 13 Nguyễn Hữu Trí Chức biểu mô Bảo vệ: Biểu mô có chức bảo vệ, chống các tác nhân vật lý, hóa học và chống nhiễm khuẩn Hấp thụ: Biểu mô phủ lót mặt ruột và các ống thận có khả hấp thụ Chế tiết: Biểu mô các tuyến nội tiết và ngoại tiết có khả chế tiết số chất giúp cho quá trình trao đổi chất – tăng trưởng, sinh sản Ở số nơi, biểu mô biệt hóa cao độ để thu nhận các kích thích (các tế bào biểu mô cảm giác chồi vị giác trên mặt lưỡi; tế bào thính giác quan Corti tai trong) 22/02/2016 11:56 CH 15 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô dẹt đơn (Simple Squamous Epithelium) Chỉ gồm lớp tế bào dẹt ( gạch men hoa lát nhà) Biểu bì phủ trên da ếch, biểu mô tạo thành nang Bowman thận Phế nang Nhân tế bào 22/02/2016 11:56 CH 14 Nguyễn Hữu Trí Phân loại biểu mô theo chức • Dựa vào chức biểu mô chia thành hai loại là biểu mô phủ và biểu mô tuyến • Biểu mô phủ: là tế bào phủ mặt ngoài hay lót mặt quan rỗng, lót mặt thành, mặt tạng thể • Biểu mô tuyến là nhóm tế bào chuyển hóa cao để thích nghi với chức chế tiết và bài xuất 22/02/2016 11:56 CH 16 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô dẹt đơn (Simple Squamous Epithelium) • Chứa 1.Khuếch tán • Các phế bào phổi cho phép khuếch tán trao đổi O2 và CO2 2.Lọc • Các mao mạch cho phép các dịch lỏng và các chất dinh dưỡng thấm qua các tế bào máu và protein bị giữ lại nó Thành phế nang tạo biểu mô dẹt đơn (x400) 22/02/2016 11:56 CH 17 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 18 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Biểu mô vuông đơn (Simple Cuboidal Epithelium) Biểu mô vuông đơn (Simple Cuboidal Epithelium) • Một lớp tế bào hình khối, các cạnh có kích thước đồng đều, nhân hình cầu nằm trung tâm tế bào • Biểu mô tạo thành ống góp thận • Tế bào biểu mô khối đơn • Các tuyến nội tiết tuyến giáp trạng (thyroid) là tuyến nội tiết dạng nang tạo thành tế bào biểu mô đơn khối và chế tiết hormon Hấp thu Màng • Trong thận, ống góp thận tạo thành từ biểu mô khối đơn và tái hấp thu nước và các chất dinh dưỡng khác từ dịch lọc Mô liên kết Biểu mô khối đơn ống thận (x 400) 22/02/2016 11:56 CH 19 Chức năng: Chế tiết 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí Biểu mô trụ đơn (Simple Columnar Epithelium) 20 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô trụ đơn (Simple Columnar Epithelium) • Gồm lớp tế bào hình trụ có nhân hình bầu dục và nằm hướng phía màng đáy • Tế bào dạng chén thường tìm thấy lớp này • Tế bào biểu mô trụ đơn • Ví dụ: Trong dày, các tế bào biểu mô trụ đơn chế tiết các enzyme tiêu hóa Hấp thụ Màng • Ví dụ: Trong ruột non, các tế bào biểu mô trụ đơn hấp thụ các chất dinh dưỡng Biểu mô trụ đơn niêm mạc dày (x 1300) 22/02/2016 11:56 CH 21 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí Biểu mô trụ giả tầng (Pseudostratified Columnar Epithelium) • Gồm lớp tế bào khác chiều cao Nhân tế bào nằm hàng khác • Mọi tế bào có mặt đáy bám vào màng chung Có thể có không có lông Lông Dịch nhầy tế bào dạng chén Lớp biểu mô giả trụ tầng Màng Mô liên kết Biểu mô trụ giả tầng lót khí quản người (x 400) 22/02/2016 11:56 CH 23 Nguyễn Hữu Trí Chức Chế tiết 22 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô trụ giả tầng có lông Pseudostratified Columnar Ciliated Epithelium (PCCE) • Chức Bảo vệ • Ví dụ: biểu mô lót mặt khí quản, có lông để quét các bụi bẩn rơi vào đường hô hấp Chế tiết • Ví dụ: Có thể chứa các tế bào hình chén tiết chất nhầy 22/02/2016 11:56 CH 24 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Biểu mô dẹt tầng (Stratified Squamous Epithelium) Biểu mô dẹt tầng (Stratified Squamous Epithelium) • Chứa nhiều lớp tế bào chồng lên • Lớp trên cùng là tế bào dẹt • Các lớp có thể có nhiều hình dạng khác • Chức năng: • Bảo vệ phần mô vùng phía khỏi bị tổn thương • Có thể không hóa sừng bề mặt biểu mô lót thực quản hóa sừng biểu bì da, biểu bì lót âm đạo phụ nữ lớn tuổi Biểu mô dẹt tầng Nhân Màng Mô liên kết Biểu mô dẹt tầng lót thực quản (x 425) 22/02/2016 11:56 CH 25 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí Chức Bảo vệ thể chống lại trầy xước và xâm nhập tác nhân gây bệnh Vùng biểu mô không hóa sừng thường nằm vùng ẩm ướt • • • • • 22/02/2016 11:56 CH Miệng Hầu Thực quản Hậu môn Âm đạo Nguyễn Hữu Trí Biểu mô dẹt tầng hóa sừng Biểu mô dẹt tầng không hóa sừng • 26 • Chức Bảo vệ thể • Chỉ tìm thấy lớp biểu bì da • Keratin là protein tăng cường cho tế bào khỏi bị trầy xước • Các lớp vảy sừng trên bị bong 27 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô biến dạng (Transitional Epithelium) Gồm nhiều lớp tế bào có kích thước khác Các tế bào có dạng vòm không bị căng Các tế bào có dạng dẹt bị căng 22/02/2016 11:56 CH 28 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô biến dạng (Transitional Epithelium) Chức năng: cho phép bàng quang phồng và chùn lại bị căng Chỉ tìm thấy hệ bài tiết Biểu mô tầng biến dạng Màng Mô liên kết Biểu mô tầng biến dạng bàng quang không có nước tiểu (x 500) 22/02/2016 11:56 CH 29 Nguyễn Hữu Trí Bàng quang chứa đầy nước tiểu 22/02/2016 11:56 CH Bàng quang trống 30 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Biểu mô vuông tầng (Stratified Cuboidal Epithelium) • Có hai hay nhiều lớp tế bào hình khối xếp chồng lên • Hiếm gặp Tìm thấy thành ống dẫn tuyến mồ hôi 22/02/2016 11:56 CH 31 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô trụ tầng (Stratified Columnar Epithelium) Phân bố hạn chế thể Để phân biệt khác với biểu mô phủ, trụ, giả tầng cách quan sát nhân tế bào Nhân tế bào biểu mô phủ, trụ, tầng xếp thành hàng 22/02/2016 11:56 CH Biểu mô trụ tầng (Stratified Columnar Epithelium) • Chức Bảo vệ • Tìm thấy hầu, niệu đạo nam, lót mặt số tuyến, ống, tuyến sữa, hậu môn 22/02/2016 11:56 CH 33 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô tuyến 32 Nguyễn Hữu Trí Biểu mô tuyến • Biểu mô tuyến: là nhóm tế bào chuyên môn hoá cao độ để thích ứng với chức chế tiết và bài xuất Các tế bào tuyến này ăn sâu vào mô liên kết phía để tạo thành tuyến Căn vào chức bài xuất các chất tiết người ta phân tuyến làm hai loại: tuyến ngoại tiết và tuyến nội tiết 22/02/2016 11:56 CH 34 Nguyễn Hữu Trí II Mô liên kết • Tuyến ngoại tiết là tuyến mà chất chế tiết chúng bài xuất ngoài hay vào khoang thể thông với ngoài (như lòng ống tiêu hoá, khoang tử cung) thông qua hệ thống ống trung gian • Tuyến nội tiết: chất chế tiết ngấm trực tiếp vào máu (không có ống dẫn) Xung quanh tế bào tuyến thường có mao mạch dày đặc Các tuyến nội tiết tuyến yên, tuyến giáp trạng, tuyến trên thận, tuyến tuỵ nội tiết, v.v… 22/02/2016 11:56 CH 35 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Mô liên kết (Connective Tissue) Mô liên kết • Mô liên kết là loại mô đó tế bào xếp không sát nhau, xen kẽ các tế bào là chất gian bào Cấu tạo mô liên kết phức tạp Có loại trạng thái thể dịch máu, có loại trạng thái hình thể bất định các loại sợi, có loại hình thể ổn định sụn, xương … • Mỗi loại có đặc điểm là: có nhiều tế bào, chất gian bào chiếm tỷ lệ đáng kể 22/02/2016 11:56 CH 37 Mô liên kết là mô tạo và giữ cho thể có hình dạng định, bao bọc các quan để bảo vệ và trao đổi chất Mô liên kết phân bố hầu khắp thể và luôn nằm phía biểu mô Dựa vào thành phần sợi và chất vô định hình người ta chia làm loại: Mô liên kết mềm Mô liên kết sợi Mô liên kết lỏng Mô liên kết cứng 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 38 Nguyễn Hữu Trí Các loại tế bào mô liên kết mềm Mô liên kết mềm Nguyên bào sợi: có vai trò quan trong việc tổng hợp các loại sợi mô liên kết, sản sinh số protein tham gia hình thành chất vô định hình Đại thực bào: Thực bào các tác nhân xâm nhiễm và các mảnh vụn tế bào Tế bào tạo mỡ: Tế bào mỡ Tế bào trung mô: Tế bào mầm Tế bào bón: Kích thích phản ứng viêm địa phương: có chứa histamine và heparin Tế bào lympho/tiểu thực bào: Bạch cầu tham gia vào quá trình miễn dịch Hồng cầu… Chất dạng lỏng hay bán lỏng, có loại: Mô liên kết thưa Mô liên kết dạng lưới Mô mỡ Mô nhầy Mô hạt 22/02/2016 11:56 CH Mô liên kết thưa Areolar Connective Tissue (Loose) Chất dạng gel Có chứa loại sợi Sợi đàn hồi Nguyễn Hữu Trí Mô liên kết thưa Areolar Connective Tissue (Loose) • Chức năng: Bao bọc và đệm các quan Duy trì và vận chuyển các mô lỏng Nguyên bào sợi Sợi tạo keo Đại thực bào 40 • Vị trí: Nằm biểu mô Bọc các quan Bao quanh mao mạch Mô liên kết thưa , loại mô liên kết mềm thể (x 400) 22/02/2016 11:56 CH 41 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 42 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Mô liên kết dạng lưới Reticular Connective Tissue (Loose) • Loại mô này diện tủy đỏ xương, nhu mô tỳ tạng, vách xơ gan, lỏi lông nhung ruột non và tử cung • Các sợi lưới phân nhánh mịn tạo thành mạng • Chức Là xương mềm phía cố định các loại tế bào • Vị trí Hạch bạch huyết Tủy đỏ xương xốp Nhu mô tỳ tạng (lá lách) Bạch cầu Tỳ tạng Mô liên kết dạng lưới Reticular Connective Tissue Sợi lưới Mô liên kết dạng lưới hình thành xương tỳ tạng (x 350) 22/02/2016 11:56 CH 43 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí Mô mỡ Adipose Tissue 44 Nguyễn Hữu Trí Mô mỡ Adipose Tissue (Loose) Có nguồn gốc từ mô liên kết thưa, các tế bào bón tích lũy đầy lipid, làm tế bào căng lên Mỡ cung cấp lượng cho thể, điều hòa thân nhiệt Khối mỡ Sợi tạo keo Nhân tế bào Mạch máu Mô mỡ da (x450) 22/02/2016 11:56 CH 45 Nguyễn Hữu Trí • Chức năng: Các tế bào sợi tổng hợp và tích lũy lipid làm cho tế bào phồng lên, nhân bị ép sang bên Khi bị đói ăn thì mỡ bị oxyhóa để tạo lượng và nước, các tế bào mỡ xẹp và trở dạng tế bào sợi (chuyển dạng tế bào) 22/02/2016 11:56 CH Mô nhầy (Gelatinous connective tissue) • Chất dạng keo lỏng, các sợi collagen xếp thành bó lượn sóng, tế bào dạng hình tạo mạng chứa nhiều glycogen • Phân bố dây rốn, da phôi, mào gà 22/02/2016 11:56 CH 47 Nguyễn Hữu Trí 46 Nguyễn Hữu Trí Mô hạt • Chỉ xuất bị nhiễm khuẩn hay bị tổn thương, có nguồn gốc từ mô liên kết thưa • Ví dụ: mụn nhọt, lành bệnh thì không còn mô hạt 22/02/2016 11:56 CH 48 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Mô liên kết sợi Fibers Connective Tissue Chất gian bào chủ yếu là các loại sợi Tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi Gồm các loại Gân Dây chằng Cân Lớp bì da Gân (Tendons) Nối các mấu xương với đầu Chịu tác dụng các lực theo chiều dọc nên các sợi collagen và các tế bào xếp định hướng song song với chiều tác dụng lực Có ít chất vô định hình dạng keo lỏng Khớp vai Sợi collagen Dây chằng Gân Nhân nguyên bào sợi Gân người (x 1000) 22/02/2016 11:56 CH 49 Nguyễn Hữu Trí Dây chằng (Ligaments) 22/02/2016 11:56 CH 50 Nguyễn Hữu Trí Cân (Aponeuroses) Là màng liên kết sợi, mỏng, nhiều lớp Các sợi collagen cùng lớp thì xếp song song, còn hai lớp kế cận thì song song chéo Ràng buộc hai đầu xương dài để tạo thành bao khớp làm nhiệm vụ treo (dây chằng gáy bò) Có cấu tạo giống gân các sợi collagen ít căng Các dây chằng đàn hồi còn có thêm sợi elastic (dây âm quản) 22/02/2016 11:56 CH 51 Nguyễn Hữu Trí Lớp bì da (Dermis) Phân bố biểu bì da, gồm nhiều bó sợi collagen xếp không định hướng, chịu lực tác dụng theo nhiều chiều khác nhau, làm cho da bền vũng Sợi collagen xếp không định hướng 22/02/2016 11:56 CH 52 Nguyễn Hữu Trí Mô liên kết cứng Chất gian bào chủ yếu là chất vô định hình cứng, hòa quyện với số sợi liên kết còn gọi là chất khuôn, thành phần tế bào thưa thớt, gồm loại:  Sụn  Sụn đàn hồi  Sụn sợi  Xương xốp  Xương đặc  Dentine Lớp bì da 22/02/2016 11:56 CH 53 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 54 Nguyễn Hữu Trí 2/22/2016 Mô sụn trong: Hyaline Cartilage • Phân bố các đầu xương sườn, thành khí quản và hầu, xương phôi, mặt khớp các xương dài trưởng thành • Các tế bào sụn thường có hình tròn hay hình trứng và nằm nang sụn • Chất thường là đồng nhất, có chứa các sợi collagen Mô sụn đàn hồi: Elastic Cartilage Vị trí: có vòm mí mắt, vành tai và ống tai, sụn vách mũi, sụn lưỡi gà (ở hầu) Các tế bào nằm nan sụn Trong chất vô định hình có chứa các sợi đàn hồi Tế bào sụn ổ sụn Tế bào sụn ổ sụn Sụn sườn Chất Chất Mô sụn từ khí quản (x300) 22/02/2016 11:56 CH 55 Nguyễn Hữu Trí Mô sụn sợi: Fibrocartilage Vị trí: gồm các đĩa sụn gian đốt sống, chổ giao hai xương mu, mấu các xương có gân bám vào Gồm các bó sợi collagen xếp sít nhau, xen kẽ có các nang sụn chứa tế bào sụn Tế bào sụn ổ sụn Sợi collagen Mô sụn đàn hồi tai người (x 640) 22/02/2016 11:56 CH 56 Nguyễn Hữu Trí Mô xương: BoneTissue • Mô liên kết cứng để thích nghi với chức chống đỡ thể • Cấu tạo gồm tế bào xương và chất xương • Xương là nơi dự trữ khoáng quan trọng – hỗ trợ quá trình tạo huyết • Có hai loại xương là: • xương xốp • xương đặc Sụn sợi tạo nên các đĩa sụn gian đốt sống (x 200) 22/02/2016 11:56 CH 57 Nguyễn Hữu Trí Xương xốp: Spongy Bone 22/02/2016 11:56 CH 58 Nguyễn Hữu Trí Xương xốp: Spongy Bone Xương tủy tạo cốt sinh ra, gồm hốc tủy lớn, khúc khuỷu, thông với và ngăn cách vách ngăn không đầy đủ số ít lá xương tạo nên gọi là phiến xương Phân bố: các Phiến xương đầu xương dài (xương ống) và lõi các xương Tủy xương dẹt (xương vòm sọ, xương chậu) Các dải xương xếp xen kẽ với các hốc chứa đầy tủy xương, đó là nơi tạo xương dài tuổi lớn 22/02/2016 11:56 CH 59 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 60 Nguyễn Hữu Trí 10 2/22/2016 Xương đặc: Compact Bone • Xương tủy tạo cốt sinh ra, tạo khối xương hình trụ gọi là ống Havers (Haversian systems osteons ) Vị trí: là thành phần cứng các xương dài, có cấu tạo dày đặc không có xoang, hốc xương xốp Ống Havers Ổ xương Các hệ thống xương ống có mạch máu vào và qua ống Volkman, làm nhiệm vụ trao đổi chất tủy xương và bên ngoài Chức • Là chổ bám cho • Dự trữ chất khoáng • Nâng đỡ và bảo vệ Phiến xương Cấu tạo xương đặc (x 70) 22/02/2016 11:56 CH 61 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 62 Nguyễn Hữu Trí Dentine • Dentine là chất vô định hình răng, có cấu trúc giống xương đặc cứng nhiều, các nguyên bào (odonblasts) tạo thành, chứa 70% chất khoáng 22/02/2016 11:56 CH 63 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH Mô máu: Blood Tissue 64 Nguyễn Hữu Trí Các loại bạch cầu • Mô máu: gồm các tế bào máu và chất vô định hình dạng lỏng, đó chính là huyết tương máu và bạch huyết • Huyết tương = huyết + tơ huyết Hồng cầu Bạch cầu Huyết tương 22/02/2016 11:56 CH 65 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 66 Nguyễn Hữu Trí 11 2/22/2016 MÔ CƠ (Muscular Tissue) • Có nguồn gốc từ lá phôi giữa, riêng bì có nguồn gốc từ lá phôi ngoài • Đơn vị cấu tạo có thể là tế bào (cơ trơn, tim), hay hợp bào (cơ vân) • Là loại mô biệt hóa cao để thực chức vận động tế bào hợp bào không có trung thể và không có khả phân chia từ sơ sinh chết (trừ trơn) Chia làm ba loại Cơ trơn Cơ vân Cơ tim 22/02/2016 11:56 CH Mô 67 Nguyễn Hữu Trí Cơ vân: Skeletal Muscle Gắn liền với xương (trừ thành bụng và hoành), co mạnh và theo ý muốn Sợi có dạng hình ống, là thể hợp bào Mỗi hợp bào có màng chung bao bọc, bên màng có nhân hình gậy nằm sát màng Chiều dài hợp bào từ 1-40 mm, rộng từ 10-40 mm Trên sợi có thần kinh –cơ điều khiển co giãn theo ý muốn 22/02/2016 11:56 CH 68 Cơ trơn: Smooth Muscle • Phân bố các nội quan, co yếu, lâu mỏi và không theo ý muốn • Cơ bì: dụng lông, co giãn đồng tử mắt, co tuyến lệ, tuyến sữa, tuyến nước bọt và tuyến mồ hôi.Cơ trơn chính thức: tế bào dạng hình thoi, nhân nằm chính tế bào, chất có các tơ và sơ là các protein co rút Chiều dài sợi trơn từ 20-500 mm, đường kính từ 8-10 mm Nhân Tế bào trơn Nhân Sợi 22/02/2016 11:56 CH Cơ vân (x 300) 69 Nguyễn Hữu Trí Cơ tim: Cardiac Muscle Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH Tấm trơn (x 600) 70 Nguyễn Hữu Trí Mô thần kinh: Nervous Tissue • Chỉ có tim, co nhịp nhàng, tự động suốt sống cá thể • Được cấu tạo từ tế bào riêng biệt, tế bào thường có nhánh để tạo cầu nối chúng với • Nhân nằm tế bào Những đĩa xen vào Nhân 22/02/2016 11:56 CH 71 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 72 Nguyễn Hữu Trí 12 2/22/2016 Mô thần kinh: Nervous Tissue • Có nguồn gốc từ lá phôi ngoài Các tế bào thần kinh đệm là các tế bào ngoại lai, chúng là dẫn xuất tế bào trung mô (từ lá phôi giữa) xâm nhập vào mô thần kinh quá trình phát triển Các tế bào thần kinh có tên gọi là neuron (Waldeyer – 1891) Các neuron là tế bào có “kích thước” lớn nhất, nhánh chúng có thể dài hàng mét Ngoài neuron còn có các tế bào thần kinh đệm (neuroglia) • • 22/02/2016 11:56 CH 73 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc neuron • • • • Thân tế bào (Cell body hay Perikaryon) Sợi nhánh (Dendrite) Sợi trục (Axon ) Đầu tận cùng synap (Synaptic terminal) 22/02/2016 11:56 CH 75 Mô thần kinh: Nervous Tissue • Ở hệ thần kinh trung ương dựa vào màu sắc và cấu tạo tự nhiên người ta chia làm hai loại chất là chất xám và chất trắng • Ở neuron có phân cực chức năng: sợi nhánh là cực thu tín hiệu, sợi trục là cực phát tín hiệu 22/02/2016 11:56 CH • Mặc dù đa dạng, tất neuron có cấu trúc là sợi nhánh, thân tế bào, sợi trục, và đầu tận cùng synap • Sợi nhánh: tương đối ngắn, phân nhánh nhiều, thường là phần kéo dài bề mặt tế bào chúng tập hợp lại diện tích lớn để nhận thông tin • Thân tế bào: chứa nhân và các bào quan thực nhiệm vụ tổng hợp protein và nhiều hoạt động trao đổi chất • Sợi trục: là dây cáp thần kinh truyền các tín hiệu dạng điện hoạt động (xung thần kinh) từ đểm tới các điểm khác hệ thần kinh Dây thần kinh thực tế là bó nhiều sợi trục, các sợi có thể chaỵ song song quấn lấy • Đầu tận cùng synap: đầu mút sợi trục Đầu tận cùng synap có các túi nhỏ chứa chất truyền thần kinh hóa học Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 76 Nguyễn Hữu Trí Eo thắt Ranvier • Hỗn hợp gồm: photphoamin – lipid (như lecithil, số photpholipid, sphingomyelin), xerebrozit và ít cholesterol Myelin là chất tạo thành bao không liên tiếp bọc quanh trụ trục sợi thần kinh có myelin • Các tế bào Schwann bao quanh màng axon, phần màng chúng kéo dài quấn quanh sợi trục là bao myelin Các tế bào Schwann không phủ kín liên tục màng axon mà tế bào Schwann bao đoạn axon, khoảng cách các tế bào Schwann đó tạo thành eo thắt gọi là eo Ranvier 77 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc neuron Myelin 22/02/2016 11:56 CH 74 Nguyễn Hữu Trí • Khoảng cách các tế bào Schwann đó tạo thành eo thắt gọi là eo Ranvier đó không có bao myelin • Màng axon eo ranvier có khả dẫn điện, liên quan đến tượng lan truyền nhảy bậc 22/02/2016 11:56 CH 78 Nguyễn Hữu Trí 13 2/22/2016 Sợi nhánh Thân neuron • Thân neuron là thành phần chính neuron bao gồm nhân và bào tương (không kể các nhánh bào tương) • Thân neuron là trung tâm dinh dưỡng, thân neuron có khả tiếp nhận xung • Nhiễm sắc chất mịn và lan tỏa, phản ánh hoạt động tổng hợp mạnh các neuron • Thân neuron có lưới nội bào hạt phát triển xếp lại thành các khoang dài nằm song song với Khi nhuộm lưới nội bào hạt và các ribosom tự có thể nhìn thấy gọi là thể Nissl Bộ Golgi có thân neuron, bao gồm nhiều khoang dài xếp song song, có xuất nguồn từ lưới nội bào không hạt Các ti thể có nhiều gò sợi trục và rải rác bào tương thân neuron 22/02/2016 11:56 CH 79 Nguyễn Hữu Trí • Sợi nhánh (dendrite) thường ngắn và phân chia nhiều nhánh nhỏ giống cành cây Sợi nhánh có nhiều synap, nơi tiếp nhận và xử lý tín hiệu neuron Hầu hết các neuron có nhiều sợi nhánh giúp gia tăng diện tích tiếp nhận thông tin neuron Cấu trúc cây tận cùng (tương đương rễ tận cùng sợi trục) cho phép neuron tiếp nhận và liên hệ với nhiều đầu tận cùng sợi trục neuron khác • Đa số các synap gắn vào neuron diện các gai sợi nhánh (dendrite pine) (tương đương cúc tận cùng sợi trục) 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 80 Sợi trục • Hầu hết các neuron có sợi trục Một số neuron có sợi trục ngắn, đa số neuron có sợi trục dài Tất sợi trục có đoạn gốc xuất phát từ thân neuron, có hình tháp, gọi là gò sợi trục (axon hillock) Màng bào tương sợi trục bao quanh bào tương sợi trục (axoplasm) • Khác với sợi nhánh, sợi trục có đường kính ổn định và thường không chia nhiều nhánh Tất nhánh sợi trục gọi là nhánh bên (collateral branch) Sợi trục không có lưới nội chất hạt nên phải phụ thuộc vào thân neuron để tồn • Sợi trục dẫn luồng thần kinh từ thân tế bào để truyền sang tế bào khác 22/02/2016 11:56 CH 81 Nguyễn Hữu Trí Tế bào Schwann Axon Khe Ranvier Bao Myelin Đầu tận cùng synapse 22/02/2016 11:56 CH Nguyễn Hữu Trí 82 Neuron đơn cực Unipolar Neuron Phân loại theo kích thước và hình dạng Thân tế bào • Dựa vào hình dạng và kích thước neuron chia làm loại: • Neuron có điểm xuất phát sợi thần kinh mọc từ thân tế bào, tế bào này có đoạn chung sợi trục và sợi nhánh nên ta có cảm giác là cực Là neuron cảm giác • Một nhánh bào tương (sợi nhánh) cho đầu tận cùng đến thần kinh ngoại biên Một nhánh (sợi trục) vào thần kinh trung ương • Các neu ron loại này có các hạch tủy (hạch cảm giác rễ sau các dây thần kinh tủy) ; loại neuron này có hầu hết các hạch não  Neuron đơn cực  Neuron lưỡng cực  Neuron đa cực 22/02/2016 11:56 CH Axon Dendrite 83 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 84 Nguyễn Hữu Trí 14 2/22/2016 Neuron lưỡng cực Bipolar Neuron Dendrite Thân tế bào Neuron đa cực (Multipolar Neuron) Thân tế bào Axon Axon • Neuron có hai điểm xuất phát sợi thần kinh mọc từ thân tế bào, sợi trục và nhánh còn lại là sợi nhánh Không myelin hóa, đóng vai trò quan trọng các giác quan • Neuron hai cực có các hạch ốc tai và hạch tiền đình, võng mạc thị giác và niêm mạc khứu giác 22/02/2016 11:56 CH 85 Nguyễn Hữu Trí Phân loại theo chức Dendrites • Neuron có nhiều điểm xuất phát sợi thần kinh mọc từ thân tế bào, đó có sợi trục, còn các nhánh bào tương khác là sợi nhánh (dendrite) 22/02/2016 11:56 CH 86 Nguyễn Hữu Trí Phân loại dựa vào chức • Các sai khác vị trí và tỉ lệ các sợi nhánh và sợi trục giúp ta phân biệt các loại neuron Dựa vào chức người ta chia neuron làm ba loại:  Neuron vận động  Neuron cảm giác  Neuron trung gian 22/02/2016 11:56 CH 87 Nguyễn Hữu Trí Neuron vận động Motor (Efferent) Neuron • Còn gọi là các neuron đáp ứng • Là neuron dẫn xung thần kinh khỏi hệ thần kinh trung ương (CNS) đến gây co và tới tuyến làm tuyến tiết Điều khiển hoạt động các quan đích • Phản ứng kích thích chuyên hóa với mệnh lệnh mức cao từ não • Ở người có khoảng triệu neuron vận động 22/02/2016 11:56 CH 89 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 88 Nguyễn Hữu Trí Neuron cảm giác Sensory (Afferent) Neurons • Còn gọi là các neuron thụ cảm • Là các neuron dẫn luồng xung thần kinh hệ thần kinh trung ương (CNS) gọi là neuron hướng tâm • Mỗi neuron cảm giác nhận loại kích thích đặc biệt ánh sáng, áp lực, nhiệt độ, loại kích thích hóa học các sợi nhánh nhận làm biến đổi thành hoạt động điện, di chuyển theo sợi trục dạng xung thần kinh • Các tế bào thụ cảm các quan cảm giác không có sợi trục và chuyển thông tin tới các neuron cảm giác thật sự, các neuron nà mang thông tin đến các neuron trung gian đôi là neuron vận động 22/02/2016 11:56 CH 90 Nguyễn Hữu Trí 15 2/22/2016 Neuron trung gian Association or Interneuron • Nhận thông tin từ các neuron thụ cảm các neuron trung gian khác, xử lý thông tin và chuyển đến các neuron vận động • Neuron trung gian còn là nơi xảy các quá trình mức độ cao học tập và trí nhớ • Các neuron trung gian là nơi hợp hệ thần kinh • Khoảng 98% 100 tỷ tế bào hệ thần kinh người là các neuron trung gian 22/02/2016 11:56 CH 91 Nguyễn Hữu Trí Các tế bào thần kinh đệm Glial Cell • Là các tế bào thần kinh khác với neuron, chúng nằm hệ thần kinh trung ương (CNS), bao quanh các thân neuron, sợi trục và sợi nhánh có nhiệm vụ nâng đỡ, dinh dưỡng và bảo vệ các neuron • Ở động vật có vú, các tế bào thần kinh đệm có số lượng gấp 10 lần neuron • Người ta cho chúng còn tham gia vào quá trình tích lũy và xử lý thông tin (trí nhớ) • Chúng gồm hai loại lớn: Các tế bào đệm lớn (Macroglia) và các tế bào đệm nhỏ (Microglia) 22/02/2016 11:56 CH Các tế bào đệm lớn (Macroglia) 92 Nguyễn Hữu Trí Astrocyte Các tế bào đệm hình sao: Astrocyte • Có dạng hình có nhiều nhánh bào tương • Có nhiều chức • Điều chỉnh môi trường hóa học xung quanh các neuron hệ đệm • Trao đổi chất các mao mạch và các neuron • Vận chuyển các chất dinh dưỡng 22/02/2016 11:56 CH 93 Kích thước lớn và có số lượng nhiều Nguyễn Hữu Trí Các tế bào đệm lớn (Macroglia) Tế bào đệm ít nhánh: Oligodendroglia 22/02/2016 11:56 CH 94 Nguyễn Hữu Trí Oligodendrocyte • Nhỏ astrocyte • Oligodendrocytes tổng hợp bao myelin có tác dụng cách điện số neuron CNS • Các tế bào ít nhánh cho các nhánh bào tương mình bao quanh lấy sợi trục, tạo nên bao myelin 22/02/2016 11:56 CH 95 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 96 Nguyễn Hữu Trí 16 2/22/2016 Các tế bào đệm nhỏ (Microglia) • Có nguồn gốc từ lá phôi • Các tế bào có hình trứng, các sợi nhánh mảnh và phức tạp Nhỏ nhất, có khả đại thực bào, số lượng tăng có tổn thương và viêm • Kiểm tra tình trạng các neuron là loại đại thực bào mô thần kinh, trực thuộc hệ thực bào đơn nhân, có tiền thân là mono bào tủy xương • Đặc biệt là có khả thực bào các vi sinh vật và các mảnh vỡ mô • Hệ thống tế bào miễn dịch không chịu điều khiển CNS, liên quan đến hoạt động viêm và sữa chữa hệ thần kinh người trưởng thành 22/02/2016 11:56 CH 97 Các tế bào đệm nhỏ (Microglia) Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 98 Nguyễn Hữu Trí Tế bào hỗ trợ PNS Tế bào Schwann Tế bào Ependymal • Lót ống nội tủy và thành các não thất • Một số vùng có lông • Một số biệt hóa để tiết dịch não tủy • Hình thành nên bao myelin bao quanh sợi trục (axon) PNS • Có chức giống tế bào ít nhánh là tạo bao myelin song có thần kinh ngoại biên Một tế bào Schwann tạo bao myelin cho đoạn sợi trục, khác với tế bào ít nhánh có vài nhánh bao lấy nhiều sợi trục 22/02/2016 11:56 CH 99 Nguyễn Hữu Trí 22/02/2016 11:56 CH 100 Nguyễn Hữu Trí 17 Chương Đại phân tử (Polymer) Cấu trúc và chức các Đại phân tử Sinh học 21/02/2016 3:24:33 CH Monomer: Mono = một; mer = đơn vị  Đại phân tử là gì? Poly = nhiều; mer = đơn vị Một polymer là phân tử lớn chứa nhiều đơn vị (monomer) nhỏ liên kết với Nguyễn Hữu Trí Monosaccharide Các đại phân tử sinh học quan trọng - Dạng đơn phân chứa – C là phổ biến tế bào - Đơn phân thường có sườn cấu trúc chung, khác các nhóm và vị trí khoâng gian cuûa nhoùm OH- maïch carbon - Protein (55%) - Nucleic acid (23,6%) DNA 3,1%; RNA 20,5%) - Lipid (9,1%) - Polysaccharide (5%) 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:24:33 CH Polysaccharide Nguyễn Hữu Trí Polysaccharide - Liên kết các đơn phân là liên kết glycoside - Các polysaccharide khác khác hướng liên kết glycoside (, ), khác đơn phân, khác tổ hợp các loại đơn phân - Caùc polysaccharide quan troïng cellulose, glycogen, tinh boät, chitin Lạp thể Tinh bột Ti thể Hạt glycogen 0.5 m m Glycogen Amylose 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:24:33 CH Amylopectin Nguyễn Hữu Trí Polysaccharide Sợi cellulose vách tế bào Vi sợi Vách tế bào] Khoảng 80 phân tử cellulose liên kết để hình thành vi sợi, cấu trúc chính vách tế bào Polysaccharide  Chitin, polysaccharide quan trọng khác – Được tìm thấy xương ngoài động vật chân đốt – Có thể sử dụng khâu phẫu thuật 0.5 m CH2O H O OH H OH H OH H Tế bào thực vật H OH CH2OH OH CH2OH O O O O OH OH OH OH O O O O O O CH OH OH CH2OH H CH2OH OH CH2OH OH O O O OH O OH OH OH O O O O O O CH OH OH CH2OH H CH2OH OH OH CH2OH O O O OH O OH OH O O OH O O O O CH OH OH CH2OH H Liên kết hai phân tử cellulose song song là cầu nối hydrogen nguyên tử carbon và Phân tử Cellulose O CH3 monomer NH C Một phân tử cellulose là polymer -glucose không phân nhánh  Glucose 21/02/2016 3:24:33 CH H 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí Lipid Chức Polysaccharide  Polysaccharide có chức chính: Dự trữ lượng: tinh bột là chất dự trữ lượng chính thực vật động vật là glycogen Cấu trúc: cellulose, thành phần chính vách tế bào thực vật, là polymer dồi dào trên trái đất Chitin, là polymer dồi dào thứ hai trên trái đất, là thành phần cấu tạo nên lớp vỏ ngoài động vật chân đốt, giáp xác, nhện, là vách tế bào số loại nấm 21/02/2016 3:24:33 CH Thaønh phaàn quan troïng cuûa maøng Lipid ñôn giaûn: triglyceride Lipid phức tạp: có chứa P, N, S, các nhóm đường, ethanol amine, serine, choline Phospholipid quan troïng caáu truùc maøng Steroid, saùp… Chất béo chưa bão hòa CH2 3 10 O Nguyễn Hữu Trí Lipid  Steroid, cholesterol – Được tìm thấy trên màng tế bào HC – Là tiền chất vài loại hormones CH3 Choline CH2 O– Chất béo bão hòa Cầu nối đôi Lipid O P Stearic acid Oleic acid 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc Phospholipid Gồm đầu ưa nước và đuôi kị nước + N(CH ) Nguyễn Hữu Trí CH3 CH3 Phosphate O CH2 CH O O C O C CH2 Glycerol CH3 O  Sáp Acid béo Hydrophilic head Hydrophobic tails (a) Structural formula 21/02/2016 3:24:33 CH (b) Space-filling model 11 HO – Là loại lipid tìm thấy vỏ bao bên ngoài thực vật bao bọc động vật (c) Phospholipid symbol Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:24:33 CH 12 Nguyễn Hữu Trí Protein Amino acid - Cấu tạo chuỗi các amino acid nối với liên kết peptide - Hai möôi amino acid khaùc veà tính chaát hoùa hoïc cuûa caùc nhaùnh bên phân tử - Đặc tính đa dạng các protein trình tự amino acid H H3N+ CH3 O H3 C C H Glycine (Gly) O– N+ C H3N+ C H Alanine (Ala) O– CH CH3 CH3 O C CH2 CH2 O H3N+ C H Valine (Val) CH3 CH3 CH3 CH3 O– C O C H Leucine (Leu) H3C CH N+ C H3 O– O C O– H Isoleucine (Ile) Không phân cực CH3 CH2 S +H N NH CH2 Amino end CH2 Amino acid subunits H3N+ C pleated sheet CH2 O H3N+ C O– H 13 OH C + H3N C C + O– H Serine (Ser) O C CH2 H3N + O– H C CH2 O H3N C H O– CH2 O H3N C C + O– H CH2 CH2 O H3N C + O– H Tyrosine (Tyr) Cysteine (Cys) Threonine (Thr) C + C O– H C O– Tryptophan (Trp) 14 O C Proline (Pro) Nguyễn Hữu Trí C O C O– H Glutamine (Gln) Asparagine (Asn) - Phân tử protein có bốn cấp độ cấu trúc: + Cấu trúc bậc là trình tự các amino acid + Cấu trúc bậc hai hình thành các vòng xoắn các phiến bên sợi polypeptide liên kết hydrogen + Cấu trúc bậc ba là cấu trúc uốn khúc nhiều các liên kết không cộng hóa trị cộng hóa trị (liên kết –SH) + Cấu trúc bậc bốn là kết hợp nhiều phân tử polypeptide Basic | | S Acidic S | O H3N NH2 O C NH2 O C SH CH3 CH CH2 H2N O Protein OH OH CH H 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí C O– H Amino acid Phân cực H3N+ C Phenylalanine (Phe) Methionine (Met) 21/02/2016 3:24:33 CH C CH2 O H2C O– CH CH C H H3N + O C H O– H3N + C 21/02/2016 3:24:33 CH Glutamic acid (Glu) Lysine (Lys) 15 + H3N + H C O– O C O C H CH C O– H3N CH O H Aspartic acid (Asp) CH CH C | O C S | + NH CH | S H3N NH+ NH2 C NH2+ CH CH C O– Arginine (Arg) Nguyễn Hữu Trí | S | S S | S | | Histidine (His) | | C CH C CH Tích điện NH3+ CH O S | O– O | S –O Xoăn tự nhiên Tóc thẳng 21/02/2016 3:24:33 CH 16 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc bậc Chức Protein GlyPro Thr Gly Cấu trúc: Bao gồm keratin (protein tóc và móng) và collagen (protein mô liên kết) Duy trì các cấu trúc quan Xúc tác: Các enzyme xúc tác các phản ứng hoá học chuyên biệt với tốc độ nhanh gấp nhiều lần bình thường +H N Amino end Thr Amino acid subunits Gly Glu CysLysSeu LeuPro Met Val Lys Val Leu Asp AlaValArgGly Ser Pro Ala Bảo vệ: Các kháng thể (antibody) có khả phát và loại bỏ các yếu tố ngoại lai xâm nhập, báo động hệ miễn nhiểm Vận chuyển: các protein màng vận chuyển các chất xuyên màng, protein máu hemoglobin, vận chuyển oxygen, sắt, và các chất khác GluLle Asp Thr Lys Ser Lys Trp Tyr LeuAla Gly lle Ser ProPheHisGlu His Ala Glu Val Ala ThrPheVal Asn lle Thr Ala Tyr Arg Asp Co bóp: các sợi actin và myosin tìm thấy vân Ser Arg GlyPro Thr Tính hiệu: là các hormone insulin điều hòa lượng đường máu SerTyr Pro SerTyr Ala Leu Leu Ser Thr Ala Val Val LysGlu Thr AsnPro o c o– Carboxyl end 21/02/2016 3:24:33 CH 18 Nguyễn Hữu Trí Tấm  Amino acid O H H C C N C N H R O H H R C C N O H H O H H O H H R C C N C C N R C C N N C C N C C R R C C R OH H OH H O R R O C H O C H H O H C N HC N C N HC N C H H C O C O R R R R H H C C O C O C N H N H N H O C O C H C R H C R H C R H C R N H O C N H O C O C O C N H N H C C R R N C R O C H H NH C N C H C O R Cấu trúc bậc Cấu trúc bậc R C H N HC N H O C Liên kết hydrogen H Xoắn  CH CH22 CH O H H3C H3C O Tương tác kỵ nước và van der Waals CH3 CH3 CH Polypeptide backbone HO C CH2 CH2 S S CH2 Cầu disulfide O CH2 NH3+ -O C CH2 Liên kết Ion Liên kết yếu: Liên kết hydrogen cực chuỗi Liên kết ionic chuỗi tích điện Liên kết kỵ nước và trương tác van der Waals Liên kết mạnh: Cầu nối disulfide hình thành từ liên kết cộng hóa trị 21/02/2016 3:24:33 CH 19 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí 20 Nguyễn Hữu Trí Nucleic acid Cấu trúc bậc - DNA vaø RNA - Được tạo thành từ các đơn phân nucleotide - Một phân tử nucleotide gồm đường, phosphate vaø base nitric - DNA và RNA khác thành phần đường nucleotide Nucleoside Nitrogenous base O  O P O 5’C CH2 O  O Phosphate group Kết tương tác hay nhiều các chuỗi polypeptide 3’CPentose sugar Nucleotide 21/02/2016 3:24:33 CH 21 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí Nucleic acid Nguyễn Hữu Trí 22 Cấu trúc DNA  DNA là chuỗi xoắn kép cấu tạo gồm - Liên kết cộng hóa trị các nhóm đường và phosphate hai nucleotide keà taïo thaønh khung đường phosphate - Trình tự các base (A, T, G, C, U) boä khung quyeát ñònh ñaëc trưng phân tử nucleic acid - DNA có cấu trúc mạch đôi gắn với liên kết hydrogen A - T vaø G - C Hai maïch coù trình tự bổ sung cho - RNA chæ coù maïch ñôn 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí – phân tử đường – Nhóm phosphat – Một base (A,C,G,T)  DNA luôn luôn tổng hợp theo chiều 5’ P - 3’ OH quá trình chép 5’ ATTTAGGCC 3’ 3’ TAAATCCGG 5’ 23 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí 24 Chức các Nucleotide  Monomer cho các Nucleic Acid  Vận chuyển lượng hóa học từ phân tử đến phân tử khác (ví dụ ATP) Nhiễm Sắc Thể: Nơi chứa phân tử DNA 21/02/2016 3:24:33 CH Tính chọn lọc đồng phân quang học heä thoáng soáng 27 Nguyễn Hữu Trí Liên kết cộng hóa trị Liên kết hydrogen Tương tác kỵ nước Lực Van der Waals 21/02/2016 3:24:33 CH Liên kết cộng hóa trị Được tạo góp chung điện tử các nguyên tử Hydrogen atoms (2 H) 26 Caùc lieân keát hoùa hoïc heä thoáng sinh hoïc - Đồng phân quang học (đồng phân lập thể, stereoisomer): diện phân tử có nguyên tử C chứa bốn nhóm khác nhau; là ảnh qua göông cuûa - Đồng phân D đường, đồng phân L amino acid chiếm ưu heä thoáng soáng 21/02/2016 3:24:33 CH Nguyễn Hữu Trí 28 Nguyễn Hữu Trí Liên kết hydrogen Liên kết hydrogen có xu hướng hình thành các nguyên tử có điện âm với nguyên tử Hydro gắn với Oxygen hay Nitrogen + + d– O H + + d+ H Water (H2O) d+ d– Ammonia (NH3) + 21/02/2016 3:24:33 CH Hydrogen molecule (H2) 29 N H d+ + Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:24:33 CH H H d+ d+ 30 Nguyễn Hữu Trí Liên kết Van der Waals Xảy các phân tử gần kề tương tác các đám mây điện tử 21/02/2016 3:24:33 CH 31 Nguyễn Hữu Trí Tương tác kỵ nước Xảy các nhóm phân tử không phân cực Chúng có xu hướng xếp kề và không tan nước 21/02/2016 3:24:33 CH 32 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 DNA là vật liệu di truyền Chương Quá trình chép DNA 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí Thí nghiệm biến nạp Griffith Tế bào S sống (control) Tế bào R sống (control) Tế bào S chết (control) Trộn tế bào S chết và tế bào R sống  Bằng chứng 1: Thí nghiệm chứng minh có biến nạp vi khuẩn, 1928  Bằng chứng 2: Thí nghiệm chứng minh DNA là nhân tố biến nạp, 1944  Bằng chứng 3: Thí nghiệm chứng minh vật liệu di truyền phage T2 là DNA, 1952 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí Năm 1944 nhóm Avery, McCarty, McLeod xác định rõ nguyên nhân gây biến nạp là gì? → DNA là nhân tố biến nạp KẾT QUẢ Chuột bị chết Chuột sống Chuột sống Chuột bị chết Avery kết luận DNA là vật liệu di truyền Tế bào S sống tìm thấy mẫu máu 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí 1952 – Alfred Hershey và Martha Chase kết luận vật liệu di truyền phage T2 là DNA 21/02/2016 3:25:51 CH Oswald T Avery Nguyễn Hữu Trí 1953 James D Watson và Francis H C Crick công bố cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA James Watson và Francis Crick Hershey và Chase khẳng định DNA là vật liệu di truyền 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 DNA là vật liệu di truyền Cấu trúc xoắn kép DNA (Double helix structure of DNA) Vật chất di truyền thể sinh vật có nhiệm vụ truyền lại tính trạng từ đời trước xong đời sau, trên nguyên tắc:  Vật chất này phải có tính bền vững thông tin cấu trúc, chức năng, phát triển và sinh sản tế bào  Có khả tự tái cách chính xác cho tế bào có thông tin di truyền giống tế bào mẹ  Có khả thay đổi, giúp sinh vật biến dị, thích ứng, và tiến hóa 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí Đặc điểm cấu trúc xoắn kép DNA  Phân tử DNA có hai chuỗi dây polynucleotide quấn theo chiều tay phải Hai dây này đối xứng nhau, cùng song hành theo cặp base tương ứng, theo qui ước đầu 5’ là gốc, đầu 3’ là đuôi Dây còn gọi là dây xương sống hình thành đường và photphase với base đính hai bên dây Nguyễn Hữu Trí Tính ổn định và biến động DNA  Tính ổn định DNA là kết hai quá trình: chép và sửa sai  Các biến đổi DNA: đột biến, tái tổ hợp, các gen nhảy 21/02/2016 3:25:51 CH 11 Nguyễn Hữu Trí Đặc điểm cấu trúc xoắn kép DNA • Những base này trên hai dây đối xứng nối liền cầu nối hydrogen: A-T và G-C Cầu nối hydrogen dễ bị tách (ví dụ nhiệt độ cao) để tạo thành hai dây đơn Cặp base tương ứng A-T và C-G gọi thuật ngữ chuyên môn là “complement base pair” Nối C-G (3 cầu nối) bền nối A-T (2 cầu nối) • Các cặp base cách 0,34 nm trên dây xoắn DNA Mỗi góc quay hoàn toàn (360o) dây xoắn (helix) có độ dài 3,4 nm Do đó, đoạn xoắn có tất 10 cặp base Đường kính góc quay là 2nm • Kết cấu trúc dây xoắn kép tạo rãnh chính (major groove) và rãnh phụ (minor groove) Cả hai rãnh này có kích thước đủ rộng cho phép phân tử protein tiếp xúc với base - Chuỗi xoắn kép cho phép các base purine và pirimidine có cấu trúc phẳng xếp chồng khít lên bên phân tử DNA, hạn chế tiếp xúc chúng với nước Chúng đính thẳng góc với dây xoắn - Các nguyên tử đường và các nhóm phosphate xoay ngoài hình thành liên kết với nước đảm bảo tính ổn định cho phân tử 21/02/2016 3:25:51 CH 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH 10 Nguyễn Hữu Trí Tính ổn định DNA  Cơ chế chép bán bảo tồn  Các chế sửa sai DNA 21/02/2016 3:25:51 CH 12 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Thí nghiệm Meselson và Stahl Sự chép DNA có tính chất bán bảo tồn Tổng quan chép DNA  Chuỗi xoắn kép DNA bao gồm mạch bắt cặp bổ sung  Mỗi mạch có thể làm để tổng hợp nên mạch – Cách thức tái gọi là mô hình bảo thủ nửa (semiconservative) – Một mạch tổng hợp liên tục, mạch tổng hợp không liên tục (các đoạn ngắn sau đó nối lại) gọi là chép bán liên tục – Cần mồi DNA primer Đồng vị nặng Nitơ (không phải đồng vị phóng xạ) dùng thí nghiệm này 21/02/2016 3:25:51 CH 13 Nguyễn Hữu Trí Sự chép DNA  Một mạch chép liên tục hướng vào ngã ba chép (replicating fork)  Một mạch chép không liên tục tạo các đoạn 1-2 kb Okazaki theo hướng ngược lại (hướng khỏi ngã ba chép)  Điều này đảm bảo hai mạch chép theo đúng chiều 5’3’ 21/02/2016 3:25:51 CH 14 Nguyễn Hữu Trí Ngã ba chép • Sự chép DNA diễn vị trí ngã ba chép (replication fork) • Đây là quá trình: – Theo hướng – chĩa ba chép di chuyển theo hướng cái còn lại thì cố định origin – Theo hai hướng – hai chĩa ba di chuyển theo hai hướng ngược từ origin • Hầu hết chép vi khuẩn và tế bào eukaryote là theo hai hướng 21/02/2016 3:25:51 CH 15 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc chép có dạng theta “q” • DNA bắt đầu chép với tạo thành “bubble” – vùng nhỏ nơi chuổi gốc (template) tách và DNA đã tổng hợp • DNA tách mạch điểm khởi đầu chép (ORI) Mỗi mạch đóng vai trò làm khuôn để tổng hợp mạch bổ sung • Ngã ba chép (Replication fork) di chuyển theo hai hướng ngược tạo cấu trúc giống kí tự theta (q) • Sau quá trình chép hoàn tất hai mạch tách 21/02/2016 3:25:51 CH 17 21/02/2016 3:25:51 CH 16 Nguyễn Hữu Trí Sự chép DNA prokaryote và eukaryote Origin (ORI) là điểm cố định nơi bắt đầu quá trình chép Replicon là đơn vị chép Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH 18 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Sự chép DNA prokaryote và eukaryote E coli DNA Polymerases Sự chép DNA vi khuẩn: nhiễm sắc thể là replicon • Có ba loại DNA polymerase E coli: – pol I – pol II – pol III • E coli DNA polymerase I xác định đầu tiên Nó khám phá năm 1958 Arthur Kornberg Sự chép tiến hành đồng thời nhiều điểm trên phân tử DNA eukaryote 21/02/2016 3:25:51 CH 19 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH • DNA polymerase • 3’5’ exonuclease • 5’3’ exonuclease Nguyễn Hữu Trí Phần Klenow (Klenow Fragment) DNA Polymerase I • DNA polymerase I (pol I) là enzyme linh hoạt với hoạt tính: 20 Có chức năng: Polymerase và hoạt tính 3’5’ exonuclease giúp nó có khả đọc ngược (proofreading) – – – – Nếu pol I thêm nt sai, bắt cặp các base không đúng Pol I dừng lại, exonuclease loại bỏ nt không bắt cặp Cho phép quá trình chép tiếp tục Làm tăng tính trung thực quá trình chép – Xử lý thủy phân nhẹ cho polypeptide • Phần Klenow • Phần nhỏ 21/02/2016 3:25:51 CH 21 Nguyễn Hữu Trí 5’3’ exonuclease • Hoạt tính này cho phép pol I cắt đầu chuỗi DNA hình thành • Loại bỏ và thay chuỗi nó qua • Là chức khi: 21/02/2016 3:25:51 CH 22 Nguyễn Hữu Trí Polymerases II và III  Hoạt tính Pol II không liên quan đến chép DNA  Pol I có vai trò chủ yếu sửa sai  Chỉ có pol III là cần đến cho quá trình chép DNA  Pol III là enzyme chép vi khuẩn – Loại bỏ primer – Sửa chữa cho đứt (nick) 21/02/2016 3:25:51 CH 23 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH 24 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Enzyme Pol III hoàn chỉnh Sự trung thực chép cần thiết cho sống Bộ máy chép DNA đã thiết lập hệ thống sửa sai (proofreading system)  Pol III core tạo thành tiểu đơn vị : – Hoạt tính DNA polymerase nằm trên tiểu đơn vị a – Hoạt tính 3’5’exonuclease tìm thấy trên tiểu đơn vị  – Vai trò tiểu đơn vị q chưa rõ – Hoạt tính DNA-dependent ATPase nằm trên phức hợp g chứa tiểu đơn vị – Hệ thống này cần mồi – Chỉ nucleotide bắt cặp bổ sung làm mồi cho pol III hoàn chỉnh – Nếu nucleotide sai thì quá trình chép ngừng lại hoạt tính 3’5’ exonuclease enzyme pol III hoàn chỉnh loại bỏ nó  Cuối cùng, tiểu đơn vị b thêm vào tạo thành enzyme hoàn chỉnh (holoenzyme) 21/02/2016 3:25:51 CH Tính trung thực quá trình chép 25 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH  Quá trình DNA chép cho thấy mạch DNA ngã ba chép bị tách mạch Không xảy tự động DNA polymerase làm công việc nó – Polymerase d và a có vai trò tham gia chép trên hai mạch DNA – Pol a đóng vai trò việc khởi đầu trổng hợp DNA – Kéo dài hai mạch thực pol d 21/02/2016 3:25:51 CH – mạch liên kết chặt với – Cần tốn lượng và hoạt động enzyme để tách chúng – Helicase làm tách mạch dsDNA ngã ba chép mã hóa gene E coli dnaB 27 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH  Ở prokaryote ssDNA-binding proteins gắn chặt với ssDNA với dsDNA – Nhờ hoạt động helicase giúp hình thành ssDNA – Giữ cho hai mạch không bắt cặp trở lại  Bằng cách bọc ngoài ssDNA, SSBs giữ cho nó khỏi bị phân hủy  SSBs cần thiết cho quá trình chép DNA prokaryote 29 Nguyễn Hữu Trí 28 Nguyễn Hữu Trí Topoisomerases Single-Strand DNA-Binding Proteins 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí Sự tách mạch Các DNA Polymerase eukaryote Tế bào động vật có vú chứa DNA polymerase khác 26 Chuỗi DNA tách gọi là “unzipping” o DNA không thật giống dây kéo thẳng mà là chuỗi xoắn đối song song o Khi mạch DNA tách ra, mạch này quay vòng quanh mạch Helicase có thể tự mình tách và giữ hai mạch DNA là thẳng và ngắn, DNA dạng vòng nảy sinh vấn đề o Khi DNA tháo xoắn vị trí thì làm xoắn vị trí khác 21/02/2016 3:25:51 CH 30 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Cơ chế hoạt động Helicase • Khi helicase hoạt động nó gắn với “initiator” và lôi chúng vào DNA tái • Helicase có nhiệm vụ mở xoắn và tách dây đôi thành dây đơn cách sử dụng lượng từ quá trình phân giải ATP • Sự phân giải ATP làm thay đổi trạng thái helicase, tạo điều kiện để enzyme di chuyển dọc theo dây DNA để mở xoắn 21/02/2016 3:25:51 CH 31 Nguyễn Hữu Trí Sự khởi đầu (Initiation)  Khởi đầu quá trình chép DNA là quá trình tổng hợp primer  Primosome dùng để tập hợp các protein cần thiết cho tổng hợp primer cho quá trình chép DNA  Tổng hợp primer E coli đòi hỏi primosome gồm có: o DnaB DNA helicase o DnaG Primase 21/02/2016 3:25:51 CH 32 Nguyễn Hữu Trí Primosome Primer E coli  Primosome hình thành ORI, trường hợp E coli với nhiễm sắc thể vòng tròn, điểm gốc chép gọi là oriC (245bp)  Vùng OriC bao gồm hai nhóm trình tự lặp lại với (N là base bất kỳ) o trình tự lặp lại liên tiếp gồm 13 cặp base GATCTNTTNTTTT o trình tự lặp lại phân tán với cặp baseTTATNCANA 21/02/2016 3:25:51 CH 33 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH Khởi đầu chép E coli 34 Nguyễn Hữu Trí Replisome Primosome hình thành oriC xảy sau: – DnaA gắn vào oriC vị trí gọi là dnaA box và phối hợp với HU protein tách đoạn DNA kế cận phía trái dnaA box – DnaB gắn vào phức hợp mở và tạo thuận tiện cho primase gắn vào để hoàn thành primosome – Primosome gắn replisome (là hệ thống các enzyme máy chép), lập lại việc tổng hợp primer cho các đoạn Okazaki tổng hợp trên mạch chậm (lagging strand) – DnaB có hoạt tính helicase giúp tháo xoắn DNA replisome tiến hành 21/02/2016 3:25:51 CH 35 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH 36 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Sự khởi đầu chép E.coli Sự khởi đầu (Initiation) Nhóm enzyme helicase có nhiệm vụ tách mạch Chúng bám lên mạch đơn, cắt đứt liên kết hidro mạch đôi Chúng sử dụng lượng từ quá trình phân giải ATP 21/02/2016 3:25:51 CH 37 Nguyễn Hữu Trí Chĩa ba chép (Replication fork) 21/02/2016 3:25:51 CH 38 Nguyễn Hữu Trí Kéo dài (Elongation)  Khi primer tổng hợp quá trình tổng hợp DNA thực bắt đầu  Một cách kết hợp hài hòa quá trình tổng hợp mạch sau(lagging) và mạch trước (leading) giữ holoenzyme pol III bám chặt với dây  Sao chép là quá trình diễn nhanh 21/02/2016 3:25:51 CH 39 Nguyễn Hữu Trí Tốc độ chép • In vitro enzyme pol III tổng hợp DNA với tốc độ khoảng 730 nt/giây, in vivo tốc độ này khoảng 1000 nt/giây • Đây là enzyme có tốc độ tổng hợp cao in vitro và in vivo 21/02/2016 3:25:51 CH 41 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH 40 Nguyễn Hữu Trí Pol III Holoenzyme và quá trình chép • Pol III core có khả polymerase yếu, sau tổng hợp khoảng 10 nt nó bị tách khỏi dây (template) • Như core enzyme thiếu yếu tố – Đó là tác nhân diện trên holoenzyme cho phép nó liên kết chặt với template – Tác nhân đó là “kẹp trượt”, tiểu đơn vị b-của enzyme hoàn chỉnh (holoenzyme) 21/02/2016 3:25:51 CH 42 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Vai trò tiểu đơn vị b • Core thêm tiểu đơn vị b có thể chép DNA tốc độ cao khoảng 1,000 nt/giây Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) – Dimer hình thành tiểu đơn vị b có dạng vòng (ringshaped) – Vòng này bao quanh DNA template – Tương tác với tiểu đơn vị a core để kết hợp toàn polymerase và template với • Holoenzyme giữ nó trên dây nhơ vào kẹp b • Yếu tố giữ cho quá trình chép Eukaryote là PCNA hình thành trimer, có dạng vòng bao quanh DNA và giữ DNA polymerase trên template 21/02/2016 3:25:51 CH 43 Nguyễn Hữu Trí Yếu tố giúp gắn “kẹp” 21/02/2016 3:25:51 CH 44 Nguyễn Hữu Trí Kẹp b và Loader • Tiểu đơn vị b cần trợ giúp phức hợp g để gắn vào DNA template – Phức hợp g này hoạt động xúc tác việc việc hình thành phức hợp adb – Nó không liên kết với phức hợp suốt quá trình chép • Quá trình gắn “kẹp” là quá trình sử dụng ATP – Năng lượng từ ATP thay đổi hình dạng tiểu đơn vị d giúp nó gắn với tiểu đơn vị b – Việc gắn này cho phép mở “kẹp” và bao quanh DNA 21/02/2016 3:25:51 CH 45 Nguyễn Hữu Trí Kẹp b và Loader Source: Adapted from Ellison, V and B Stillman, Opening of the clamp: An intimate view of an ATP-driven biological machine Cell 106(2001), p 657, f 21/02/2016 3:25:51 CH Source: Adapted from Henderson, D.R and T.J Kelly, DNA polymerase III: Running rings around the fork Cell 84:6, 1996 46 Nguyễn Hữu Trí Sự tổng hợp mạch sau • Pol III holoenzyme là enzyme có đầu, đây có core polymerases gắn tiểu đơn vị t với phức hợp g • Một core chịu trách nhiệm tổng hợp liên tục mạch trước (leading strand) • Một core khác thực việc tổng hợp gián đoạn mạch sau (lagging strand) – Phức g trì clamp loader để gắn kẹp b vào primer trên DNA template – Sau load, kẹp b không còn ái lực với g complex mà lại liên kết chặt với core polymerase 21/02/2016 3:25:51 CH 47 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH 48 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Sự chép DNA Sự tổng hợp đồng thời • Phức hợp g và kẹp b giúp core polymerase tổng hợp nhanh đoạn Okazaki • Khi đoạn này tổng hợp xong, kẹp b ái lực với core • Hình thành liên kết kẹp b với g complex với hoạt động tháo kẹp (unload clamp) • Sau đó lại bắt đầu chu kì 21/02/2016 3:25:51 CH 49 21/02/2016 3:25:51 CH Nguyễn Hữu Trí 50 Nguyễn Hữu Trí Sự tổng hợp đồng thời Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Figure 5-19b,c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) DNA polymerase I Sao chép mạch sau – Loại bỏ mồi RNA và tổng hợp DNA thay DNA polymerase I 5 3 3 ligase 5 5 growing 3 replication fork RNA 5 3 Source: Adapted from Henderson, D.R and T.J Kelly, DNA polymerase III: Running rings around the fork Cell 84:7, 1996 21/02/2016 3:25:51 CH 53 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:51 CH 54 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Kết thúc (Termination) DNA polymerase I 5 3 3 5 5 growing 3 replication fork DNA polymerase III RNA 5 3 21/02/2016 3:25:51 CH 55 Nguyễn Hữu Trí Kiểu chép vòng xoay • Trong quá trình chép vi khuẩn – replication fork tiến đến vùng kết thúc – Có chứa vị trí 22-bp terminator liên kết với protein đặc hiệu (terminus utilization substance, TUS) – Replicating fork vào vùng kết thúc chép và dừng lại – Tách rời hai mạch dính vào không tế bào không phân chia 21/02/2016 3:25:51 CH 56 Nguyễn Hữu Trí Sao chép vòng xoay • DNA dạng vòng có thể chép theo chế vòng xoay (rolling circle replication) – Một sợi dsDNA bị cắt (nick) và đầu 3’ mở – Sử dụng mạch DNA còn nguyên là DNA template – Đầu 5’ bị tách Sao chép vòng xoay (Rolling circle) là kiểu chép DNA các DNA mạch vòng (circular template) mà mạch khuôn chép nhiều lần (copied many times) 21/02/2016 3:25:51 CH 57 Nguyễn Hữu Trí Kiểu chép vòng xoay Phage l • Phage X174 chép xoay vòng vì chép đủ chiều dài, chuổi vòng đơn DNA tách • Phage l, chuỗi tách sử dụng là template cho chép gián đoạn, mạch lagging 21/02/2016 3:25:51 CH 58 Nguyễn Hữu Trí TÍNH BIẾN ĐỘNG CỦA DNA • Khi vòng tròn xoay qua phải – Mạch liên tục (leading strand) tiếp tục kéo dài – Mạch gián đoạn (lagging strand) kéo dài cách gián đoạn • Dùng mạch liên tục không xoay làm template • RNA primer dùng tổng hợp đoạn Okazaki • Các dsDNA tổng hợp tạo thành nhiều gen trước DNA bị cắt 21/02/2016 3:25:51 CH 59 Nguyễn Hữu Trí • ĐỘT BIẾN VÀ SỬA SAI • GEN NHẢY • TÁI TỔ HỢP 21/02/2016 3:25:51 CH 60 Nguyễn Hữu Trí 10 21/02/2016 CÁC KHÁI NIỆM VỀ ĐỘT BIẾN • Đột biến là tiến trình đó chuỗi trình tự cặp base phân tử DNA bị thay đổi • Đột biến mức độ nhiễm sắc thể: là biến dị từ điều kiện bình thường làm thay đổi số lượng nhiễm sắc thể, cấu trúc nhiễm sắc thể, gây ảnh hưởng đến giới tính, nhiều tính trạng khác • Đột biến mức độ phân tử là đột biến chuỗi trình tự gen mức độ cặp base, còn gọi là đột biến gen, hay đột biến điểm vì nó thay đổi một, vài cặp base • Các loại hình đột biến điểm: đột biến chuyển vị, đột biến chuyển đổi, đột biến sai nghĩa, đột biến vô nghĩa, đột biến đồng nghĩa, đột biến chuyển dịch khung 21/02/2016 3:25:51 CH 61 Nguyễn Hữu Trí Các loại đột biến điểm ATGCCCGAAGTG TACGGGCTTCAC Đột biến chuyển đổi (transversion mutation) purine  pyrimidine pyrimidine  purine Đột biến chuyển vị (transition mutation) purine  purine pyrimidine  pyrimidine ATGCCCAAAGTG TACGGGTTTCAC ATGCCCTAAGTG TACGGGATTCAC Purines: A và G Pyrimidines: C và T 21/02/2016 3:25:52 CH 62 21/02/2016 3:25:52 CH 64 Nguyễn Hữu Trí Các loại đột biến điểm AAT DNA UUA mRNA Leu amino acid CUA Leu GUA Val AUA Ile UGA Stop 21/02/2016 3:25:52 CH UCA UUC UUG UUU UCA Ser Phe Leu Phe Ser UAA Stop 63 Nguyễn Hữu Trí Đột biến và biểu • Đột biến là thay đổi vật liệu di truyền tế bào • Đột biến tự phát có thể xảy suốt quá trình chép DNA, tái tổ hợp, sữa chữa • Đột biến các tác nhân vật lý hay hóa học có thể là nguyên nhân gây đột biến • Đột biến điểm là thay đổi cặp base gene • Đột biến điểm có thể gây ảnh hưởng đến cấu trúc và chức protein 21/02/2016 3:25:52 CH 65 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí Đột biến • Đột biến sai nghĩa (đột biến làm sai dây gốc, missense mutation): là đột biến gen đó cặp base thay đổi làm DNA tạo nên codon mRNA có amino acid không tương ứng chèn vào đại phân tử polypeptide • Đột biến đồng nghĩa (đột biến im lặng, silent mutation): thay đổi cặp base gen nào đó làm thay đổi codon mRNA, tạo codon amino acid không thay đổi • Đột biến vô nghĩa (đột biến kết thúc dịch mã, nonsense): là đột biến gen đó cặp base thay đổi làm DNA tạo nên codon mRNA là codon stop (UAG, UAA, UGA) 21/02/2016 3:25:52 CH 66 Nguyễn Hữu Trí 11 21/02/2016 Sự thay đổi base chuỗi làm khuôn dẫn tới việc tổng hợp protein không bình thường Wild-type hemoglobin DNA 3 Mutant hemoglobin DNA 5 C T T G A A 3 mRNA 5 C A T G U A mRNA 5 3 5 Hemoglobin bình thường 3 Trong DNA, mạch khuôn bị đột biến chứa A mạch khuôn bình thường chứa T mRNA đột biến chứa U thay vì A codon Hemoglobin hình lưỡi liềm hemoglobin đột biến chứa valine (Val) thay vì glutamic acid (Glu) Val Glu 21/02/2016 3:25:52 CH 67 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:52 CH 68 Nguyễn Hữu Trí Thay base Các loại đột biến điểm • Là thay base và nucleotide bắt cặp nó cặp base khác • Đột biến điểm xảy gene có thể chia thành hai loại chính – Có thể gây đột biến sai nghĩa (missense) đột biến vô nghĩa (nonsense) Wild type mRNA Protein – Thay cặp base – Chèn cặp base 5 A U A A G U U U G G C U A A G Lys Met Phe 3 Gly Stop Amino end Carboxyl end Thay cặp base Không ảnh hưởng đến trình tự amino acid U thay vì C A U G A A G U U U G Lys Met Phe Missense G U U Gly A A Stop A thay vì G A U G A A G U U U Lys Met A A A G U U Phe Ser Stop Nonsense U thay vì A A U G U Met 21/02/2016 3:25:52 CH 69 Nguyễn Hữu Trí A G U U U G G C U A A Stop 21/02/2016 3:25:52 CH 70 Nguyễn Hữu Trí Chèn base và base Đột biến chuyển dịch khung (frameshift mutation): nhiều cặp base thêm vào hay gen, khung đọc mRNA có thể thay đổi vùng (dowstream) khung đọc, tạo amino acid không đúng chuỗi polypeptide – Việc thêm cặp nucleotide gene in a gene có thể gây đột biến lệch khung (frameshift mutation) Wild type mRNA 5 Protein A U G A Met A G U Lys G U U G U A A C Gly Phe Amino end Chèn cặp base 3 Stop Carboxyl end Đột biến lệch khung gây vô nghĩa Thêm U A U G U Met A A G U U A U U G G C U A U A A Stop Đột biến lệch khung gay6sai nghĩa G Met A A Mất U U G U U Lys G G C Ala Leu Chèn nucleotides không gây lệch khung nhung làm thêm mật amino acid A A U Met 21/02/2016 3:25:52 CH 71 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:52 CH A G G U U Phe Missing U G G C U Gly A A Stop 72 Nguyễn Hữu Trí 12 21/02/2016 II NGUYÊN NHÂN GÂY ĐỘT BIẾN Đột biến quá trình chép “enol” “keto” 1.Đột biến tự phát sinh - Đột biến quá trình chép - Đột biến thay đổi hóa học cách tự phát (đột biến chuyển hóa) 2.Đột biến kích thích “keto” “enol” - Kích thích phóng xạ - Kích thích hóa chất 21/02/2016 3:25:52 CH 73 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:52 CH 74 21/02/2016 3:25:52 CH 76 Nguyễn Hữu Trí Đột biến quá trình chép Amino Imino Imino C H H H H H C H H CH2 H H O C O C OH C P C 78 O H O H C O H 21/02/2016 3:25:52 CH O H C CH2 C C G O H H P CH2 H O C C O C O P H H O H O H C O O C Aflatoxin B1 C CH2 O C C O O C H H H C CH2 C O C O P O O H H P O H O CH2 C O A T O Sự phản purin hóa (depurination) O H C O P Nguyễn Hữu Trí H O O 77 C O 21/02/2016 3:25:52 CH Nguyễn Hữu Trí Đột biến điểm chuyển hóa Đột biến điểm chuyển hóa H Nguyễn Hữu Trí C 75 OH 21/02/2016 3:25:52 CH H Amino Nguyễn Hữu Trí 13 21/02/2016 Đột biến điểm hóa chất 5-bromouracil: • Trong trạng thái bình thường giống T, bắt cặp với A • Trong trạng thái hiếm, bắt cặp với G • Gây đột biến AT thành GC 2-aminopurine: Có thể bắt cặp với C Gây đột biến AT thành GC Những chất đồng phân gốc base (base analogs) 21/02/2016 3:25:52 CH 79 Nguyễn Hữu Trí A·T Iioyo Replication in presence of BrU Ơu 21/02/2016 3:25:52 CH 80 Nguyễn Hữu Trí Đột biến điểm tia UV A·BrU Tautomeric shift A·BrU* Replication A·T + G·BrU* Replication Tia UV cung cấp lượng hình thành liên kết cộng hóa trị T kế cận, gây dimer hóa các thymine A·T + A·T + G·BrU* + GC 21/02/2016 3:25:52 CH 81 Nguyễn Hữu Trí CÁC CƠ CHẾ SỬA SAI CƠ CHẾ SỬA SAI TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP 2.CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP 21/02/2016 3:25:52 CH 83 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:52 CH 82 Nguyễn Hữu Trí CƠ CHẾ SỬA SAI TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP DNA polymerase sử dụng hoạt tính exonuclease để cắt các nucleotide tổng hợp sai quá trình chép 21/02/2016 3:25:52 CH 84 Nguyễn Hữu Trí 14 21/02/2016 Sửa sai nhờ DNA polymerase (proofreading) Sửa sai nhờ DNA polymerase (proofreading) -T A T -A T G C A T G C A T G C 21/02/2016 3:25:52 CH 21/02/2016 3:25:52 CH 85 86 Nguyễn Hữu Trí CƠ CHẾ SỬA SAI NGAY SAU KHI SAO CHÉP Nguyễn Hữu Trí CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP Mạch bố mẹ methyl hóa Một thời gian ngắn sau chép mạch methyl hóa Do đó sau chép mạch không methyl hóa ĐẢO NGƯỢC SAI HỎNG (DAMAGE REVERSAL) CẮT BỎ SAI HỎNG (BER,NER) Đặc điểm này, hệ thống sửa sai tế bào nhận biết mạch nào sai và sửa sai mạch đó 21/02/2016 3:25:52 CH 87 Nguyễn Hữu Trí CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP 21/02/2016 3:25:52 CH 88 Nguyễn Hữu Trí CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP ĐẢO NGƯỢC SAI HỎNG ĐẢO NGƯỢC SAI HỎNG Hiện tượng quang hoạt hóa 21/02/2016 3:25:52 CH 89 Nguyễn Hữu Trí Loại bỏ nhóm methyl 21/02/2016 3:25:52 CH 90 Nguyễn Hữu Trí 15 21/02/2016 CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP CƠ CHẾ SỬA SAI NGOÀI QUÁ TRÌNH SAO CHÉP BER (BASE EXCISION REPAIR) NER (NUCLEOTID EXCISION REPAIR) -Glycosylase: nhận biết và cắt base sai hỏng Nuclease: nhận biết và cắt vị trí chuyên biệt: -AP endonuclease, exonuclease: Cắt phân tử đường base sai hỏng -Nu thứ kể từ vị trí sai hỏng theo hướng 5’ 21/02/2016 3:25:52 CH -Nu thứ kể từ vị trí sai hỏng theo hướng 3’ 91 21/02/2016 3:25:52 CH Nguyễn Hữu Trí Gene nhảy (Tranposon)   93 Nguyễn Hữu Trí • Các trình tự gắn xen IS (Insertion Sequence) tìm thấy đầu tiên E coli tác động ức chế chúng chế kiểm soát biến dưỡng đường galactose • Khi nhân tố IS2 xen vào bên gen tương ứng, vi khuẩn khả lên men galactose Khi nhân tố này rời khỏi gen, khả lên men galactose tái lập 95 Các gen nhảy là các trình tự DNA có khả gắn xen vào vị trí trên gen hay rời bỏ vị trí đó, làm biến đổi các hoạt động di truyền Các gen nhảy còn gọi là nhân tố chuyển vị (transposon) Các nhân tố chuyển vị tìm thấy prokaryote và eukaryote Ví dụ gen nhảy bắp 21/02/2016 3:25:52 CH 94 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc và chế chuyển vị IS Các trình tự IS 21/02/2016 3:25:52 CH Nguyễn Hữu Trí Gene nhảy (Tranposon)  21/02/2016 3:25:52 CH 92 Nguyễn Hữu Trí Các trình tự IS có kích thước nhỏ (khoảng 1kb), cấu trúc bao gồm:  Một trình tự trung tâm đặc trưng cho loại IS Vùng này mã hóa cho transposase và vài gen khác  Ở hai đầu hai trình tự lặp đảo IR (Inverted repeat) là hai trình tự ngắn giống có chiều ngược 21/02/2016 3:25:52 CH 96 Nguyễn Hữu Trí 16 21/02/2016 Cơ chế chuyển vị IS • •   • • Hai kiểu chuyển vị Dưới tác động transposase, đoạn DNA nơi nhận đoạn gắn xen bị cắt đứt, hình thànn nên các đầu so le, hay đầu dính (cohesive end) Sự chuyển vị gen có thể xảy theo hai khả năng: Transposon nhân lên, cũ lại vị trí ban đầu, chuyển đến vị trí Transposon chuyển đến vị trí nhận, vị trí cũ transposon Ở hai đầu nhân tố IS còn hở, DNA polymerase và ligase làm nhiệm vụ lấp đầy chỗ trống Sau gắn chèn, nhân tố IS hoàn toàn dung hợp vào genome 21/02/2016 3:25:52 CH 97 Chuyển vị nhân bản: Transposon nhân lên, cũ lại vị trí ban đầu, chuyển đến vị trí Chuyển vị bảo tồn: Transposon chuyển đến vị trí nhận, vị trí cũ transposon 21/02/2016 3:25:52 CH Nguyễn Hữu Trí • • • • 21/02/2016 3:25:52 CH Nguyễn Hữu Trí 100 Nguyễn Hữu Trí DNA transposon và Retrotransposon • Transposon đơn có chứa gen kháng kháng sinh, nó không kết thúc hai đầu với nhân tố IS, có chuỗi trình tự lặp đảo IR cần thiết cho chuyển vị • Enzyme đóng vai trò quan trọng chuyển vị mã hóa các gen định vị vùng trung tâm transposon • Tn3 là ví dụ transposon đơn 101 Nguyễn Hữu Trí Là phức hợp với vùng trung tâm có chứa gen kháng thuốc kháng sinh, nằm kề bên với các nhân tố IS Có độ dài vài ngàn bp Nhân tố IS nằm bên trái gọi là IS-L, và nhân tố IS nằm bên trái là IS-R Tùy theo loại transposon mà IS-L và IS-R có thể cùng hướng, ngược hướng đối xứng Vì thân IS có IR (Inverted repeat), nên transposon có IR hai đầu cần thiết cho chuyển vị Tn 10 là ví dụ transposon phức hợp Tn 10 có độ lớn phân tử 9.300bp, vùng trung tâm chiếm 6.500bp, chứa gen kháng tetracyline nằm IS10L và IS10R Mỗi nhân tố IS dài khoảng 1.400bp Transposon đơn 21/02/2016 3:25:52 CH 98 Transposon phức hợp • • Các transposon (Tn) là các trình tự gen nhảy có kích thước lớn các trình tự IS Giống nhân tố IS, transposon có chứa gen chèn vào đoạn DNA trên nhiễm sắc thể • Transposon tương đối phức tạp nhân tố IS, nó còn có gen bổ sung • Có hai dạng transposon prokaryote: composite Tn và noncomposite Tn (transposon phức hợp và transposon đơn) 99  Nguyễn Hữu Trí Transposon 21/02/2016 3:25:52 CH  21/02/2016 3:25:52 CH 102 Nguyễn Hữu Trí 17 21/02/2016 Retrotransposon Retroviruses 21/02/2016 3:25:52 CH 103 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:52 CH TÁI TỔ HỢP TƯƠNG ĐỒNG (HOMOLOGUOS RECOMBINATION) 104 Nguyễn Hữu Trí Mô hình Holiday • Tái tổ hợp (recombination): là quá trình đó nhiễm sắc thể hay phân tử DNA đứt các phần đứt nối lại theo tổ hợp Quá trình này có thể xảy tế bào sống (ví dụ qua trao đổi chéo phân bào giảm nhiễm) hay ống nghiệm nhờ các enzyme cắt và nối • Mô hình tái tổ hợp đơn giản và cổ điển là mô hình Holiday Mặc dù có thiếu sót cần thêm thắt, sửa đổi, mô hình này đã minh họa tương đối rõ tiến trình tái tố hợp Về mô tả sau :  Điều kiện xảy tái tổ hợp tương đồng: hai vùng DNA tái tổ hợp phải có trình tự tương đồng và hai trình tự đó phải có điểm đứt (nick) trên mạch  Các protein RecB và RecC làm tháo xoắn và cắt đứt hai mạch DNA Phức hợp RecBC nhận biết trình tự chi () và cắt cách đó vài base  Protein RecA gắn lên mạch DNA đứt tạo thuận lợi cho việc nhận biết trình tự tương đồng mạch và hình thành nên phân tử lai 21/02/2016 3:25:52 CH 105 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25:52 CH • Điều kiện xảy tái tổ hợp tương đồng: hai vùng DNA tái tổ hợp phải có trình tự tương đồng và hai phân tử DNA có điểm đứt (nick) trên hai mạch • Mô hình này phổ biến mô hình Holiday và có vai trò quan trọng việc sửa chữa các đột biến đứt gãy mạch đôi 107 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí VAI TRÒ CỦA REC A TRONG TÁI TỔ HỢP TƯƠNG ĐỒNG Mô hình DSB (Double strand Break ) 21/02/2016 3:25:52 CH 106 • Vị trí gắn sơ cấp: gắn với DNA mạch đơn • Vị trí gắn thứ cấp: gắn với DNA mạch đôi • Để rà tìm vùng tương đồng trên mạch đôi, Rec A giữ mạch đơn vị trí sơ cấp, trượt đi, đến xuất vùng tương đồng thì dừng lại, cắt liên kết H hai mạch đôi; nối và hình thành liên kết H 21/02/2016 3:25:52 CH 108 Nguyễn Hữu Trí 18 21/02/2016 Tái tổ hợp tương đồng giảm phân 21/02/2016 3:25:52 CH 109 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:25 CH 110 Nguyễn Hữu Trí 19 21/02/2016 Chương Quá trình phiên mã Prokaryote Quá trình Phiên mã Prokaryote • Được tiến hành RNA polymerase – Không cần primer – Không có khả đọc ngược (proofreading) – Đọc trên khuôn DNA (DNA template) theo chiều 3’-5’ tổng hợp RNA transcript theo chiều 5’-3’ – Chỉ có mạch đơn phân tử DNA dùng làm khuôn – RNA polymerase định việc chọn mạch khuôn cách gắn vào trình tự đặc biệt trên mạch chọn làm khuôn, trình tự đó là promoter 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc Core Polymerase • RNA polymerase core phát là enzyme có hình giống càng cua Nó có hình dạng để ôm lấy DNA • Một kênh dọc theo enzyme đóng vai trò là trung tâm phản ứng – Ion Mg2+ phối hợp với gốc Asp – Vị trí gắn Rifampicin 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí RNA polymerase Quá trình phiên mã Prokaryote Được xúc tác RNA polymerase, nó tách mạch chuỗi DNA và gắn vào DNA nền, liên kết các RNA nucleotide lại với Tuân theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung giống DNA, ngoại trừ RNA, uracil thay cho thymine Dạng RNA polymerase gọi là “holoenzyme”, còn gọi là enzyme hoàn chỉnh, phải gắn với promoter Dạng RNA polymerase gọi là “core enzyme” là enzyme RNA gắn với polypeptide khác gọi là yếu tố sigma (sigma factor) 21/02/2016 3:29:41 CH là phức hợp enzyme, gọi là holoenzyme, gồm enzyme lõi (Core enzyme) và nhân tố s    ’ +  s   ’ s   Core enzyme Holoenzyme Core enzyme: Gồm nhiều tiểu đơn vị : , , ’, , đảm bảo cho phản ứng kéo dài chuỗi RNA  : có vai trò gắn kết các tiểu đơn vị , ’ : trung tâm xúc tác RNA polymerase,  liên kết với DNA khuôn, RNA tổng hợp và ribonucleotide Nhân tố s: đảm bảo tính đặc hiệu promoter: giảm ái lực RNA pol và trình tự DNA bất kỳ, tăng ái lực RNA pol và promoter 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc Holoenzyme • RNA polymerase holoenzyme cho thấy có vùng tiếp xúc rộng s và tiểu đơn vị - và ’-của core • Cấu trúc cho thấy vùng s giúp cho việc mở kênh chính enzyme để nhận vào dsDNA template để hình thành phức hợp đóng promoter • Sau giúp mở kênh, s bị đẩy khỏi kênh chính khi kênh này bị thu hẹp bao quanh DNA bị tách mạch phức hợp mở promoter 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Promoter Chức yếu tố s • Gene chọn phiên mã nhờ có s làm cho RNA polymerase xác định đúng và gắn chặt lên promoter • Sự gắn chặt phụ thuộc vào vị trí tách mạch DNA phép hình thành phức hợp mở promoter • Sự tách s khỏi core sau đã đảm bảo cho việc gắn chặt polymerasepromoter 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí Promoter Nguyễn Hữu Trí Sự gắn RNA Polymerase Nguyễn Hữu Trí • Đầu tiên RNA polymerase holoenzyme gắn vào DNA cách lỏng lẻo – Dò dọc theo DNA tìm thấy promoter – RNA polymerase gắn promoter • Phức hợp holoenzyme gắn cách lỏng lẻo promoter là phức hợp đóng promoter (closed promoter complex) mà DNA dạng chuỗi kép • Holoenzyme sau đó có thể tách vùng ngắn DNA promoter để hình thành phức hợp mở promoter (open promoter complex) với polymerase gắn chặt vào DNA 21/02/2016 3:29:41 CH 10 Nguyễn Hữu Trí Quá trình phiên mã Prokaryote • Các bước quá trình phiên mã (transcription) • Đầu tiên holoenzyme gắn vào DNA cách lỏng lẻo • Phức hợp lỏng lẻo liên kết promoter = phức hợp đóng promoter (closed promoter complex), DNA dạng mạch kép khép kín • Holoenzyme tách mạch DNA promoter hình thành phức hợp mở promoter (open promoter complex) với polymerase gắn chặt vào DNA 21/02/2016 3:29:41 CH 21/02/2016 3:29:41 CH Sự gắn RNA Polymerase • Có vùng các promoter vi khuẩn có tính chất chuyên biệt cho khởi động phiên mã gồm 6-7 bp tập trung 10 bp đầu nguồn (upstream) từ vị trí +1 (vị trí bắt đầu phiên mã) = vùng -10 (-10 box, hay còn gọi là Pribnow box, TATA box) là 5’-TATAAT-3’ • Một trình tự ngắn khác tập trung 35 bp đầu nguồn (upstream) gọi là vùng -35 (-35 box) là 5’-TTGACA-3’ • Các trình tự này là trình tự thỏa hiệp đưa so sánh trên hàng ngàn promoter khác 21/02/2016 3:29:41 CH Promoter là trình tự điều hòa trên phân tử DNA, nơi RNA polymerase gắn vào để khởi động phiên mã Promoter có hai đặc điểm: + nằm trước vùng gen mã hóa + hoạt động theo đúng chiều (-35, -10, +1) – Khởi đầu (Initiation) – Kéo dài (Elongation) – Kết thúc (Termination) 11 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:29:41 CH 12 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Khởi đầu phiên mã (Initiation) • Quá trình khởi đầu phiên mã không phải là RNA polymerase hình thành liên kết phosphodiester đầu tiên • Carpousis và Gralla có đoạn oligonucleotide (dài 2-6 nt) tổng hợp mà RNA polymerase chưa rời trên DNA • Quá trình phiên mã có thể thất bại mà chuỗi oligonucleotide khoảng 10 nt tổng hợp Khởi đầu phiên mã (Initiation) Promoter -35 -10  s   ’ Phức hợp đóng  s  RNA pol nhận biết và gắn vào  ’ promoter nhờ nhân tố s rNTPs PPi 13 Nguyễn Hữu Trí   21/02/2016 3:29:41 CH Khởi đầu phiên mã (Initiation) RNA pol nhận biết và gắn vào promoter nhờ nhân tố s, theo bước: - RNA pol nhận biết và gắn cách lỏng lẻo vào trình tự -35 tạo thành phức hợp đóng - RNA pol gắn với DNA chặt để mở xoắn vùng trình tự -10, tạo thành phức hợp mở Tại đây DNA tháo xoắn và sợi đơn phơi dạng tự làm khuôn cho phiên mã RNA -RNA pol gắn với DNA chặt để mở xoắn vùng trình tự -10, tạo thành phức hợp mở Core enzyme Phức hợp mở 21/02/2016 3:29:41 CH -RNA pol nhận biết và gắn cách lỏng lẻo vào trình tự -35 tạo thành phức hợp đóng Holoenzyme enzyme mRNA 14  ’ s Nguyễn Hữu Trí Kéo dài (Elongation) Khi phân tử RNA đạt chiều dài khoảng nucleotide thì nhân tố s tách khỏi phức hợp RNA pol, thay các nhân tố kéo dài Sự tách rời này cần thiết cho quá trình kéo dài chuỗi RNA RNAP trượt tiếp tục trên sợi DNA, tháo xoắn liên tục phân tử DNA, vùng DNA tháo xoắn gọi là transcription bubble dịch chuyển trên DNA cùng với RNA polymerase 15 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:29:41 CH Transcription bubble • Các nucleotide thêm vào nucleotide đây gọi là quá trình kéo dài • Kích thước vùng tháo xoắn luôn trì không đổi khoảng 17 cặp base, và xoắn lai RNA-DNA có chiều dài khoảng 12 cặp base Kéo dài (Elongation) RNA nucleotide RNA polymerase T C 3 C A A 3 U 5 A E G C A T A G G T T Hướng phiên mã (“downstream”) 5 Nguyễn Hữu Trí Mạch DNA chứa thông tin Kéo dài (Elongation) A 16 Mạch DNA khuôn • Sự kéo dài phiên mã bao gồm quá trình polymer hóa các nucleotide RNA polymerase di chuyển dọc theo khuôn DNA (template DNA) • Polymerase trì vùng ngắn DNA khuôn bị tách mạch • DNA bị tháo xoắn phía trước polymerase và đóng lại phía sau • Mạch template DNA tháo xoắn nhờ các enzyme topoisomerase RNA hình thành 21/02/2016 3:29:41 CH 17 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:29:41 CH 18 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Kết thúc phiên mã (Termination) Kết thúc phiên mã không phụ thuộc Rho Intrinsic termination = Rho-independent termination • Khi polymerase tiến tới terminator điểm cuối gene nó tách khỏi template và giải phóng RNA • Có hai chế kết thúc (terminator) – Chức kết thúc nội (Intrinsic) với chính RNA polymerase không có giúp đỡ các protein khác – Kết thúc phiên mã phụ thuộc vào protein rho 21/02/2016 3:29:41 CH 19 Nguyễn Hữu Trí Kiểu hoạt động Intrinsic Termination Terminator vi khuẩn hoạt động dựa vào bắt cặp bổ sung không bền lai RNA-DNA o trình tự đối xứng bổ sung giàu GC, phiên mã tạo thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin), cấu trúc này ổn định và ngăn không cho RNA pol tiếp tục tổng hợp o Nguyên nhân chính dẫn tới ngừng quá trình phiên mã là chuỗi giàu U nằm downstream hairpin, làm giảm ái lực RNA với DNA mạch gốc Do đó RNA tách khỏi phức hợp phiên mã 21/02/2016 3:29:41 CH 21 Nguyễn Hữu Trí Kết thúc phiên mã phụ thuộc nhân tố rho • Rho nhận diện vùng trên RNA gọi là “rut” (gồm 50-90 bp nằm phiá trước trình tự kết thúc, giàu C và ít G) • Rho thủy phân ATP để dịch chuyển trên RNA với tốc độ cao RNA pol Khi đó Rho phân tách liên kết RNA-DNA nhờ hoạt tính helicase Quá trình phiên mã kết thúc • Kết thúc nội hay không phụ thuộc rho phụ thuộc vào hai yếu tố kết thúc: – Một trình tự lặp đảo theo sau vùng giàu T trên chuỗi nontemplate gene • Trình tự lặp đảo mở đường cho phân tử transcript hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin structure) 20 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí Kết thúc phiên mã phụ thuộc Rho Rho-Dependent Termination Rho là protein gồm tiểu đơn vị, có domain Rho là nguyên nhân làm suy giảm khả phiên mã RNA polymerase in vitro.Sư suy giảm này là Rho làm kết thúc phiên mã Sau kết thúc phiên mã, polymerase tái khỏi đầu lại quá trình phiên mã 21/02/2016 3:29:41 CH 22 Nguyễn Hữu Trí PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ Ở PROKARYOTE & EUKARYOTE RNA Polymerase Eukaryote • RNA Pol I: phiên mã các RNA ribosome (28S, 18S, 5.8S) • RNA Pol II: phiên mã mRNA • RNA Pol III: phiên mã tRNA, rRNA 5S và các RNA nhỏ khác 21/02/2016 3:29:41 CH 23 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:29:41 CH 24 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Sự biến đổi mRNA Kết thúc phiên mã • Mỗi đầu cuối phân tử pre-mRNA biến đổi (modified) theo các cách khác • Cơ chế kết thúc – Có khác prokaryote và eukaryote • Tế bào Eukaryote biến đổi RNA sau dịch mã • Enzyme nhân eukaryote – Đầu 5 gắn chóp(cap) 7- Mehtyl- Guanylate – Đầu 3 nhận đuôi poly-A dài khoảng 50-250 nu – Biến đổi pre-mRNA trước tín hiệu di truyền rời nhân và vào tế bào chất 7- Mehtyl- Guanylate 50 đến 250 adenine nucleotide Được gắn vào đầu 3 Được gắn vào đầu 5 TRANSCRIPTION RNA PROCESSING DNA Đoạn mã hóa protein Pre-mRNA 5 mRNA G P P P Tín hiệu Polyadenylation 3 AAA…AAA AAUAAA Ribosome TRANSLATION 5 Cap 5 UTR Start codon Stop codon 3 UTR Đuôi Poly-A Polypeptide 25 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí 26 21/02/2016 3:29:41 CH Nguyễn Hữu Trí RNA transcript (pre-mRNA) 5 Gene gián đoạn và RNA splicing Intron Exon Exon Protein Other proteins snRNA • RNA splicing snRNPs – Loại bỏ các intron và nối exon lại 5 Exon Intron TRANSCRIPTION DNA Exon 3 Pre-mRNA 5 Cap RNA PROCESSING Spliceosome Intron Exon Đuôi Poly-A 30 31 104 105 5 146 Pre-mRNA mRNA Đoạn mã hóa Intron bị cắt và các exon nối lại với Ribosome TRANSLATION Polypeptide mRNA 5 Cap Thành phần Spliceosome Đuôi Poly-A 146 3 UTR 3 UTR Intron bị cắt 21/02/2016 3:29:41 CH 27 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:29:41 CH mRNA28 5 Exon Nguyễn Hữu Trí Exon Chức và tiến hóa quan trọng Intron • Hiện diện intron – Cho phép có khả biến đổi quá trình RNA splicing 21/02/2016 3:29:41 CH 29 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:29 CH 30 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Gene Chương Mã di truyền và quá trình tổng hợp Protein • Trong suốt quá trình phiên mã – gene xác định dựa vào trình tự các base dọc theo chiều dài phân tử mRNA – Gene biểu thành protein thông qua đường phiên mã (transcription) và dịch mã (translation) 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí Gene Gene Chuỗi DNA 3 5 A C C A A A C C G A G T (template) TRANSCRIPTION mRNA 5 U G G U U U G G C U C A 3 Codon TRANSLATION Protein 21/02/2016 3:32:41 CH Sự biểu gen • DNA là vật liệu di truyền sống • Quá trình chuyển thông tin di truyền từ DNA sang protein còn gọi là quá trình biểu gen • Bao gồm bước, gọi là phiên mã (transcription) và dịch mã (translation) Gene Phân tử DNA Trp Amino acid Phe Gly Ser Nguyễn Hữu Trí Prokaryote • Phiên mã và dịch xảy gần đồng thời DNA TRANSCRIPTION mRNA Ribosome TRANSLATION Polypeptide (a) Tế bào Prokaryote Tế bào không có màng nhân, mRNA tổng hợp quá trình transcription thì translation mà không thông qua quá trình chế biến 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí Eukaryote RNA thông tin (mRNA) • RNA transcript biến đổi trước trở thành mRNA trưởng thành • RNA phiên mã nhân, mRNA dịch mã tế bào chất mRNA là trình tự định trên DNA, đóng vai trò trung gian chuyển thông tin mã hóa trên phân tử DNA đến máy giải mã thành protein tương ứng mRNA tạo nhờ qúa trình phiên mã có nhu cầu; và đó nó mã hóa cho các protein đặc hiệu cho tế bào mRNA tế bào eukaryote sau dịch mã xử lý (processing) trước rời nhân tế bào chất là nơi xảy quá trình dịch mã Prokaryote quá trình dịch mã diễn gần đồng thời cùng với quá trình phiên mã Màng nhân DNA TRANSCRIPTION Pre-mRNA RNA PROCESSING mRNA Ribosome TRANSLATION Polypeptide 21/02/2016 3:32:41 CH Tế bào Eukaryote Quá trình transcription xảy (b) nhân ngăn cách màng nhân Khi RNA phiên mã, gọi là pre-mRNA, sau qua chế biến mRNA gọi là trưởng thành hay mRNA thật Nguyễn Hữu Trí và rời nhân mRNA 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Khung đọc mở ORF RNA ribosom (rRNA) • RNA ribosom chiếm đến 80% tổng số RNA tế bào • Các RNA kết hợp với các protein chuyên biệt tạo thành Ribosom • Một Ribosom gồm tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn Mỗi tiểu đơn vị gồm nhiều protein và rRNA có kích thước khác • Tiểu đơn vị nhỏ có vị trí gắn với phân tử mRNA Tiểu đơn vị lớn có ba vị trí gắn cho phân tử tRNA, vị trí P (Peptide site), vị trí A (Amino acid site) và vị trí E (Exit site) Trong suốt quá trình sinh tổng hợp protein hai tiểu phần này gắn với 21/02/2016 3:32:41 CH 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí RNA vận chuyển (tRNA) Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc RNA vận chuyển Vị trí gắn Amino acid 3 • Hầu hết các phân tử tRNA prokaryote và eukaryote có cấu trúc giống • Dây đơn RNA gấp khúc tạo thành vòng (loop), cho phân tử có cấu trúc bậc hai trên thân chính – Thân (stem) nhánh (arm) là vùng chứa các cặp base nối với nhau, tương ứng theo mã di truyền – Ở các loop không có bắt cặp các base A C C A C G C U U A A U C C A C AG * G U G U G C * C * * U * G AG G U C • Phân tử tRNA • Là chuỗi RNA mạch đơn có chiều dài khoảng 80 nucleotide – Có hình L – Mỗi tRNA mang amino acid đặc hiệu với đầu cuối – Mỗi tRNA mang anticodon đầu khác * A* * A 5 G C G G A U U U A * CUC C G A G * C C A G A A G * * G A G G Liên kết Hydro C U A G Anticodon 21/02/2016 3:32:41 CH 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH U UUU Phe U UUC UUA UUG Leu Base mRNA đầu (5 end) • Codon (bộ ba mã hóa) : Thông tin di truyền mã hóa ba base (base triplets) không chồng lắp lên nhau, hay còn gọi là codon C CUU CUC CUA CUG A AUU AUC AUA AUG GUU GUC G GUA GUG Leu lle Met or start Val 11 Nguyễn Hữu Trí Sự tiến hóa mã di truyền Base mRNA thứ C A UAU Tyr UAC Ser UAA Stop UAG Stop G UGU Cys UGC UGA Stop UGG Trp CCU CCC CCA CCG Pro CAU His CAC CAA Gln CAG ACU ACC ACA ACG Thr AAU Asn AAC AAA Lys AAG U C A G U CGU CGC C Arg CGA A CGG G U AGU Ser C AGC A AGA AGG Arg G GCU GCC GCA GCG Ala GAU GAC Asp GAA GAG Glu U GGU C GGC Gly GGA A GGG G UCU UCC UCA UCG Nguyễn Hữu Trí Base mRNA thứ (3 end) Mã di truyền 10 • Các codon phải đọc đúng khung đọc để tổng hợp nên chuỗi polypeptide đặc hiệu • Mã di truyền gần có tính vạn (universal) – Tức là toàn giới các sinh vật từ đơn giản là vi khuẩn tới các loài động vật phức tạp có chung mã di truyền 21/02/2016 3:32:41 CH 12 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Sự dịch mã Quá trình dịch mã (Translation) Trình tự bốn loại nucleotide trên mRNA dịch mã thành trình tự các acid amin trên protein • RNA vận chuyển (tRNA) đóng vai trò vận chuyển các amino acid cần thiết đến máy dịch mã để tổng hợp protein mRNA tương ứng • Ribosome xúc tác cho quá trình dịch mã • Protein, là polymer các amino acid, tổng hợp nhờ các aminoacyl‐tRNA • Protein tổng hợp theo hướng từ N‐C, mRNA (mRNA) dịch mã theo hướng 5'‐3' • Nhóm amino aminoacyl‐tRNA gắn vào đầu C‐terminal carbonyl chuỗi peptide hình thành để tạo cầu nối peptide • Tỉ lệ sai sót khoảng ∼ 10−4 TRANSCRIPTION DNA mRNA Ribosome TRANSLATION Polypeptide tRNA với amino acid Ribosome gắn vào Gly tRNA Anticodon A A A U G G U U U G G C Codons 5 21/02/2016 3:32:41 CH 13 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH Sự khởi đầu dịch mã (Intiation) • Hai kiện quan trọng xảy trước khởi đầu dịch mã xảy đó là – Sự tạo thành các aminoacyl-tRNA • Amino acid phải tạo cầu nối đồng hóa trị với tRNA • Quá trình nối tRNA với amino acid gọi là nạp tRNA (tRNA charging) – Sự phân ly ribosom thành hai tiểu phần • Tế bào hình thành phức hợp khởi đầu dịch mã trên tiểu phần nhỏ ribosome • Hai tiểu phần phải tách trước quá trình này có thể xảy 21/02/2016 3:32:41 CH 15 Nguyễn Hữu Trí Amino acids Polypeptide mRNA 3 14 Nguyễn Hữu Trí Nạp tRNA • Tất tRNA có cùng base đầu cuối 3’(CCA) • Đầu cuối adenosine là điểm nạp amino acid • Amino acid gắn cầu nối ester – Nhóm carboxyl amino acid – Nhóm 2’-OH 3’-OH đầu cuối adenosine tRNA 21/02/2016 3:32:41 CH 16 Nguyễn Hữu Trí Nạp tRNA 5 Vị trí gắn Amino acid • Các Aminoacyl-tRNA synthetase gắn các amino acid vào các tRNA chuyên biệt với chúng • Quá trình này hoàn thành thông qua hai bước phản ứng: A A G – Khởi đầu là quá trình hoạt hóa amino acid với AMP có nguồn gốc từ ATP – Bước thứ hai, lượng từ aminoacyl-AMP sử dụng để chuyển amino acid tới tRNA 3 Liên kết hydro Anticodon 3 Anticodon5 (c) (b) Cấu trúc 3-D 21/02/2016 3:32:41 CH 17 Kí hiệu Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH 18 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Hoạt hóa amino acid • Có hai bước để hoạt hóa amino acid nhờ enzyme aa-tRNA synthetase • Nhận tRNA nhờ vào việc xác định trình tự base anticodon và các vùng khác vùng này gọi là vùng xác định • Một aminoacyl tRNA synthetase có thể nạp nhiều lần tRNA cùng họ với loại amino acid (20 synthetase khác sử dụng) • Aminoacyl tRNA synthetase có thể sửa chữa các amino acid nạp sai 21/02/2016 3:32:41 CH 19 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí 20 Ribosome Aminoacyl-tRNA synthetase • Một enzyme đặc hiệu gọi là aminoacyl-tRNA synthetase gắn các amino acid đúng với tRNA chuyên biệt Amino acid P P P Nguyễn Hữu Trí • Quá trình dịch mã thực trên các ribosome • Mỗi ribosome gồm hai tiểu đơn vị lớn và nhỏ • Là phức hợp gồm rRNA, các enzyme và protein cấu trúc Aminoacyl-tRNA synthetase (enzyme) Vị trí hoạt động gắn với amino acid và ATP Adenosine ATP ATP hai nhóm P Và nối với amino acid dạng AMP P Pyrophosphate P Pi Phosphates Adenosine Pi Pi tRNA tRNA thích hợp hình thành cầu nối đồng hóa trị với amino acid, thay AMP Amino acid hoạt hóa phóng thích khỏi enzyme 21/02/2016 3:32:41 CH P Adenosine AMP Aminoacyl tRNA Một “amino acid hoạt hóa”) 21 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí 22 Nguyễn Hữu Trí Ribosome Amino cuối • Ribosome có ba vị trí gắn cho tRNA – Vị trí P – Vị trí A – Vị trí E Chuỗi polypeptide hình thành Amino acid gắn vào chuỗi polypeptide Vị trí P (Peptidyl-tRNA binding site) Vị trí A (AminoacyltRNA binding site) Vị trí E (Exit site) tRNA Tiểu đơn vị lớn 3 mRNA E P A 5 Vị trí gắn mRNA Tiểu đơn vị nhỏ Mô hình cho thấy các vị trí gắn Ribosome 21/02/2016 3:32:41 CH 23 Nguyễn Hữu Trí Codons Mô kết hợp Ribosome, mRNA và tRNA Một tRNA gắn với amino acid mang anticodon tương ứng bắt cặp với codon vị trí A (A site) còn trống Vị trí P (P site) giữ tRNA mang chuỗi polypeptide hình thành tRNA sau đó giải phóng nhờ vị trí E ( E site) 21/02/2016 3:32:41 CH 24 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Sự phân tách Ribosome Sinh tổng hợp Protein • Các ribosome E coli phân tách thành các tiểu phần bước cuối quá trình dịch mã • IF1 xúc tác hoạt hóa cho quá trình phân tách này • IF3 gắn vào tiểu phần 30S tự và ngăn cản tái liên kết với tiểu phần 50S để hình thành ribosomehoàn chỉnh 21/02/2016 3:32:41 CH Khởi đầu (Initiation) Kéo dài (Elongation) Kết thúc (Termination) 25 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH • • • • – Thông thường là AUG – Có thể là GUG – Đôi là UUG Khi dipeptide hình thành, α−NH2 Met mở đầu có thể tác kích vào nhóm −C=O gốc aa thứ hai Quá trình này không xảy α−NH2 Met khởi đầu formyl hóa thành −NH−CHO Aminoacyl-tRNA khởi đầu là N-formyl-methionyl-tRNA N-formyl-methionine (fMet) là amino acid đầu tiên chuỗi polypeptide tổng hợp Amino acid này sau đó tách khỏi phân tử protein suốt quá trình trưởng thành 21/02/2016 3:32:41 CH 27 Nguyễn Hữu Trí Gắn mRNA vào tiểu phần 30S • Phức hợp 30S khởi đầu dịch mã hình thành từ tiểu phần ribosome 30S tự cộng thêm mRNA và fMet-tRNA • Việc gắn tiểu phần ribosome 30S prokaryote vào vị trí khởi đầu dịch mã (initiation site) mRNA phụ thuộc vào bắt cặp bổ sung giữa: Nguyễn Hữu Trí Phức hợp 30S khởi đầu dịch mã Codon và aminoacyl-tRNA đầu tiên • Codon khởi đầu Prokaryote là: 26 Khi ribosome hoàn toàn tách thành hai tiểu phần 50S và 30S, tế bào tiến hành thiết lập phức hợp khởi đầu dịch mã hoàn chỉnh trên tiểu phần 30S gồm: – – – – mRNA fMet-tRNA GTP Yếu tố IF1, IF2, IF3 21/02/2016 3:32:41 CH 28 Nguyễn Hữu Trí Ở vi khuẩn, tiểu đơn vị nhỏ gắn với mRNA trình tự ShineDalgarno (RBS = ribosome binding site) thượng nguồn codon AUG khởi đầu – Một trình tự ngắn Shine-Dalgarno mRNA nằm upstream codon khởi đầu – Trình tự bổ sung đầu cuối 3’ 16S RNA 21/02/2016 3:32:41 CH 29 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH 30 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Initiation Factor và tiểu phần 30S Gắn fMet-tRNA vào phức hợp 30S khởi đầu • Liên kết trình tự Shine-Dalgarno với trình tự bổ sung 16S rRNA hoạt hóa IF3 • IF2 là nhân tố chính xúc tác cho việc gắn fMet-tRNA vào phức hợp 30S khởi đầu dịch mã • Hai yếu tố khởi đầu dịch mã còn lại đóng vai trò trợ giúp quan trọng • GTP cần thiết cho việc gắn IF2 • GTP không bị thủy phân bước này – Trợ giúp IF1 và IF2 – Lúc này initiation factor liên kết với tiểu phần 30S 21/02/2016 3:32:41 CH 31 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH 21/02/2016 3:32:41 CH 33 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí Khởi đầu dịch mã Phức hợp 70S khởi đầu dịch mã • GTP thủy phân sau tiểu phần 50S gắn vào phức hợp 30S để hình thành phức hợp 70S khởi đầu dịch mã (70S initiation complex) • Sự thủy phân GTP tách khỏi IF2 việc gắn với tiểu phần ribosome 50S • Mục đích thủy phân là tách IF2 và GTP khỏi complex nhờ đó mà quá trình kéo dài chuỗi polypeptide có thể bắt đầu 32 IF1 tác động làm tách ribosome 70S thành 50S và 30S Gắn IF3 vào 30S, ngăn cản tái hình thành ribosome hoàn chỉnh IF1, IF2, GTP gắn vào dọc bên IF3 Gắn mRNA vào fMet-tRNA hình thành phức hợp 30S khởi đầu dịch mã a IF2 xúc tác cho việc gắn fMettRNA b IF3 xúc tác cho việc gắn mRNA Việc gắn vào 50S cùng với việc tách IF1 và IF3 IF2 tách và thủy phân GTP Hoàn thành phức hợp 70S khởi đầu dịch mã 34 21/02/2016 3:32:41 CH Nguyễn Hữu Trí Cơ chế kéo dài Sự kéo dài chuỗi Polypeptide Quá trình kéo dài gồm bước: Sự kéo dài bắt đầu ribosome mang fMet-tRNA vị trí P site và aminoacyl-tRNA vị trí A 21/02/2016 3:32:41 CH 35 Nguyễn Hữu Trí EF-Tu với GTP kết hợp aminoacyl-tRNA gắn vào vị trí A trên ribosoma Peptidyl transferase tạo liên kết peptide peptide trên vị trí P và aminoacyltRNA đến vị trí A Kéo dài chuỗi peptide thêm amino acid và dịch chuyển nó sang vị trí A EF-G với GTP chuyển vị trí peptidyl-tRNA với mRNA codon tương ứng sang vị trí P 36 21/02/2016 Các protein factor và hình thành liên kết peptide • Factor thứ T (transfer) – Vận chuyển aminoacyl-tRNAs tới ribosome – Có protein khác • Tu, không bền (unstable) • Ts, bền (stable) • Factor thứ hai, G, có hoạt tính GTPase • Factor EF-Tu và EF-Ts tham gia vào bước đầu tiên quá trình kéo dài • Factor EF-G tham gia vào bước thứ ba 18-37 21/02/2016 3:32:41 CH – RF1 nhận stop codon UAA và UAG – RF2 nhận stop codon UAA và UGA – RF3 là GTP-binding protein hỗ trợ RF1 và RF2 bám vào ribosome Nguyễn Hữu Trí Kết thúc dịch mã Nhân tố kết thúc (Release Factor) • Sự kết thúc dịch mã Prokaryotic thực thông qua nhân tố kết thúc RF: 38 • Nhân tố kết thúc (RF) tương tự tRNA vào vị trí A và cung cấp phân tử nước (H2O) để thủy phân tRNA cuối cùng khỏi chuỗi polypeptide để kết thúc dịch mã • mRNA vi khuẩn dịch mã mà không có quá trình xử lý (processing) trước kết thúc phiên mã và không có màng nhân nên quá trình phiên mã và dịch mã cùng với • mRNA eukaryote hình thành vòng cho phép ribosome sau dịch mã xong nhanh chóng tiếp xúc với đầu 5’ • Một phân tử mRNA dịch mã nhiều ribosom prokaryote và eukaryote tạo nên phức hợp gọi là polyribosome hay polysome • Eukaryote có nhân tố kết thúc: – eRF1 nhận stop codon – eRF3 là ribosome-dependent GTPase hỗ trợ eRF1 tách chuỗi polypeptide 21/02/2016 3:32:41 CH 39 40 Sự dịch mã •Eukaryote Sự dịch mã • Vi khuẩn – Bắt đầu với methionine – tRNA khởi đầu không giống tRNA tham gia vào quá trình kéo dài – Không có trình tự ShineDalgarno – mRNA có mũ chụp đầu 5’ Nguyễn Hữu Trí – N-formyl-methionine – Trình tự Shine-Dalgarno cho ribosome biết đâu là điểmkhởi đầu dịch mã • Sự khác quá trình biểu gen tế bào prokaryote và tế bào eukaryote • Prokaryote thiếu màng nhân cho phép quá trình dịch mã bắt đầu quá trình phiên mã diễn RNA polymerase DNA mRNA Polyribosome RNA polymerase Hướng phiên mã 0.25 m DNA Polyribosome Polypeptide (amino cuối) Ribosome mRNA (5 end) 21/02/2016 3:32:41 CH 41 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH 42 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Polyribosome Hình thành Protein có chức • Nhiều ribosome có thể tham gia dịch mã phân tử mRNA cùng lúc hình thành nên polyribosome Polypeptide Tổng hợp xong Polypeptide Đang tổng hợp Tiểu đơn vị ribosome tiến tới Start of mRNA (5 end) • Chuỗi polypeptide tiếp tục trải qua biến đổi sau dịch mã • Sau dịch mã protein có thể biến đổi theo nhiều đường để hình thành nên hình dạng 3-D mRNA (3 end) (a) Ribosomes mRNA 0.1 µm (b) 21/02/2016 3:32:41 CH Hình cho thấy polyribosome lớn tế bào prokaryote (TEM) 43 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:32:41 CH 44 Nguyễn Hữu Trí Biến đổi sau dịch mã 21/02/2016 3:32:41 CH 45 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Chương Điều hòa biểu eở Prokaryote Điều hòa biểu gene Quá trình kiểm soát gene Prokaryote đòi hỏi đáp ứng nhanh với thay đổi môi trường Kiểm soát gene có thể là dương – có nghĩa là hoạt hóa hoạt động gene, âm – kìm hãm hoạt động gen Điều hòa biểu gene Prokaryote chủ yếu là mức độ phiên mã DNA 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí → 2/21/2016 3:37:34 PM • • Phức hợp gọi là operon mô tả vào năm 1961 Francois Jacob và Jacques Monod Một operon có ba phần: promoter, operator và các gen cấu trúc Thêm vào đó là gen điều hòa liên quan đến việc cho phép gen cấu trúc phiên mã hay không Operon – Một cụm các gene cấu trúc đặt kiểm soát vùng điều hòa (Repressor binding site = operator ; RNAP binding site = promoter 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí • Một operon cảm ứng (inducible) chứa cụm gen cấu trúc thông thường dạng đóng (off), bị khóa repressor nó Khi tác nhân kiểm soát gắn vào repressor, tách nó khỏi vị trí khóa gene (vì ngừng ức chế) Gen sau đó trở thành trạng thái mở (on) repressor gắn trở lại operator Operon cảm ứngđược hoạt hóa các phân tử cảm ứng nhỏ VD: Lac operon Một operon ức chế (repressible) chứa cụm gen cấu trúc thông thường dạng mở (on) Khi tác nhân kiểm soát gắn vào repressor, repressor gắn vào operator, khóa gene cấu trúc và gen trở thành trạng thái đóng (off) Operon ức chế - bị đóng chất đồng kìm hãm VD: Trp operon 2/21/2016 3:37:34 PM Protein Nguyễn Hữu Trí Phức hợp Operon Promoter: nhận diện RNA polymerase là nơi bắt đầu quá trình phiên mã Operator: kiểm soát việc gắn RNA polymerase vào promoter và thông thường nằm promoter nẳm promoter và gen cần phiên mã Gene cấu trúc: gene cấu trúc (hoặc gen thiết kế) mã hóa cho chuỗi polypeptide 2/21/2016 3:37:34 PM Mô hình Operon điều hòa • → Mô hình Operon điều hòa • mRNA Nguyễn Hữu Trí Cơ chế điều hòa gene • Kiểm soát dương: quá trình phiên mã xảy promoter hoạt hóa activator • Kiểm soát âm thường là chế phổ biến prokaryote • Kiểm soát dương thường phổ biến eukaryote • Sự tự điều hòa: protein điều hòa quá trình phiên mã chính nó Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Kiểm soát dương - Kiểm soát âm Kiểm soát dương: Kiểm soát dương = activator gắn vào vị trí điều hòa để kích thích quá trình phiên mã gene, cần có mặt nhân tố activator để phiên mã xảy Kiểm soát âm: Kiểm soát âm = repressor gắn lên bị trí điều hòa để chặn lại quá trình phiên mã gene Sự có mặt nhân tố repressor ức chế quá trình phiên mã, phiên mã xảy repressor bị bất hoạt inducer Cả hai kiểu operon cảm ứng và ức chế, gen đóng repressor gắn vào operator nó Sự khác biệt đó là cách hoạt động tác nhân kiểm soát repressor 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí Kiểm soát dương: cảm ứng Nguyễn Hữu Trí Phức hợp activator repressor không thể gắn với vị trí điều hòa Không phiên mã 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016 10 Nguyễn Hữu Trí 10 Kiểm soát âm: ức chế Kiểm soát âm: cảm ứng Khi inducer diện, repressor không thể gắn lên vị trí điều hòa Xảy phiên mã Phức hợp repressorcorepressor gắn lên vị trí điều hòa Không phiên mã Allolactose, inducer 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí Kiểm soát dương: ức chế Phức hợp activator inducer gắn lên vị trí điều hòa Xảy phiên mã 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016 2/21/2016 3:37:34 PM Tryptophan, corepressor 11 Nguyễn Hữu Trí 11 2/21/2016 3:37:34 PM 2/21/2016 12 Nguyễn Hữu Trí 12 21/02/2016 Lac Operon Lac Operon • Sự biểu gene là cảm ứng hay theo chương trình • Repressor thường biểu từ gen i • Repressor gắn vào operator để chặn quá trình phiên mã gene cấu trúc • Inducer lactose gắn và làm bất hoạt repressor cho phép khởi đầu quá trình phiên mã • Lactose operator là vị trí cần thiết cho ức chế • Lactose promoter là vị trí cần thiết cho phiên mã • Lac operon chứa vùng gen cấu trúc liên kết với gene điều hòa 13 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí Khi không có lactose (controller), repressor gắn vào operator ức chế quá trình phiên mã cách ngăn RNA polymerase gắn vào promoter Khi có chất, allolactose (controller), gắn vào phân tử repressor nằm trên vùng operator gene, đó repressor tách khỏi gen RNA polymerase có thể gắn vào promoter và gene mã hóa cho ba enzyme cần thiết cho việc sử dụng lactose phiên mã 15 Nguyễn Hữu Trí Lac operon Lac Operon 2/21/2016 3:37:34 PM 14 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí • Khi các enzyme tổng hợp , lactose sử dụng, bao gồm phân tử allolactose gắn vào repressor Khi allolactose không còn gắn vào repressor protein, repressor khóa promoter (bằng cách gắn vào operator), làm quá trình phiên mã ngừng Đây là chế kiểm soát âm, vì promoter bị khóa operator bị gắn repressor • Lactose operon là ví dụ điều hòa hoạt động gen cảm ứng, vì diện chất đường chuyển hóa (metabolic pathway) có thể cảm ứng quá trình tổng hợp enzyme Bởi vì allolactose cảm ứng phiên mã, lactose operon gọi là operon cảm ứng ( số trường hợp, gọi là operon giải ức chế - derepressable operon vì lactose làm ngừng hoạt động repressor) 2/21/2016 3:37:34 PM Lac operon 16 Nguyễn Hữu Trí Lac Operon • Lactose operon có phần kiểm soát dương • Kiểm soát dương lac operon liên quan đến cAMP-CRP (cyclic AMP receptor protein) gắn vào promoter để hoạt hóa quá trình phiên mã RNA polymerase • Phức cAMP-CRP điều hòa hoạt tính lac operon 2/21/2016 3:37:34 PM 17 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 3:37:34 PM 18 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Lac Operon Lac Operon Khi mức glucose tế bào xuống thấp, cAMP (cyclic adenosine monophosphate), chất truyền tin thứ hai việc truyền tín hiệu tế bào tích lũy lại cAMP gắn vào vị trí allosteric CRP hình thành phức CRP- cAMP CRP-cAMP gắn vào vị trí kế lactose operon promoter và nó làm RNA polymerase dễ dàng gắn vào vùng promoter tăng cường việc phiên mã các enzyme lactase (nếu lactose diện tách phân tử lactose repressor) 19 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí 20 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí Lac Operon Lac Operon 21 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí Trp Operon 23 Nguyễn Hữu Trí Trp Operon • Trp operon chứa các gen cấu trúc cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp tryptophan • Trp operon hoạt hóa quá trình phiên mã không có diện tryptophan • Hệ thống ức chế điều hòa chế kiểm soát ngược âm 2/21/2016 3:37:34 PM 22 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí • Trp operon đóng tryptophan gắn vào và làm bất hoạt aporepressor • Phức hợp tryptophan-repressor gắn vào operator và ngăn chặn quá trình phiên mã mức tryptophan cao • Nếu mức tryptophan sụt giảm,phức hợp trp-repressor tách khỏi operator 2/21/2016 3:37:34 PM 24 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Trp Operon - Điều hòa giảm bớt (Attenuation) Trp Operon - Điều hòa giảm bớt • Attenuation – hình thức nhạy kết hợp với điều hòa dịch mã Trp operon • Trình tự trp attenuator có chứa trình tự base bổ sung đầu 5’ mRNA và có thể bắt cặp bổ sung tao thành cấu trúc thân (stem) và vòng (loop) 25 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí Trp Operon - Điều hòa giảm bớt 2/21/2016 3:37:34 PM 26 Nguyễn Hữu Trí Trp Operon - Điều hòa giảm bớt • Sự điều hòa giảm bớt là nguyên nhân gây kết thúc phiên mã sớm mRNA vì hình thành cấu trúc kẹp tóc ngừng phiên mã vùng đầu 5’ mRNA • Nếu tRNA-trp diện, quá trình tổng hợp peptide leader dẫn tới bắt cặp bổ sung mRNA tạo thành cấu trúc ngăn cản hoạt động RNAP 27 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 3:37:34 PM 28 Nguyễn Hữu Trí Một số Operon điều hòa giảm bớt Trp Operon - Điều hòa giảm bớt DNA + trp RNA Leader peptide RNA polymerase Ngừng phiên mã Cấu trúc ngừng phiên mã DNA - trp RNA polymerase Phiên mã tiếp tục RNA Leader peptide 2/21/2016 3:37:34 PM 29 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 3:37:34 PM 30 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Điều hòa tầng (Cascade regulation) • Một chế điều hòa nhanh chóng và tiết kiệm lượng prokaryote là sử dụng các nhâc tố σ khác • Mỗi σ định hướng cho RNA polymerase xác định và gắn lên promoter Những promoter này kiểm soát biểu nhóm genes liên quan đến hoạt động chuyển hóa chuyên biệt tế bào • Sau đây là hai ví dụ điều hòa biểu gen cách sử dụng các nhân tô sigma khác – Sử dụng luân phiên nhân tố σ E coli cho tự điều chỉnh thích hợp với môi trường – Sử dụng luân phiên nhân tố σ SPO1 bacteriophage suốt quá trình xâm nhiễm 31 2/21/2016 3:37:34 PM Sử dụng luân phiên nhân tố σ E coli • Ở trạng thái bình thường, RNA polymerase holoenzyme chứa σ70, nhân tố σ phổ biến nhất, nhận biết promoter các gen cấu trúc hầu hết là nhờ σ70 • Khi E coli gặp môi trường shock nhiệt (heat shock) tăng lên đột ngột nhiệt độ môi trường, nhân tố σ mới, σ32, tổng hợp lượng lớn và thay cho σ70 để định hướng cho RNA polymerase gắn vào heat- shock gene promoter Sản phẩm biểu gen này giúp cho tế bào chống lại nguy hiểm shock nhiệt • Sự gia tăng hàm lượng σ32 vì : – (1) tăng cường dịch mã mRNA σ32 – (2) Sự ổn định protein σ32 • Các nhân tố σ luân phiên sử dụng hoàn cảnh môi trường khác để biểu các gen khác 2/21/2016 3:37:34 PM Nguyễn Hữu Trí • • • 33 Nguyễn Hữu Trí Kiểm soát phiên mã virus • Virus sử dụng vật liệu tế bào chủ để nhân lên, phiên mã và dịch mã các gene virus, hoạt hóa quá trình này chính là nguyên nhân làm tan tế bào chủ Phage ôn hòa (temperate phage) xác định provirus tách khỏi DNA tế bào chủ và trờ thành dạng lytic Virus làm ngừng hoạt động phiên mã và dịch mã gen tế bào chủ • Kiểm soát di truyền Lamba (l) phage ôn hòa đã nghiên cứu Phage l trở thành dạng lysogenic tế bào chủ môi trường thuận lợi và chúng có khả nhân lên nhanh chóng Khi tế bào chủ tạo nên nhiều hệ mới, tế bào mang phage l phage l trở thành dạng tan tế bào chủ yếu 2/21/2016 3:37:34 PM 35 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí Sử dụng luân phiên nhân tố σ SPO1 bacteriophage quá trình xâm nhiễm Sử dụng luân phiên nhân tố σ E coli 2/21/2016 3:37:34 PM 32 SPO1 phage xâm nhiễm vào Bacillus subtilis có bước biểu gene – các gen sớm, trung gian và các gene muộn biểu thời điểm khác quá trình xâm nhiễm phage Các gen sớm phage biểu RNA polymerase vi khuẩn với việc sử dụng nhân tố σ vi khuẩn Một sản phẩm gene sớm biểu đó là nhân tố σ28 phage nhân tố σ28 phage thay nhân tố σ vi khuẩn để định hướng RNA polymerase đến các promoter các gene trung gian phage Trong số sản phẩm các gene trung gian có nhân tố σ34 Tới lượt nó, nhân tố σ34 tham gia vào quá trình biểu các gene muộn phage 2/21/2016 3:37:34 PM 34 Nguyễn Hữu Trí Kiểm soát phiên mã virus Hai virus protein, Cro và cI kiểm soát sức khỏe tế bào chủ Khi tế bào chủ khỏe, cI protein tích lũy để hoạt hóa chức gene lysogenic gene và ức chế chức gene lytic Khi tế bào chủ suy yếu, Cro protein tích lũy, ức chế chức gene lysogenic và thúc đẩy hoạt động gene lytic Tỉ lệ Cro với cI định nào l phage là lysogenic hay Iytic Các virus khác có chế kiểm soát tương tự 2/21/2016 3:37:34 PM 36 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 Kiểm soát phiên mã virus Điều hòa biểu gen Prokaryote mức độ dịch mã • Ở prokaryotes, kiểm soát biểu gen mức độ dịch mã dựa vào các chế sau : Hiệu suất khởi đầu dịch mã khác trính tự xung quanh start codon AUG Hiệu suất kéo dài dịch mã khác việc hình thành cấu trúc thứ cấp trên mRNA Tốc độ phân rã các mRNA là khác 2/21/2016 3:37:34 PM 21/02/2016 3:37 CH Nguyễn Hữu Trí 37 39 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 3:37:34 PM 38 Nguyễn Hữu Trí Các công cụ sử dụng kỹ thuật tạo dòng Chương Kỹ thuật tạo dòng Enzymes - cắt, nối nucleic acid … Vector- tạo dòng phân tử PCR (Polymerase chain reaction) Giải trình tự DNA (DNA sequencing) Điện di (Electrophoretic separation) Phát gene: DNA-Southern blotting; lai chỗ (in situ hybridization); kỹ thuật FISH; RNA- Northern blotting Pr-Western blotting; lai miễn dịch IHC (immunohistochemistry) • Tinh • Sinh vật chuyển gene …… • • • • • • 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 • Được tìm thấy các loài vi khuẩn khác là các endonuclease có khả thủy giải DNA mạch đôi vị trí xác định • Vi khuẩn sử dụng restriction enzyme để bảo vệ chúng khỏi các DNA ngoại lai • Vi khuẩn có chế để bảo vệ DNA chúng khỏi hoạt động các restriction enzyme thân • Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ prokaryote, chưa có hệ thống tương tự nào phát eukaryote • Chúng phân lập và sử dụng cho các phòng thí nghiệm Nguyễn Hữu Trí • Hệ thống biến đổi giới hạn-restriction enzyme hoạt động cùng với hệ thống methylase • Methylases là enzyme thêm nhóm methyl vào nucleotide chuyên biệt (vào A hay C) trình tự nhận biết (recognition sequence) Sự methyl hóa ngăn chặn nhận biết restriction enzyme • Do đó, restriction enzyme tế bào không phân cắt DNA chính nó Tuy nhiên restriction enzyme có thể phân cắt DNA ngoại lai xâm nhập vào tế bào bacteriophage 2/21/2016 Restriction Endonuclease Nguyễn Hữu Trí Restriction Enzyme Loại I- có nhiều tiểu đơn vị,có hoạt tính endonuclease và methylase, cắt cách ngẫu nhiên vị trí cách vị trí nhận biết (recognition sequence) 1000 bp Loại II- cắt DNA vị trí nhận biết, không cần ATP, hầu hết dạng đơn phân Loại III- có nhiều tiểu đơn vị, có hoạt tính endonuclease và methylase cắt cách 25 bp từ trình tự nhận biết 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí Vai trò sinh học RE Restriction Enzyme (RE) 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí • Restriction enzyme (endonulease) cắt DNA trình tự đặc hiệu • Những loại cầu nối nào bị RE cắt? – Cầu nối đồng hóa trị (trong chuỗi) – Cầu nối hydrogen (giữa hai chuỗi) 2/21/2016 Cầu nối hydrogen Cầu nối đồng hóa trị Nguyễn Hữu Trí RE hoạt động nào? • Vị trí nhận biết enzyme – Mỗi enzyme cắt DNA trình tự đặc biệt  restriction site – Enzyme nhận biết 4-, 6- 8cặp base, trình tự lặp đảo (palindromic sequence) 2/21/2016 Đầu dính và đầu • Khi các enzyme cắt, chúng có thể tạo – Đầu dính: số RE, vị trí cắt lệch trên hai mạch Trong trường hợp này các đầu dính có thể bắt cặp trở lại – Đầu bằng: số RE cắt hai mạch DNA cùng điểm, sau cắt hai đầu không có khả tự kết hợp lại Để nối chúng lại phải dùng enzyme T4 ligase Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 EcoRI là ví dụ Chủng R vi khuẩn E.coli I là restriction enzyme đầu tiên E.coli khám phá 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí Việc sử dụng RE có ý nghĩa định phát triển sinh học phân tử eukaryote Chúng cho phép cắt nhỏ nhiễm sắc thể khổng lồ eukaryote Các RE chủ yếu sử dụng việc tạo dòng với mục đích tạo số lượng lớn các trình tự DNA xác định Chúng ứng dụng để lập đồ cắt giới hạn (restriction map) vào việc phân tích so sánh gen các loài khác thông qua kỹ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism – Tính đa hình kích thước các trình tự giới hạn) 2/21/2016 Polymerase DNA pol I (Klenow pol): polylerase 5’→ 3’ , exonuclease 3’→ 5’ T4 DNA pol: giống Klenow pol exonuclease 3’→ 5’ mạnh Taq pol: phân lập từ Thermus aquaticus Pfu pol : phân lập từ Pyroccus furiosus Reverse transcriptase:do các Retrovirus sản sinh DNA terminal transferase: li trích từ tuyến ức bê • RNA pol tham gia vào việc tổng hợp RNA theo chiều 5’→ 3’, thông dụng là: – SP6 RNA polymerase: có nguồn từ phage xâm nhiễm Salmonella typhimurium – T3 và T7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm E.coli 2/21/2016 11 10 Nguyễn Hữu Trí Các ligase • DNA pol xúc tác tổng hợp DNA theo chiều 5’→ 3’ như: – – – – – – Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng RE Tên restriction enzyme đến từ: • Loại vi khuẩn mà enzyme tìm thấy • Thứ tự mà restriction enzyme xác định và phân lập Nguyễn Hữu Trí • Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) • Có các ligase sau: – T4 DNA (RNA) ligase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E coli – T4 polynucleotide kinase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E coli – Alkaline phosphastase: li trích từ E coli hay từ ruột bê 2/21/2016 12 Nguyễn Hữu Trí Các nuclease • Đây là nhóm phân cắt DNA hay RNA Gồm các enzyme chính sau: – DNAase I: có nguồn gốc từ tụy tạng bò – Nuclease S1: ly trích từ Aspergillus oryzae – Exonuclease III: tách chiết từ E coli – RNAase A: diện khắp nơi – RNAase H: dùng tổng hợp cDNA 2/21/2016 13 Kỹ thuật tạo dòng Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 14 DNA tái tổ hợp Tạo dòng phân tử (molecular cloning) - Tạo dòng phân tử dùng kỹ thuật di truyền phân lập và làm gen: + Tách và phân đoạn DNA nguồn + Gắn các đoạn DNA bị cắt vào vector dòng hóa + Biến nạp và giữ DNA tái tổ hợp tế bào chủ: ngân hàng DNA (DNA library, DNA bank) + Phát và làm dòng mục tiêu + Nuôi cấy dòng mục tiêu để ly trích và nghiên cứu DNA tái tổ hợp 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí 15 Nguyễn Hữu Trí • Restriction enzyme và DNA ligase có thể sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp, DNA có thể cắt nối lại với từ các nguồn khác • Tạo dòng (Cloning) có nghĩa là gắn đoạn DNA (một gen vào vector tạo dòng (cloning vector) sau đó đặt vào tế bào sống (“Biến nạp”) để khuếch đại gen mục tiêu 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí 16 Vị trí cắt giới hạn DNA tái tổ hợp DNA Vị trí cắt giới hạn DNA 5 3 3 5 Enzyme RE cắt sườn đường - phosphate 3 5 Enzyme RE cắt sườn đường - phosphate DNA tái tổ hợp Đầu dính 5 3 Đầu dính Đoạn DNA mục tiêu cắt cùng RE, bắt cặp xảy Một khả tái tổ hợp Vị trí cắt giới hạn DNA 5 3 Tại phải tạo dòng DNA? 3 5 Enzyme RE cắt sườn đường - phosphate DNA tái tổ hợp Đầu dính Đoạn DNA mục tiêu cắt cùng RE, bắt cặp xảy Một khả tái tổ hợp DNA ligase nối lại Phân tử DNA tái tổ hợp Sử dụng các DNA tạo dòng là cách đầu tiên xây dựng đồ cắt giới hạn – phân tích giải trính tự DNA tạo dòng – Sử dụng DNA tạo dòng làm probe xác định rõ mức độ phiên mã, kích thước mRNA – Sử dụng DNA tạo dòng probe để xác định DNA tương tự các loài khác tạo thành thư viện tạo dòng – Sản xuất thật nhiều gen tạo dòng (Ví dụ insulin protein) – Sử dụng tạo dòng để tạo antisense mRNA cho gene silencing – Tạo reporter gene để xác định biểu gen 2/21/2016 Công cụ tạo dòng 21 Nguyễn Hữu Trí Thể mang gen: vector – Restriction endonuclease để cắt DNA – DNA Ligase để nối DNA – Vector để gắn DNA – Tế bào chủ để khuếch đại DNA – Công cụ để chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ – Công cụ để giữ DNA tế bào chủ – Công cụ để xác định xem tế bào nào đã tạo dòng thành công (tầm soát) 2/21/2016 20 Nguyễn Hữu Trí – Một vector cần có các đặc điểm tiêu chuẩn sau: – Có khả tự chép tế bào chủ, chép không phụ thuộc vào tế bào chủ – Có đặc tính giúp dễ xác định tế bào có chúng – Mang vị trí nhận biết các enzyme cắt giới hạn – Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, chép nhanhhiệu – Có số lượng tế bào cao – Các vector cần biểu thì phải có promoter mạnh 2/21/2016 Thể mang gene: vector 22 Nguyễn Hữu Trí Vector – Vector: phân tử DNA kích thước nhỏ dùng để mang gene, chép, thao tác trên gene – Vector tạo dòng và vector biểu – Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gen tái tổ hợp tế bào chủ, nhân bản, thao tác, phân tích sau đó trên DNA tái tổ hợp dễ dàng – Vector biểu hiện: tạo sản phẩm gen tái tổ hợp mức phiên mã, dịch mã, phân tích trình tự điều hòa biểu gene 2/21/2016 23 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 24 Nguyễn Hữu Trí Sự khác các vector tạo dòng • Loại tế bào mà chúng có thể vào • Cách thức mà chúng xâm nhập (bằng biến nạp hay cách xâm nhiểm virus/phage) • Độ lớn đoạn DNA ngoại lai mà chúng có thể mang • Vị trí cắt giới hạn chính xác enzyme cắt giới hạn • Sự ổn định DNA chèn vào • Những khía cạnh quan tâm – Hiệu tạo dòng – Số lượng (trên tế bào chủ) – Khả tầm soát (ví dụ hệ thống Lac Z) 2/21/2016 25 Nguyễn Hữu Trí Plasmid là các vector tạo dòng • Vị trí cắt hạn chế để chèn DNA mục tiêu (vùng polylinker), có thể nằm cắt ngang gen lacZ mã hóa cho Betagalactosidase, enzyme chuyển khuẩn lạc thành màu xanh diện X-gal (khuẩn lạc chuyển thành màu tráng có đoạn DNA ngoại lai chèn thành công vào vùng polylinker và làm bất hoạt gen lacZ…) • Có promoter mạnh nằm hai phía vùng polylinker để biểu DNA tạo dòng • Một oriC • Marker chọn lọc (Ví dụ Gen kháng kháng sinh) không có biến nạp vi khuẩn chết (chắc chắn có vi khuẩn biến nạp thành công sống) 2/21/2016 Plasmid 27 Nguyễn Hữu Trí Các loại plasmid – Plasmid là đoạn DNA ngắn (2-5kb) dạng chuỗi xoắn kép, dạng vòng, có thể tự nhân đôi độc lập với DNA gen – Có số copy cao tế bào E coli (100) – Gen khác kháng sinh (marker chọn lọc, VD AmpR; có nghĩa là E coli có khả kháng biến nạp thành công nhận plasmid) – Tạo dòng tốt với đoạn DNA 5-10 kb (nhỏ) – Rất dễ sử dụng 2/21/2016 26 Nguyễn Hữu Trí • Plasmid hệ thứ nhất: tìm thấy tự nhiên (ColE1, pSC101…) • Plasmid hệ thứ hai: plasmid nhân tạo (pBR322: kích thước 4364 bp, mang hai gen ApR, TetR và 20 vị trí nhận biết các enzyme cắt giới hạn) • Plasmid hệ thứ ba: đây là các plasmid mạnh có hai đặc tính – Kích thước nhỏ – Có mang polylinker 2/21/2016 28 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là phage Vector tạo dòng là phage + Bacteriophage vector + Được thiết kế để vào chu trình tan + Có khả sinh sôi nhanh, hiệu xâm nhiễm cao hẳn plasmid + Tạo dòng tốt với đoạn DNA lớn nhiều so với plasmid (10-23 kb) + Phage không dễ thao tác plasmid + Phage  loại bỏ 1/3 gen giữ lại vùng chứa gen xâm nhập, tự và lắp ghép + DNA ngoại lai đưa vào tế bào chủ qua phage này, nhân và lưu trữ cùng với phage + Vector phage  chứa ít trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn + Thực khuẩn thể M13 + Bộ gen mạch đơn có kích thước 6,4 kb + Ưu điểm vector này là tạo số lượng lớn DNA mạch đơn + Thường dùng để giải trình tự DNA 2/21/2016 29 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 30 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là phage Vector tạo dòng là phagemid – Kết hợp bacteriophage và plasmid – Tạo ra, đóng gói ssDNA với trợ giúp phage – Hoặc có thể biến nạp vào E coli nó thể giống plasmid (kích thước hạn chế giống plasmid) – Ví dụ pBluescript (pBS) – Có promoter phage T3 và T7 trên hướng cho việc tổng hợp ssRNA in vitro 2/21/2016 31 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 Vector tạo dòng là Phagemid 32 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là Cosmid – Thiết kế nhân tạo kết hợp ưu điểm plasmid DNA và trình tự cos từ phage  – Khi vào tế bào chủ, có khả chép plasmid Plasmid tái tổ hợp bền tế bào chủ –Rất tốt để tạo dòng đoạn gen lớn DNA (32-47 kb) Hiệu suất chuyển gen cao – Plasmids càng lớn thì càng khó thao tác 2/21/2016 33 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 Vector tạo dòng là Cosmid 34 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là BAC • BAC (Bacterial artificial chromosome – NST nhân tạo vi khuẩn) – Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn – Dùng để tạo dòng đoạn DNA lớn vào E coli (tốt và ổn định – sử dụng tạo dòng HGP) – Có chứa ORI nhân tố f; sử dụng giống plasmid – BAC có thể mang đoạn DNA với kích thước từ 150-350 kb 2/21/2016 35 Nguyễn Hữu Trí 2/21/2016 36 Nguyễn Hữu Trí Eukaryotic vector Ưu điểm Prokaryote – Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens dùng để tạo dòng thực vật Kích thước từ 180 - 205kb, có thể mang đoạn DNA kích thước khá lớn, lên đến khoảng từ 30 - 150 kb – YAC (Yeast artificial chromosome – NST nhân tạo nấm men) Kích thước 10kb mang DNA 100 – 1000kb Sao chép nhiễm sắc thể bình thường nấm men Dùng để tạo đồ vật lý gen ví dụ gen người (nhưng không bền BAC) 2/21/2016 37 Nguyễn Hữu Trí Phát triển nhanh Thao tác dễ dàng Nhược điểm Prokaryote Không thể tách các intron Intron cần thiết cho biểu gen Kích thước DNA đưa vào vi khuẩn bị hạn chế Prokaryote không có chế glycosyl hóa protein 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí Cải tiến tế bào chủ E coli Tế bào chủ - E coli: + Tế bào chủ phổ biến nhất, dễ nuôi, sinh sản nhanh + Vi sinh vật gây bệnh hội + Không tiết enzyme - Bacillus subtilis: + Không gây bệnh, không tạo nội độc tố, tiết protein + Pasmid không ổn định tế bào chủ - Saccharomyces cerevisiae: + Tế bào eukaryote nghiên cứu di truyền kỹ + Sử dụng để thể gene eukaryote 2/21/2016 38 Nguyễn Hữu Trí 39 • Thông thường E coli dùng để tạo dòng thường cải tiến: – Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế cách gây đột biến hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh – Hệ thống tái tổ hợp DNA sửa đổi để ngăn chặn tái tổ hợp – Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lượng plasmid tích lũy tế bào 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí 40 Các bước tạo dòng Vi khuẩn tái tổ hợp Tế bào chứa gene mục tiêu Vi khuẩn Gene chèn vào plasmid Protein biểu gene mục tiêu Gene mục tiêu Nhiều gene Nhiễm sắc thể Plasmid vi khuẩn Gene mục tiêu DNA tái tổ hợp (plasmid) Plasmid đưa vào tế bào vi khuẩn DNA nhiễm sắc thể Nghiên cứu gene Tế bào chủ nuôi để hình thành dòng tế bào có chứa gene mục tiêu đã tạo dòng Thu nhận protein Nghiên cứu và nhiều ứng dụng Nghiên cứu protein Vi khuẩn tái tổ hợp Gene kháng sâu bệnh đưa vào thực vật Gene dùng để tạo vi khuẩn tẩy chất thải độc Protein làm tan cục Hormone tăng trưởng máu động liệu điều trị chống còi cọc pháp chống đau tim Tạo dòng gene từ Eukaryotic vào plasmid • Trong tạo dòng gene, plasmid gọi là vector tạo dòng • Một vector tạo dòng là phân tử DNAcó thể mang DNA ngoại lai vào tế bào chủ và nhân lên độc lập với DNA tế bào chủ Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp • Các bước để tạo dòng gene β-globin từ chim ruồi (hummingbird) vào plasmid vi khuẩn Tế bào chim ruồi Kỹ thuật Tế bào vi khuẩn lacZ gene Restriction site ampR gene Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp Đầu dính Plasmid vi khuẩn Gene mục tiêu Các mảnh DNA chim ruồi Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp Tế bào chim ruồi Tế bào chim ruồi Tế bào vi khuẩn Tế bào vi khuẩn lacZ gene lacZ gene Restriction site ampR gene Đầu dính Plasmid vi khuẩn Gene mục tiêu Restriction site ampR gene Các mảnh DNA chim ruồi Đầu dính Plasmid vi khuẩn Gene mục tiêu Các mảnh DNA chim ruồi Plasmid không taí tổ hợp Plasmid không taí tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp Vi khuẩn mang plasmid Kỹ thuật Tế bào chim ruồi Tế bào vi khuẩn Tái tạo dòng (subcloning) lacZ gene Restriction site ampR gene Đầu dính Plasmid vi khuẩn Gene mục tiêu Các mảnh DNA chim ruồi Plasmid không taí tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp Vi khuẩn mang plasmid • Tái tạo dòng là kiểu đơn giản thí nghiệm tạo dòng, là quá trình chuyển DNA đã tạo dòng từ vector này sang vector khác để biểu nó chủng chủ định • Các bước tái tạo dòng tương tự tạo dòng Kết Khuẩn lạc mang plasmid không tái tổ hợp với gene lacZ còn nguyên Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp với gene lacZ bị bất hoạt Các tế bào cùng dòng 2/21/2016 48 Nguyễn Hữu Trí Thư viện gen (Genomic library) Thư viện DNA • Dựa vào chất DNA cần tạo dòng người ta phân biệt hai loại thư viện gen: – thư viện gen và thư viện cDNA 2/21/2016 49 Nguyễn Hữu Trí Thư viện gen (Genomic library) Toàn genome cắt enzyme cắt giới hạn Hoặc Phage DNA pái tổ hợp Các dòng vi khuẩn Các plasmid tái tổ hợp (a) Thư viện Plasmid Các dòng Phage (b) Thư viện Phage Thư viện cDNA 53 2/21/2016 50 Nguyễn Hữu Trí Thư viện gen (Genomic library) Plasmid lớn Đoạn chèn lớn với nhiều gene mục tiêu • Bacterial artificial chromosome (BAC) là plasmid lớn đã biến đổi để có thể mang đoạn DNA lớn • BACs là loại khác vector sử dụng xây dựng thư viện DNA Các dòng BAC (c) Một thư viện các dòng bacterial artificial chromosome (BAC) Tổng hợp cDNA – Thư viện cDNA là tập hợp các cDNA từ tất các mRNA tế bào Như không giống với thư viện gen, thư viện cDNA thiết lập từ tế bào xác định đó gen cần nghiên cứu phải biểu thành mRNA – Thường lập cho eukaryote – cDNA tổng hợp từ mRNA trưởng thành (eukaryote) (Không có các đoạn intron) sử dụng enzyme Reverse transcriptase, RNase H , DNA Polymerase I, và nuclease S1 2/21/2016 – Thư viện gen lập là tập hợp tất các trình tự DNA cấu thành gen đầy đủ đã gắn vào vector Các vector tái tổ hợp sau đó đưa vào tế bào chủ Các tế bào chủ sau đó nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng Vector có thể là plasmid phage – Thư viện gen thường lập cho prokaryote DNA nhân mRNAs tế bào chất Nguyễn Hữu Trí Tổng hợp cDNA Tổng hợp cDNA DNA nhân DNA nhân mRNA tế bào chất mRNAs tế bào chất mRNA Reverse transcriptase mRNA Reverse transcriptase Đuôi Poly-A Đuôi Poly-A DNA Primer Phân cắt mRNA DNA Primer RNase H DNA nhân DNA nhân mRNA tế bào chất mRNA Reverse transcriptase mRNA tế bào chất Tổng hợp cDNA Đuôi Poly-A DNA Primer Phân cắt mRNA RNase H DNA polymerase I mRNA Reverse transcriptase Đuôi Poly-A DNA Primer Phân cắt mRNA RNase H DNA polymerase I nuclease S1 cDNA Tuyển chọn dòng mục tiêu • Để có thể phân lập dòng tế bào chủ tái tổ hợp chứa gen mục tiêu thư viện DNA hay thư viện cDNA, người ta phải sử dụng các phương pháp sàng lọc • Thông thường các phương pháp sàng lọc xây dựng dựa trên việc sử dụng mẫu dò DNA • Mẫu dò DNA (probe) là đoạn oligonucleotide đánh dấu và nó bổ sung bổ sung phần với gen mục tiêu 2/21/2016 59 Nguyễn Hữu Trí Tuyển chọn dòng mục tiêu - Gen biểu tế bào chủ là vi khuẩn: +Lai miễn dịch (Western blotting, Immunoblotting) + Hoạt tính enzyme + Bổ trợ đột biến (gen ngoại lai đồng dạng với gen tế bào chủ) - Gen ngoại lai không biểu tế bào chủ: + Lai insitu: + Lai khuẩn lạc (colony hybridization): vector là plasmid + Lai plaque (plaque colonization): vector là phage 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí 60 10 Tuyển chọn dòng mục tiêu Tuyển chọn dòng mục tiêu • Một dòng mang gene mục tiêu có thể xác định cách dùng nucleic acid probe có trình tự bổ sung với gene Gene mục tiêu 5 …G G C T AA C TT AG C … 3 Probe (Được đánh dấu) 3 C CG A TTG A A T C G 5 Phân tử Probe đánh dấu phóng xạ Đĩa nhiều giếng chứa các dòng thư viện Probe DNA Gene mục tiêu DNA mạch đơn từ tế bào Film • Màng nylon • Quá trình này gọi là lai nucleic acid Vị trí DNA với trình tự bổ sung Vector biểu (expression vector) Màng nylon Ứng dụng thực tiễn kỹ thuật di truyền - Để biểu gen ngoại lai: + Thu protein tái tổ hợp + Nghiên cứu các yếu tố điều hòa thể gen - Gen ngoại lai kiểm soát promoter nhận diện RNA polymerase tế bào chủ: + Promoter mạnh + Khung dịch mã đúng + Promoter thường dùng: lac, trp (cơ chế tắt mở) 2/21/2016 2/21/2016 Nguyễn Hữu Trí 65 63 - Sản xuất sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật - Sản xuất vắcxin phòng chống virus - Sản xuất protein động vật hữu nhũ - Tạo các thực vật, động vật chuyển gen - Phân lập và ứng dụng nguồn gen vi sinh xử lý môi trường - Tạo các thuốc điều hòa thể gen - Liệu pháp gen chữa trị các bệnh di truyền 2/21/2016 64 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí 11 Chương Các kỹ thuật phân tích Sinh học phân tử Tách chiết DNA • • • • • 21/02/2016 3:46 CH Để thu nhận DNA tinh cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng là protein Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác các phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích là thu các phân tử nucleic acid trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy các tác nhân học hay hóa học Các nucleic acid cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động các enzyme nội bào (DNase và RNase) Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh nằm thể tích dung dịch lớn Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dạng cặn tủa dễ bảo quản và cần có thể hòa lại nước theo nồng độ mong muốn Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH Tách chiết DNA • Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân • Bước 2: loại protein • Bước 3: thu hồi nucleic acid • • Nguyễn Hữu Trí Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô hỗn hợp chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA • Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng • Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ Loại protein: lắc mẫu dung dịch phenol:chloroform để biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid Protein bị biến tính không hòa tan pha nước có chứa nucleic acid và sau li tâm tủa thành lớp nằm pha nước và pha phenol:chloroform Thu hồi nucleic acid pha nước Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi phân hủy các enzyme và cần có thể hòa lại nước theo nồng độ mong muốn Có thể tủa ethanol isopropanol Sau đó li tâm để thu nhận lại nucleic acid Cặn tủa rửa ethanol 70% để loại bỏ các muối các dấu vết isopropanol 21/02/2016 3:46 CH Tách chiết DNA Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân tách các phần tử hỗn hợp dựa trên tỷ trọng chúng Thời gian và lực ly tâm là chung cho các nhóm phần tử Dung dịch ly tâm có tỷ trọng với giá trị từ thấp đến cao tỷ trọng các phần tử cần phân tách Ly tâm phân đoạn (a) và phân đoạn vùng (b) phân tách các trình tự hỗn hợp dựa trên khối lượng chúng Thời gian và lực ly tâm xác định cho nhóm phần tử Dung dịch ly tâm có tỷ trọng thấp các phần tử cần phân tách 21/02/2016 3:46 CH Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA • 21/02/2016 3:46 CH Ly tâm trên gradient liên tục CsCl: quá trình ly tâm, dung dịch CsCl tự động hình thành gradient đẳng tỉ trọng với tỉ trọng tăng dần từ miệng ống xuống đáy ống Dưới tác động lực ly tâm, các nucleic acid di chuyển ống và đến vị trí có tỉ trọng với tỉ trọng chính nó ngừng lại và hình thành lớp cố định ống Lớp này thu nhận lại sau ly tâm Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH Nguyễn Hữu Trí RNA tổng số Tách chiết RNA •Messenger RNA (mRNA): 1-5% Là mạch khuôn cho quá trình sinh tổng hợp protein • Ribosomal RNA (rRNA): >80% Thành phần cấu trúc nên ribosom • Transfer RNA (tRNA): 10-15% Vận chuyển acid amino tương ứng với codon trên mRNA Phương pháp sắc ký • Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligodTcellulose, dùng để tinh mRNA • Sắc ký lọc gel dùng phân tách các nucleic acid và nucleotic tự sau quá trình tạo mẫu dò (probe) đánh dấu • Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi lượng nhỏ DNA • Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải cao, dùng tinh các oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách các đoạn DNA 21/02/2016 3:46 CH Nguyễn Hữu Trí Phương pháp điện di Các phương pháp định tính và định lượng thô nucleic acid • Điện di gel – Agarose – Polyacrylamide • Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Optical density) 21/02/2016 3:46 CH 10 Nguyễn Hữu Trí Điện di - Electrophoresis • Mục tiêu: • • • Định tính: diện, cấu hình phân tử, kích thước Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng, …) • Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc các nucleic acid: tích điện âm đồng trên khắp bề mặt điện trường nên di chuyển cực dương điện trường • Tính linh động phân tử di chuyển điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel • Kiểu điện di: Agarose, điện di trường xung (PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis) 21/02/2016 3:46 CH 11 Nguyễn Hữu Trí • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel 21/02/2016 3:46 CH 12 Nguyễn Hữu Trí Điện di trên gel Chất nhộm gel - Stain • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel 21/02/2016 3:46 CH 13 Nguyễn Hữu Trí • • 21/02/2016 3:46 CH 15 Nguyễn Hữu Trí • Được dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, 1000 cặp base • Điện di theo phương thẳng đứng • Độ phân giải cao, phân biệt trình tự cách nucleotide • Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ tự ghi, xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh Coomassie, nhuộm nitrate bạc • Ứng dụng: tinh các oligonucleotic tổng hợp, giải trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần nhau, SDS-PAGE (phân tích protein) Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách đoạn có kích thước 0,5-20 kb Điện di theo phương nằm ngang Độ phân giải thay đổi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi Phát phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromide Chất này có khả gắn xen vào các base nucleic acid và phát huỳnh quang tia tử ngoại Ứng dụng: phát trình tự DNA, phân tích hỗn hợp các trình tự DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu • • 14 Điện di trên gel polyacrylamide Điện di trên gel agarose • 21/02/2016 3:46 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH 16 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp định lượng quang phổ kế • Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có mẫu • Nguyên tắc: dựa vào hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm các base • Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid mẫu dựa vào mối tương quan: • Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ: • • • Các phương pháp lai phân tử 50μg/ml cho dung dịch DNA sợi đôi 40 μg/ml cho dung dịch DNA hay RNA sợi đơn Định tính: độ dựa trên tỉ số OD260/OD280, tính chất nucleic acid (mạch đôi/đơn) (280 nm là bước sóng đó các protein có mức độ hấp thụ cao • 21/02/2016 3:46 CH 17 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH 18 Nguyễn Hữu Trí Cơ sở lai phân tử    Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì hai mạch tách rời phá vỡ các liên kết H hai mạch Sau hai mạch tách rời, nhiệt độ phản ứng làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng bắt cặp trở lại Hiện tượng này gọi là lai phân tử Đặc điểm lai phân tử:  Đặc hiệu tuyệt đối: tái bắt cặp xảy hai trình tự hoàn toàn bổ sung với  Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA 19 21/02/2016 3:46 CH Nguyễn Hữu Trí Các kiểu lai phân tử • Lai trên pha lỏng • Lai trên pha rắn • Lai chỗ 21/02/2016 3:46 CH Các kiểu lai phân tử 20 Nguyễn Hữu Trí Các kiểu lai phân tử Lai pha rắn: Một hai trình tự cần lai cố định trên giá thể rắn (màng lai) Phát phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ Ba kĩ thuật lai trên pha rắn thông dụng là Southern blot, Northern blot, Dot blot Lai pha lỏng: Các trình tự cần lai nằm pha lỏng, là dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy các trình tự này gặp chuyển động nhiệt và nhiệt độ môi trường thấp Tm Phương pháp này sử dụng để phát các trình tự tương đồng (giữa các loài hay cá thể) 21 21/02/2016 3:46 CH Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH Các kiểu lai phân tử Nguyễn Hữu Trí Southern blot • Nguyên tắc Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả tiếp nhận DNA đã biết từ lâu và đã sử dụng các nghiên cứu lai axit nucleic khác vào thập niên 1950 và 1960 • Đầu thập niên 1970, đời phương pháp điện di trên gel đã cho phép các đoạn DNA cắt enzyme hạn chế có thể phân tách dựa trên sở kích thước chúng • Từ đó bước phát triển phương pháp là chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose • Phương pháp này E M Southern mô tả Ðại học Edingburgh vào năm 1975 Lai chỗ: Trình tự nucleic acid cần tìm không tách chiết khỏi mô hay tế bào Quá trình lai với mẫu dò đã đánh dấu và phát các phân tử lai thực trên nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô 21/02/2016 3:46 CH 22 23 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH 24 Nguyễn Hữu Trí Southern blot Southern blot Southern blot bao gồm các bước sau: Cắt DNA enzyme hạn chế thích hợp Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose Làm biến tính DNA trên gel, DNA sợi kép tách thành DNA sợi đơn Chỉ DNA sợi đơn có thể chuyển lên màng lai Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay màng nylon) Việc chuyển DNA thường tiến hành hoạt tính mao dẫn khoảng vài tiếng có thể dùng thiết bị thấm chân không Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA giữ nguyên không thay đổi Lai DNA đã cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung DNA trên màng lai với mẫu dò Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin mẫu dò phát quang sinh học Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát phát quang 21/02/2016 3:46 CH 25 Nguyễn Hữu Trí Northern blot Northern Blot: RNA-DNA*(RNA*) • Sau E M Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, Alwine đã dùng phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot vào năm 1977 • Không cần phải cắt RNA restriction enzyme • Dùng formaldehyde để phá cầu nối Hydrogen và biến tính RNA vì mạch đơn RNA tạo cấu trúc thứ cấp và gấp cuộn 27 • Northern blot bao gồm các bước sau: Tách RNA (RNA tổng số mRNA) và xử lý với formaldehyde RNA phân tách điện di trên gel agarose biến tính (có formaldehyde) RNA sau đã phân tách chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí trên gel), thông thường màng nitrocellulose dùng, nhiên có thể dùng màng nylon tích điện dương RNA cố định trên màng lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ gắn với enzyme (alkalin phosphatase horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNADNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép Vị trí mẫu dò phát nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nó đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dò gắn với enzyme thì đem ủ với chất không màu Enzyme liên kết với nó biến đổi thành sản phẩm màu có thể nhìn thấy phát ánh sáng mà phát phim X quang cách trực tiếp 21/02/2016 3:46 CH 28 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp PCR • PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease) là phương pháp sử dụng rộng rãi lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp này Kary Mullis phát minh vào năm 1985; giới thiệu lần đầu tiên Hội thảo lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 • Nguyên tắc phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động DNA polymerase: cần diện mồi chuyên biệt để hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Như vậy, ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA, ta tổng hợp đoạn DNA nằm hai mồi • Phương pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh và chính xác đoạn DNA riêng biệt Ðây thực là phương pháp đại và thuận tiện cho việc xác định có mặt gen nào đó tế bào với độ chính xác cao Northern blot 21/02/2016 3:46 CH 29 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH 30 Nguyễn Hữu Trí Ba giai đoạn chu kỳ phản ứng PCR Giai đoạn biến tính (denaturation) Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính nhiệt độ cao (thường là từ 94-950C, lớn nhiệt độ nóng chảy phân tử) vòng 30 giây đến phút, tất các liên kết hydro hai mạch phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ hạ thấp ( thường từ 40-700C, thấp nhiệt độ nóng chảy mồi sử dụng khoảng từ 3-50C) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần khuyếch đại Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến phút Giai đoạn kéo dài (elongation) Nhiệt độ tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt Công việc DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA bổ sung với DNA mẫu cách kéo dài các phần đã đánh dấu các mồi Thời gian giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước DNA mẫu, 31 Nguyễn Hữu Trí 21/02/2016 3:46 CH thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Các thành phần phản ứng PCR Primer (mồi):  Mồi là đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng bắt cặp bổ sung với đầu DNA mẫu và tạo vị trí bắt đầu tái Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer)  Mồi là tiêu quan trọng phản ứng PCR để định tính đặc trưng và hiệu phản ứng Do đó việc thiết kế mồi cần tuân thủ số nguyên tắc định: dài khoảng 18-24 base; Tm mồi gần nhau; thành phần nucleotic các mồi cần tránh các cặp GC lặp lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại; không hình thành primer dimer, không phải là trình tự lặp lại DNA mẫu (DNA template): hàm lượng đủ không quá cao, tinh – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin, …) PCR cho kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay mẫu DNA không bảo quản tốt Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động Taq polymerase, hàm lượng quá cao tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu nhân enzyme Nồng độ tối ưu phải xác định cho phản ứng qua nhiều thử nghiệm 21/02/2016 3:46 CH Các thành phần phản ứng PCR 33 Biến tính 5 3 Gene mục tiêu DNA gene 3 5 Nguyễn Hữu Trí 5 3 3 5 Bắt cặp Chu kỳ thu phân tử Nguyễn Hữu Trí Phương pháp PCR dNTP: thành phần loại dNTP phải cân bằng, cần làm tăng các lỗi chép polymerase; hàm lượng thường không đổi có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế Enzyme polymerase chịu nhiệt Tag-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên bán trên thị trường Tag-polymerase nhà Vi sinh vật học Thomas Brock phát Thermus aquaticus loài vi khuẩn phát triển mạnh nhiệt độ cao Enzyme chịu nhiệt này giúp giải vấn đề enzyme biến tính sau chu kỳ Từ đó đến nay, số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã khám phá và người ta đã tách chiết thêm các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) Số lượng chu kỳ phản ứng tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu, thông thường số lượng chu kỳ nhỏ 40 cho phản ứng PCR Thời gian chu kỳ phụ thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng nhu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate 96 giếng, các block nhiệt riêng biệt máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR 21/02/2016 3:46 CH 32 Phương pháp PCR Chu kỳ thu phân tử Primer Kéo dài nucleotide Chu kỳ thu phân tử Chu kỳ n thu 2n phân tử Các ứng dụng phương pháp PCR    Hiện thành tựu PCR mở nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng sinh học, y khoa, nông nghiệp, … Một số ứng dụng có tính tổng quát: Sản xuất mẫu dò: PCR giúp sản xuất nhanh lượng lớn mẫu dò đánh dấu thực các phản ứng với cặp mồi chuyên biệt và các nucleotide đánh dấu Khuyếch đại số lượng các RNA: sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR (kết hợp enzyme phiên mã ngược và Taq polymerase; sử dụng Tth polymerase) RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA thông tin tồn với hàm lượng thấp, không thể phát phương pháp cổ điển Northern blot, … Kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuyếch đại các RNA trên mô và tế bào Định lượng phương pháp PCR: dùng để nghiên cứu các trình tự RNA hay DNA có số lượng thấp Trình tự đích khuyếch đại đồng thời với trình tự chứng có nồng độ đã biết, sau phản ứng so sánh hàm lượng sản phẩm, và suy số lượng mẫu ban đầu 37 21/02/2016 3:46 CH • Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Lần đầu tiên công bố vào năm 1977 • Nguyên tắc phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác • Trước hết, phân tử DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ mạch đơn, tạo đoạn đánh dấu có thể phát hình phóng xạ • Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng loại nucleotide mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài kém nucleotide phát điện di Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA phát điện di trên gel polyacriamid có thể xác định trình tự mạch đơn Phương pháp Maxam và Gilbert G A Mảnh ngắn G • Phương pháp xác định vị trí xếp các nucleotid phân tử DNA – Phương pháp Maxam và Gilbert – Phương pháp Sanger – Pyrosequencing – Array sequencing Nguyễn Hữu Trí Phương pháp Maxam và Gilbert Mảnh dài Phương pháp giải trình tự (DNA sequencing) G+A T+C C 3′ A A G C A A C G T G C A G 5′ Phương pháp Maxam và Gilbert Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo nhóm phản ứng - Nhóm phản ứng thứ xử lí mạch đơn DNA dimethyl sulphat làm đứt mạch G - Nhóm phản ứng thứ hai xử lí mạch đơn DNA axit (pH=2) gây đứt mạch đơn A G - Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA hydrazin gây đứt mạch đơn T và C - Nhóm phản ứng thứ xử lí mạch đơn DNA hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt mạch đơn C DMS FA G H G G H+S C A G T T G G G C A G C C C C T C A A C T Phương pháp Sanger Nguyên lý: Sanger, Smith và Coulson công bố vào năm 1977, dựa theo chế tổng hợp DNA Đã giải trình tự hoàn chỉnh gen thực khuẩn thể X 174 Trong quá trình tổng hợp mạch đơn DNA bỏ sung hàm lương nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP) Do ddNTP nhóm OH (carbon số và 3) ngẫu nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại Trình tự đọc theo thứ tự từ lên (5′ - 3′) Dideoxynucleotide dùng DNA sequencing Phương pháp Sanger Phương pháp Sanger A Sự kéo dài kết thúc diện dideoxynucleotide ddATP + four dNTPs C ddCTP + four dNTPs G ddGTP + four dNTPs T ddTTP + four dNTPs ddA dAdGdCdTdGdCdCdCdG dAdGddC dAdGdCdTdGddC dAdGdCdTdGdCddC dAdGdCdTdGdCdCddC dAddG dAdGdCdTddG dAdGdCdTdGdCdCdCddG G Mảnh dài A ddG Mảnh ngắn ddG dAdGdCddT dAdGdCdTdGdCdCdCdG T C 3′ G G T A A A T C A T G 5′ Trình tự đọc theo thứ tự từ lên (5′ - 3′) 44 Giải trình tự máy tự động (Sequencer) • Theo nguyên tắc sử dụng ddNTP Sanger và cộng phát minh • Trong quá trình tổng hợp DNA sử dụng mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang, loại dNTP có màu khác • Máy tổng hợp mạch đơn trên mạch khuôn, dùng phần mềm để xử lý kết Giải trình tự máy tự động (Sequencer) ABI 3100 5-46 Chromatogram Microarray Nguyên tắc: dựa vào kỹ thuật lai 1.Cố định các mẫu dò (oligonucleotide hay sản phẩm PCR) có trình tự xác định trên giá thể rắn thích hợp theo thứ tự 2.DNA mục tiêu đánh dấu, sau đó lai với mẫu dò trên giá thể 3.Dựa vào cường độ phát tín hiệu phân tử đánh dấu để xác định có mặt DNA mục tiêu có mẫu ban đầu Mẫu dò (Probe) DNA mục tiêu • cDNA: sản phẩm PCR các cDNA thư viện cDNA hay từ sưu tập dòng • Oligonuclotide: dài 20-25 mer • Được đánh dấu và sử dụng các chất thị – Được in lên giá thể phát hiện: – Tổng hợp in situ trực tiếp lên giá thể – Chất phát huỳnh quang (Cy3/ Cy5, streptavidin/ – Các oligonucleotide tổng hợp sẵn và in lên giá thể – Gần đây các oligonucleotide dài (50-100 mer) đã phát triển để tăng độ nhạy và tính đặc hiệu • Phương pháp microarray có thể đồng thời phân tích biểu 30.000 gen • Ứng dụng phát các mẫu có mật độ thấp vì microarray cần lượng nhỏ mẫu phycoerythrin) – Chất phóng xạ ( 32P, 33P , 35P) – Chất phát huỳnh quang hoá học (digoxigenein, biotin, Ag, Au) Image analysis of cDNA Microarray array Microarray cDNA microarray The process Microarray MASSIVE PCR Oligonucleotide microarray Microarray PCR PURIFICATION and PREPARATION PREPARING SLIDES PRINTING Chuẩn bị RNA Nuôi và thu tế bào Lai Array Tách RNA tổng số Tổng hợp cDNA Đánh dấu cDNA Chân thành cảm ơn 21/02/2016 3:46 CH 55 Nguyễn Hữu Trí 10