bài giảng sinh học phân tử

17 Ø Một số trình tự DNA ở prokaryote, eukaryote, plasmid và nhiều virus khó phân biệt được khái niệm sợi mang nghĩa và sợi đối nghĩa vì có hiện tượng các chồng gen overlapping gene.. Ø

SINH HỌC PHÂN TỬ 2

SH2005 Học kỳ I, Năm học 2014 - 2015

Keep calm & Study Molecular Biology

“Stay hungry Stay foolish.” Steve Jobs

số tiết =>>> KHÔNG nghỉ quá 02 buổi học

SINH HỌC PHÂN TỬ 2 SH2005

Hình thức kiểm tra & Thi

ü  Kiểm tra giữa kỳ: 01 bài, trắc nghiệm Theo lịch đào

tạo

ü  03 bài kiểm tra nhanh 10 phút đầu giờ: tự luận,

ü  Thi cuối kỳ: trắc nghiệm, theo lịch đào tạo

ü  Seminar: theo nhóm, trình bày powerpoint

SINH HỌC PHÂN TỬ 2 SH2005

Nội dung:

Chương 1 Genome và sự hoạt động của gene

Chương 2 Các cơ chế điều hòa biểu hiện gene ở tế bào prokaryote

Chương 3 Sự phức tạp trong quá trình điều hòa biểu hiện gene ở tế bào eukaryote

Chương 4 Vận chuyển hướng đích và phân giải protein Chương 5 Epigenetics và sự điều hòa biểu hiện gene

1.  Thế nào là nucleotide?

2.  Phân tử DNA có 2 sợi Sợi nào sẽ được phiên mã?

3.  Sợi DNA mang nghĩa (sense/coding) và đối nghĩa

(antisense/ anti coding)?

4.  Quá trình phiên mã diễn ra theo hướng nào? và bắt đầu

từ đầu nào của phân tử DNA antisense?

5.  Quá trình dịch mã được diễn ra từ chiều nào của sợi

mRNA?

6.  Trình tự acid amin của chuỗi peptid được tổng hợp được bắt đầu từ chiều nào, đầu C hay N tận cùng?

1953 Double helix structure, 1962 Noble Prize

Hai loại nucleic acid DNA và RNA

•   DNA : D eoxyRibo N ucleic A cid

•   RNA : R ibo N ucleic A cid

H

O

CH2H

Dạng biểu diễn của nucleotide

(RNA & DNA)

Molecular Biology Understanding the Genetic Revolution

Bazo Nito – Purine

•  Purine gồm

– Adenin (A)

– Guanine (G)

Cấu trúc phân tử DNA

Sợi mang nghĩa và sợi đối nghĩa (sense and antisense)

16

Ở cả prokaryote và eukaryote các trình tự antisense

RNA đều được tạo ra nhưng chức năng chưa rõ Có khả năng các antisense RNA liên quan đến việc điều hòa

quá trình biểu hiện gen thông qua tương tác RNA-RNA

Cả hai trình tự sense và antisense đều tồn tại ở

những phần khác nhau của cùng một sợi DNA (nói

cách khác cả 2 sợi đều chứa các trình tự sense và

antisense)

5‘

5‘

17

Ø  Một số trình tự DNA ở prokaryote, eukaryote, plasmid và

nhiều virus khó phân biệt được khái niệm sợi mang nghĩa và sợi đối nghĩa vì có hiện tượng các chồng gen (overlapping gene)

Ø  Trong những trường hợp này một số trình tự DNA có thể mã hóa cho một protein trên sợi này và một protein khác trên sợi kia (theo chiều ngược lại)

Số lượng gene: Human Genome Project

•  Năm 1999, dự đoán có khoảng hơn 100.000 mã hóa cho protein Tuy nhiên thực tế chỉ có khoảng hơn 20.000 gene được xác định (2004)

•  Sau năm 2004, các hướng tiếp cận bioinformatics kết hợp với việc các nghiên cứu genome đã kiểm tra các transcriptome, xác định trình tự các thư viện cDNA, thử nghiệm (tạo ra các RNA ức chế các miRNA còn gọi là antagomir)

Có rất nhiều các bản phiên mã (transcript) không mã hóa cho

protein, những bản phiên mã này bao gồm các snoRNA và miRNA

Cấu trúc hóa học RiboNucleotide Cấu trúc không gian của RNA

Liên kết photphodieste

ü  RNA mã hóa (mRNA) và

ü  RNA không mã hóa (non-coding RNA)

(khoảng 97% ở eukaryote)

21

RNA thông tin (mRNA) là RNA mang thông tin từ DNA đến ribosome để thực hiện quá trình dịch mã

Trình tự mRNA quyết định trình tự amino acid trong phân

tử protein được tạo ra

RNA mã hóa (mRNA)

22

u Những RNA không mã hóa protein (non-coding RNA) có thể được mã hóa bởi các gene mã hóa cho non-coding

RNA, hoặc cũng có thể từ các mRNA intron

u Non-coding RNA bao gồm:

Các RNA không mã hóa (non-coding RNA)

1.  rRNA

2.  tRNA

3.  snRNA (small nuclear RNA)

4.  miRNA (micro RNA)

5.  snoRNA (small nucleolar RNA)

6.  ribozyme

Section 12-3

mRNA

- Các mRNA có cấu trúc

đa dạng thường ngắn hơn đoạn gen DNA mà nó được mã hóa,

- mRNA sinh vật nhân thật: sau khi được phiên

mã từ DNA được đính mũ

7 methyl-Gppp vào đầu 5’

và đuôi 3’ là polyA

tRNA

•  Là phân tử RNA nhỏ (74-95 nu) có vai trò vận chuyển aa

•  tRNA gắn aa ở đầu 3‘ (aminoacyl tRNA synthetase)

•  Mỗi loại tRNA gắn với chỉ 1 loại aa

•  Tính thoái hóa của mã di truyền (nhiều bộ ba cùng mã 1 aa) Do đó có nhiều tRNA khác nhau mang các vùng đối

mã khác nhau có thể mang cùng một loại aa

Số lượng gene mã hóa cho tRNA rất

497 tRNA gene ở nhân mã hóa

cho các tRNA ở tế bào chất

324 tRNA có nguồn gốc từ các

gene giả (pseudogenes)

Genes mã hóa cho tRNA

•   rRNA có tính bảo thủ rất cao ở tất cả các tế bào Các gene mã hóa cho

rRNA (rDNA) có trình tự rất giống nhau ở các sinh vật trong cùng một taxon Do đó,

hàng nghìn trình tự rRNA được biết và lưu trữ trong các CSDL đặc thù

•  Tại Bỉ, CSDL về trình tự rRNA được lưu trữ bao gồm CSDL về các

SSU (small subunit) và LSU (large subunit) của rRNA

sinh vật trong quá trình tiến hóa Trên thực tế người ta thường so sánh trình tự của các gene mã hóa 16S (vi khuẩn), 18S, 23S ở (eukaryote) để đánh giá mối quan hệ họ

hàng

của vi khuẩn bị tấn công bởi chloramphenicol, trong khi rRNA 80S của eukaryote không bị ảnh hưởng gì

29

snRNA (small nuclear rRNA)

•  snRNA là một lớp của các phân tử RNA nhỏ tìm thấy ở

trong nhân của eukaryote snRNA được phiên mã bởi RNA pol II

•  snRNA liên quan đến quá trình loại bỏ intron khỏi các

pre-mRNA (hn RNA), điều hòa phiên mã và duy trì các telomere

•  Các snRNA thường kết hợp với các protein để tạo thành

phức hợp snRNP (small nuclear ribonucleoprotein)

•  Một nhóm lớn trong số các snRNA là snoRNA (small

nuleolar)

31

snoRNA

•  Small nucleolar RNAs (snoRNAs): là một lớp các phân tử RNA nhỏ có vai trò giúp cho các quá trình cải biến hóa học của các RNA khác, chủ yếu là rRNA, tRNA và snRNA

ü  C/D box snoRNA: liên quan đến quá trình methyl hóa

ü  H/ACA box: liên quan đến quá trình pseudouridyl hóa

•  Ở động vật có xương sống, các gene snoRNA nằm trong các vùng intron của các protein liên quan đến tổng hợp ribosome hoặc các

protein tham gia trong quá trình dịch mã Các snoRNA được tổng hợp

pseudouridyl (Ψ) hóa là quá trình tạo ra các dạng đồng phân của uridine (glycosyl) trong phân tử RNA dưới sự xúc tác của các enzym gọi là Ψ synthases

33

miRNA

•  MicroRNAs (miRNAs) là các phân tử RNA có chiều dài trung bình 22 nucleotide

với các trình tự ở vùng không được dịch mã (3' UTRs) của phân tử

mRNA đích Kết quả thường dẫn đến làm gene không hoạt động (không

34

miRNAs được tạo ra từ gene hoặc từ các intron

miRNP: Ribonucleoprotein complex

1 ds RNA is introduced into the cell either

using a short oligo (Short Interfering RNA)

siRNA or a DNA plasmid from which an siRNA can be transcribed

2 The Dicer protein in the cell digests dsRNA into 21 bp ds RNA (siRNA)

3 siRNA’s are integrated into the RNA

Induced Silencing Complex (RISC)

4 Within this RISC complex, the double

stranded siRNA’s undergo strand separation The antisense strand hybridizes to the

complementary / target mRNA in the cell

5 Nucleases within the activated RISC

degrade targeted mRNA

6 The fragmented mRNA cannot be

translated into protein This means the protein cannot be expressed, resulting in knockout of the protein

•  Giống như DNA, RNA có thể mang thông tin di truyền Ví dụ: Các virus RNA có genome là RNA mã hóa cho nhiều protein

•  Các viroid là nhóm chỉ chứa RNA vòng, ở dạng trần không có vỏ (capsid) RNA của viroid không mã hóa bất kì protein nào và được sao chép bởi các polymerase của tế bào chủ

•  RNA sợi kép (dsRNA): là RNA có 2 sợi bổ sung giống như DNA dsRNA là genome của một số dsRNA virus Các dạng dsRNA chẳng hạn như RNA virus hoặc siRNA có thể gây ra quá trình RNA

inteference ở eukaryote

Where am I?

Trình tự nucleotide trên các NST đã được xác định

39

Cấu trúc gene prokaryote và eukaryote

1.  Người ta vẫn cho rằng các IGR là những „junk“ DNA

2.  Phần lớn chức năng của các IGR vẫn chưa rõ Trong một số it trường hợp IGR tham gia điều khiển các gene xung quanh,

3.  Ở người, các IGR chiếm một phần lớn trong genome Có thể các RNA không mã hóa định vị trong những vùng IGR, và vì vậy các IGR có thể tham gia điều hòa biểu hiện gene

4.  Cần phân biệt rõ IGR và intron (intragenic)

Intergenic region

Intergenic region (IGR) là một vùng trình tự DNA định vị ở giữa các cụm gene (clusters of genes) IGR có thể chứa ít hoặc không có gene nào

Khái niệm gene?

•  Gene có nhiều loại:

–  Gene tạo ra sản phẩm là protein, tRNA, rRNA: Gen cấu trúc

–  Gene kiểm soát sự biểu hiện và mức độ biểu hiện của các gene khác: Gene điều hòa

–  Một số gene cần thiết phải được biểu hiện ở tất cả các mô: House keeping gene (Liên quan đến quá trình sinh tổng hợp protein)

–  Các gene khác chỉ biểu hiện ở những tế bào, mô nhất đinh: Gene đặc hiệu mô Chẳng hạn gene mã hóa insulin chỉ biểu hiện ở tế bào tuyến tụy (pancreatic β-cells)

Tóm lại cho dù thực hiện chức năng nào thì tất cả các gene chứa một vùng

mã hóa để tạo ra một chuỗi polypeptide hoặc một phân tử RNA

n   Gene: một đoạn DNA nằm trên NST mã hóa cho một hoặc nhiều

protein/ RNA

Gene và hoạt động của gene ở prokaryote

1.  Mật độ gene cao (ít hoặc không có intron)

2.  Các gene thường tập trung trong một cụm gọi là operon

3.  Có 1 loại RNA polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp tất cả các loại RNA

4.  Quá trình phiên mã diễn ra đơn giản không đòi hỏi các giai đoạn xử lý sau phiên mã

5.  Quá trình dịch mã diễn ra đơn giản không hoặc ít đỏi hỏi các cải biến sau dịch mã

Start codon Stop codon

Vùng Promoter

•  Shine-Dalgarno box (AGGAGG)

•  Pribnow box (TATAAT)

Cấu trúc gene Prokaryote

• 

So sánh trình tự vùng promoter ở E.coli

Monocistronic & polycistronic mRNA

•  1 phân tử mRNA được coi là monocistronic khi nó chỉ chứa thông tin để dịch mã cho duy nhất 1 phân tử protein Hầu hết các mRNA của eukaryote thuộc loại này

•  Polycistronic mRNA mang thông tin của một số gene, các gene này sẽ được dịch mã thành nhiều proteins (operon) Hầu hết các mRNA tìm thấy ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ ở dạng polycistronic

•  Dicistronic hoặc bicistronic: mRNA mã hóa cho 2 protein

mRNA

Khoảng cách giữa 2 vùng trình tự không phải là 17 nucleotide

Mỗi lần phiên mã cách nhau khoảng 10 phút (E.coli)

RecA promoter là một promoter mạnh

CTGACG 18 CTG

araBAD promoter là một promoter yếu

Shine-Dalgarno sequence

1.  Đề xuất bởi John Shine và Lynn Dalgarno năm 1975

2.  Trình tự Shine-Dalgarno chỉ tồn tại ở Prokaryote, gồm khoảng 4-7 base phía trước của mã khởi đầu (AUG) trên mRNA

3.  Consensus sequence gồm 6 base: AGGAGG (ở E.coli

AGGAGGU)

4.  Giúp cho việc gắn của ribosome vào mRNA để khởi đầu tổng hợp protein

5.  Trình tự Shine-Dalgarno bổ sung với trình tự

gaucaCCUCCUuaOH định vị ở đầu 3‘ của 16S rRNA

6.  Đột biến ở vùng trình tự Shine Dalgarno sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả dịch mã

Khởi đầu dịch mã: Trình tự Shine-Dalgarno

GGAGGNNNNN AUG

Các đặc điểm chính của tổ chức gene ở eukaryote

1.  Mật độ gene thấp (3% mã hóa, 27% các trình tự promoter

và intron)

2.  Các gene khác nhau về thành phần và kích thước

3.  Có 3 loại RNA polymerase (từ 8-12 protein)

4.  Các trình tự promoter tập trung ở vùng 5‘ upstream (có thể khá xa)

5.  RNA pol I: (50% tổng các RNA được tổng hợp trong tế

bào: 18S, 5.8S, 28S )

RNA pol II (mRNA, hầu hết snRNA và microRNA)

RNA pol III (5S rRNA, tRNA và các RNA nhỏ khác)

6 Mỗi gene có trình tự promoter khác nhau: Chẳng hạn

TATA box (-25) chiếm 70% các gene

n   Tín hiệu polyadenyl hóa

Những tín hiệu quan trọng cho việc nhận biết

gene ở Eukaryote

Promoter của Eukaryote

1.  Các promoter của eukaryote cực kỳ đang dạng và rất khó xác định

2.  Các promoter thường nằm ở vùng upstream của gene và

có thể có các yếu tố điều hòa nằm xa điểm khởi đầu phiên

mã vài kb

3.  Phức hợp phiên mã ở eukaryote có thể làm cho DNA bẻ gập vì thế nó cho phép các yếu tố điều hòa nằm ở vị trí rất

xa có thể tham gia trong quá trình phiên mã

4.  Nhiều promoter chứa TATA box (trình tự TATAAA) Trình tự này sẽ gắn với TATA binding protein (hỗ trợ cho RNA pol)

CAT box

1.  CCAAT box (CAAT box/ CAT box) là một vùng trình tự phổ biến với các nucleotide GGCCAATCT định vị cách

vị trí khởi đầu phiên mã khoảng 75-80 bases

2.  CAAT box cung cấp tín hiệu cho việc bám của các TF (transcriptin factor) cùng với sự tham gia của GC box

3.  CAAT và GC box thường định vị ở cách TATA box

khoảng +100-150bp

•  GC box nằm trong vùng Promoter thường có trình tự GGGCGG-3’

5’-•  Nằm ở vị trí +100-150 cách TATA box

•  Tham gia vào quá trình bám của các TF cho việc khởi đầu quá trình phiên mã

Vị trí CpG là những vùng DNA mà ở đó một nucleotide

Cytosine kế cận với một nucleotide Guanine CpG là ký

hiệu viết tắt cho C-Phosphate-G

CpG island: là những vùng trong genome có nhiều vị trí CpG Trong genome của động vật có vú, các CpG island có chiều dài từ 300-3000 cặp base Chúng nằm liền kề nhau trong

vùng promoter Khoảng 70% promoter của các gene ở người

có thành phần CpG rất cao

Là một trình tự có mặt trên mRNA của eukaryote, có tính phổ biến

Các base bảo thủ xung quanh mã khởi đầu của các

mRNA ở người

Kozak consensus sequence:

Đặc điểm cơ bản của một số vector biểu hiện