Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường

Ngày nay, nước ta có nhiều nhà máy đường tạo ra một sản lượng lớn về đường kết tinh. Bên cạnh đó một lượng không nhỏ mật rỉ đường mà các nhà máy này thải ra làm ô nhiễm môi trường. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị như Llysine, acid citric, acid glutamic.v.v. và đặc biệt là acid lactic được quan tâm nhiều trong những năm gần đây.

1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, nước ta có nhiều nhà máy đường tạo sản lượng lớn đường kết tinh Bên cạnh lượng khơng nhỏ mật rỉ đường mà nhà máy thải làm ô nhiễm môi trường Với ứng dụng Công nghệ Sinh học sử dụng phế liệu mật rỉ để lên men tạo nhiều sản phẩm có giá trị L-lysine, acid citric, acid glutamic.v.v đặc biệt acid lactic quan tâm nhiều năm gần Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày nhiều, chúng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực bảo quản chế biến thực phẩm, y học, môi trường (acid polylactic thay loại sản phẩm nhựa PE, pp, đĩa CD, bịch nilon), mỹ phẩm.v.v Tổng thị trường giới acid lactic 86.000 vào năm 2001, 500.000 vào năm 2010 Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dược Ildong (Hàn Quốc) xuất số lượng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dược Việt Nam với giá trị hợp đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40] Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đồng ý Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Dưới hướng dẫn Thầy Nguyễn Đức Lượng trường Đại học Bách Khoa Thầy Phan Vĩnh Hưng Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm TP.HCM Chúng thực đề tài “Nghiên cứu trình lên men lactic từ mật rỉ đuờng” 1.2 Mục đích đề tài Chọn vi khuẩn có khả sinh acid lactic nhiều để sản xuất acid lactic 1.3 Yêu cầu - Phân lập vi khuẩn lactic - Tuyển chọn khuẩn lạc có khả lên men lactic - Khảo sát điều kiện tối ưu cho trình lên men - So sánh tạo acid tổng khuẩn lạc - Sản xuất acid lactic từ mật rỉ PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giói thiệu acid lactic Acid lactic, 2-hydroxypropionic acid (CH3CHOHCOOH) acid tồn rộng rãi tự nhiên, tìm thấy người, động vật, thực vật vi sinh vật Được phát vào năm 1780 nhà hóa học Thụy Điển Sheele sữa chua Acid lactic chấp nhận sản phẩm trình lên men vào năm 1847 [2], [25], [32] Trong cấu tạo phân tử acid lactic có carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - acid lactic L - acid lactic Hai đồng phân quang học có tính chất hóa lý giống nhau, khác khả làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, sang phải sang trái Do tính chất sinh học chúng hoàn toàn khác I -axi: L: •: 71-:: D -a:d L: :;:K Loại L - acid lactic dạng tinh thể Chúng có khả tan nước, tan cồn, tan eter, không tan CHCI3, nhiệt độ nóng chảy 28° c [9] L - acid lactic ứng dụng công nghiệp thực phẩm dược phẩm Hầu hết sinh vật lên men lactic đồng hình tạo dạng đồng phân quang học [32] Loại D - acid lactic dạng tinh thể, tan nước tan cồn Nhiệt độ nóng chảy 28° c Neu D - acid lactic L - acid lactic có hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 người ta gọi hỗn hợp Raxemic Trong q trình lên men khơng có hỗn hợp có tỉ lệ lý tưởng mà có hỗn hợp tiến hành tổng hợp hữu co DL - acid lactic có khả tan nước, cồn, không tan CHCI3 [9] 2.2 Vi sinh vật lên men lactic Vi khuẩn lactic phân lập từ trồng giới bao gồm hạt trái rau [24] Các lồi Lactobacillus cịn tìm thấy dày, ruột non, ruột già âm đạo [21] Vi khuẩn lactic vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, tỉ lệ G+C thấp, cầu khuẩn hay hình que Chúng sản xuất acid lactic sản phẩm lên men Chúng khơng có enzyme catalase catalase giả tìm thấy trường hợp khơng phân giải oxi già Các thành viên nhóm thiếu cytochrome Tất vi khuẩn lactic phát triển điều kiện kị khí Tuy nhiên, khơng giống vi khuẩn kị khí, hầu hết vi khuẩn acid lactic khơng nhạy cảm với oxi phát triển tốt điều kiện có mặt oxi khơng có mặt oxi Vì chúng vi khuẩn kị khí tùy ý (Madigan et al 2000) [30] Sự phân chia vi khuẩn lactic dựa vào sản phẩm q trình trao đổi chất carbohydrate, lồi Lactobacillus phân chia thành nhóm [23], [19] - Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc có fructose-l,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) khơng có phosphoketolase Chúng lên men hexose để tạo acid lactic không lên men pentose.) - Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý (có FDP aldolase cảm ứng phosphoketolase Tuy nhiên, hexose lên men đồng hình pentose chuyển thành acid lactic ethanol acid acetic) Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc (Có phosphoketolase khơng có FDP aldolase, q trình trao đổi chất hexose pentose lên men dị hình) Bảng 2.1 Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler Weiss, 1986) Đặc đểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Lên men pentose - + + Tạo C02 từ glucose - - + Tạo C02 từ gluconate - +a +a Sự diện FDP aldolase + + - Sự diện phosphoketolase - +b + L acidophilus L casei L L brevis L L delbrueckii curvatus L buchneri L L helveticus L plantarum L ỷermentum L salivarìus sake reuteri Một vài đại diện a: Khi lên men b: Cảm ứng có pentose Một đặc điểm quan trọng dùng để phân biệt giống vi khuẩn acid lactic lên men glucose duới điều kiện chuẩn nhu: nồng độ glucose yếu tố tăng truởng (các tiền chất acid amin, vitamin acid nucleic) khơng giới hạn giới hạn sử dụng oxi Duới điều kiện này, vi khuẩn acid lactic phân thành hai nhóm: lên men lactic đồng hình chuyển hầu hết luợng glucose để tạo thành acid lactic lên men lactic dị hình glucose lên men tạo thành acid lactic, ethanol, acid acetic C02 Thật việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose phân biệt đuợc hai nhóm (Sharpe, 1979) .2.1 Vi khuẩn lactic dị hình Khi tiến hành lên men dung dịch đuờng, vi khuẩn lactic dị hình thuờng tạo luợng acid lactic khơng lớn Ngồi acid lactic chúng cịn tạo hàng loạt sản phẩm khác nhu acid acetic, ethanol, C02 [3], [9] Một số loài vi khuẩn lactic dị hình đuợc nghiên cứu nhu sau: - Lactobacillus pasteurianus Trực khuẩn, gram duong, kích thuớc rộng 0,5 - pm; dài 7,0-35 pm Trong thiên nhiên chúng tồn riêng lẽ, khơng di động Có khả lên men đuợc, glucose, ữuctose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin Trong trình lên men tạo số sản phẩm C02, alcohol, acid lactic, acid acetic Nhiệt độ thích họp 29 - 33° c, pH thích họp [9] - Lactobacillus brevis Thuộc trực khuẩn, gram dương, khơng có khả di động, kích thước rộng 0,7 -1,0 pm, dài 2,0 - 4,0 pm Trong thiên nhiên chúng liên kết với thành chuỗi Trong q trình phát triển, chúng sử dụng lactat canxi nguồn cung cấp cacbon Chúng có khả lên men loại đường glucose, ữuctose, galactose, maltose Chúng lên men mannitol, glycerol, dextrin, tinh bột Chúng khơng hóa lỏng gelatin [18] - Lactobacillus lycopessici Trực khuẩn, gram dương, thiên nhiên chúng tồn đơi một, có khả tạo bào tử Trong trình lên men đường, chúng tạo cồn, acid lactic, acid acetic C0 - Streptococcus cumoris Thuộc loài cầu khuẩn, thiên nhiên chúng tồn thành chuỗi dài Thuộc gram dương, nhiệt độ thích hợp phát triển 30° c, không phát triển nồng độ NaCl % Khi lên men đường tạo acid acetic, diacetyl, C0 Chúng có khả tạo chất kháng khuẩn - Streptolacticus lactic Thuộc chồi cầu khuẩn, gram dương, nhiệt độ phát triển từ 10 - 45° c, có khả chịu nồng độ NaCl % Khi lên men đường glucose, maltose, lactose, xylose, saccharose, mannitol, tạo acid lactic, acid acetic, diacetyl, C0 Chúng khơng có khả lên men glycerol, sorbitol - Streptococcus ỷaecalis Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dương Nhiệt độ tối ưu 37° c, nhiệt độ sinh trưởng 10 - 45° c, phát triển duới 5° c, phát triển 50° c Có khả sống sót 62,8° c 30 phút Phát triển pH 9,6 Chịu nồng độ NaCl %, % 6,5 % Có khả lên men đường glucose, maltose, lactose ln ln lên men mannitol; có khơng thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol [18] .2.2 Vỉ khuẩn lactỉc đồng hình Khi tiến hành lên men dung dịch đường vi khuẩn lactic đồng hình thường tạo acid lactic chủ yếu [3], [9] Một số loài vi khuẩn lactic điển hình nghiên cứu kỹ sau: - Lactobacillus acidophilus Lần phân lập Moro (1900) phân lập từ phân trẻ so sinh qua phẩu thuật bê đẻ Có dạng hình que, chịu nhiệt, q trình lên men tạo 2,2 % acid lactic [4], [17] Chúng có kích thước rộng 0,6 - 0,9 pm, dài 1,5 - 6,0 pm Trong thiên nhiên chúng tồn riêng lẽ Đôi chúng tạo thành chuỗi ngắn Trên môi trường gelatin: chúng không phát triển 20° c, khơng có khả hóa lỏng Trên mơi trường khoai tây khơng phát triển Chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram dưong khơng di động Chúng có khả lên men đường glucose, íructose, galactose, maltose, lactose, để tạo acid lactic Chúng khơng có khả lên men glycerol, mannitol, sorbitol Không thể phát triển môi trường khơng có carbohydrate Nhiệt độ tối ưu 37° c Nó phát triển từ 20 - 22° c Nhiệt độ phát triển tối đa 43 - 48°c [18] - Lactobacillus bulgaricus Chúng tìm Mesnhicov sữa chua Bungari [14] Thuộc loại trực khuẩn có kích thước dài, liên kết với tạo thành chuỗi, gram dưong Chúng khơng có khả di động, có khả lên men loại đường glucose, lactose, galactose Có thể lên men ữuctose, maltose sucrose khơng lên men xylose, mannitol, dextrin Chúng khơng có khả tạo nitrit từ nitrate [9] Quá trình lên men tạo 3,7 % acid lactic [14] Trên môi trường khoai tây, có khuẩn lạc trắng vàng [18] pH thích hợp cho phát triển pH = 5,2 - 5,6 [7] Nhiệt độ tối ưu 45 - 50° c Tối thiểu 22° c [20] Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thường chọn để lên men Whey để tạo acid lactic, sau dùng Ca(OH)2 để trung hòa lượng acid lactic tạo thành Nhiệt độ lên men 43° c, với nhiệt độ đủ để ức chế vi sinh vật gây nhiễm mà không ức chế L bulgaricus [22] - Lactobacillus biỷidus Trực khuẩn nhỏ, kích thước trung bình khoảng pm, khơng có khả di động, thuộc gram dưong Chúng đứng riêng lẽ, cặp chuỗi ngắn Có khả lên men loại đường glucose, ữuctose, galactose, saccharose, dextrin, tinh bột maltose [18] - Lactobacillus casei Vi khuẩn phân lập từ sữa, sản phẩm sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng chăn nuôi, vi khuẩn dạng hình que, kích thước 0,7 - 1,1 pm; 2,0 - 4,0 pm, trực khuẩn nhỏ thường gặp dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4] Chúng thuộc gram dưong, khơng có khả lên men loại đường glucose, ữuctose, galactose, maltose, lactose mannitol; có lên men sucrose Nhiệt độ phát triển tối ưu 30° c, thấp 10° c Tối đa 37 - 40° c vài chủng 45° c Quá trình lên men tạo khoảng 1,5 % acid lactic [18] - Lactobacillus causaciccus Trực khuẩn ngắn, khả di động, gram dưong Chúng có khả lên men loại đường glucose, ữuctose, galactose, maltose, lactose, mannitol Nhiệt độ phát triển tối ưu 48 - 55° c [9] - Lactobacillus delbrueckii Thường gặp chúng hạt đại mạch [14] Vi khuẩn chịu nhiệt, tìm thấy lồi hạt ngũ cốc tinh bột, giống vi khuẩn có khả đồng hóa tinh bột Trực khuẩn dài, kích thước 0,5 - 0,8 pm; 2,0 - 9,0 pm, không di động, gram dưong Quá trình lên men tạo 2,5 % acid lactic Chúng có khả lên men glucose, ữuctose, maltose, sucrose, galactose dextrin Chúng khơng có khả lên men xylose, lactose, tinh bột, mannitol Nhiệt độ tối ưu 45°c [9], [18] -Lactobacillus leichmannii Trực khuẩn gram dưong Kích thước tế bào 0,6 - pm Vi khuẩn có khả tạo thành chuỗi ngắn, không di động, gram dưong Nhiệt độ tối ưu 36° c Tối đa 40 - 46° c Chúng khơng có khả tạo nitrit từ nitrate Có khả lên men glucose, ữuctose, maltose, saccharose Trong môi trường khoai tây chúng tạo 1,3 % acid lactic [18] - Lactobacillus helveticcus Thuộc trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,9 pm; 2,0 - 6,0 pm Trong thiên nhiên chúng tồn riêng tế bào, tồn thành chuỗi tế bào Nhiệt độ phát triển 40 - 42° c Chúng có khả lên men glucose, ữuctose, galactose, maltose lactose [9] - Lactobacỉllus thermophỉllus Trực khuẩn, gram dương, kích thước tế bào 0,5 - 3,0 pm, khơng có khả di động Lên men glucose, lactose, sucrose, tinh bột dạng glycerol Không tạo acid từ mannitol Lên men ữuctose, galactose, maltose dextrin Không tạo nitrit từ nitrate Nhiệt độ tối ưu 50 - 62,8° c Nhiệt độ tối thiểu 30° c, nhiệt độ tối đa 65° c Điểm nhiệt độ chết khoảng 71° c 30 phút [18] - Lactobacillus plantanrum Trực khuẩn, gram dương, kích thước tế bào 0,7 - 1,0 pm; 3,0 - 8,0 pm Nhiệt độ tối ưu 30° c Tối thiểu 10° c, tối đa 40° c Điểm nhiệt độ chết từ 65 - 75° c 15 phút Có khả chịu nồng độ NaCl 5,5 % Chúng có khả lên men glucose, ữuctose, galactose, sucrose, maltose lactose Tinh bột khơng lên men Không tạo nitrit từ nitrate [18] - Lactobacillus sporogenes Thuộc giống Lactobacillus dựa đặc tính Nakayama Yanoshi (1967) Chúng thuộc Gram dương, có khả sinh bào tử, có dạng hình que, kích thước 3-5 pm, thuộc vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn lactic đồng hình sản xuất axít lactic L(+) - (dextrorotraytory), phát triển nhiệt độ dao động từ 35 - 50° c, pH tối ưu dao động từ 5,5 - 6,5, phản ứng với catalase dương tính Tạo acid từ glucose, galactose, ữuctose, maltose sucrose Khơng có thủy phân tinh bột casein, khơng hóa lỏng gelatin phản ứng indol âm tính khơng tạo khí [31] 2.3 Cơ chế tạo acid lactic [20] Kluyver chia vi khuẩn lactic thành nhóm dựa vào sản phẩm cuối q trình chuyển hóa glucose Q trình tạo acid lactic sản phẩm từ lên men glucose gọi lên men đồng hình, số lượng acid lactic đồng hình thu nhiều lactic dị hình khoảng lần Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lượng mole lactat, CƠ2 ethanol Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình dị hình [20] Lên men đồng hình Sinh vật Dạng Lên men dị hình % G+C Sinh vật lactat Dạng % G+C lactat Lactobacillus Lactobacillus L acidophilus DL 36,7 L brevis DL 42,7 - 46,4 L bulgaricus D(-) L(+) 50,3 46,4 L buchneri L casei L cellobiosus DL DL 44,8 53 L coryniýormis DL 45 L coprophilus DL 41,0 L curvatus DL 43,9 L ỷermentum DL 53,4 L delbrueckii D(-) DL 50 39,3 L hilgardii L helveticus L sanýrancisco DL DL 40,3 38,1 - 39,7 L jugurti DL 36,5-39,0 L trichoides DL 42,7 L jensenii D(-) 36,1 L ỷructivorans DL 38-41 L lactis D(-) 50,3 L pontis DL 53-56 L leichmannii D(-) 50,8 Leuconostoc L plantarum DL 45 L.cremoris D(-) 39-42 L salivarius L(+) 34,7 L.dextranicum D(-) 38-39 L lactis D(-) 43-44 L.mesenteroides D(-) 39-42 Pediococcus p.acidilactici DL p.cerevisiae DL L.gelidum D(-) 37 DL 38 L.camosum D(-) 39 S.bovis D(-) 38-42 c.divergens 33,0 - 36,4 S.thermophilus D(-) 40 c.mobile 35,5 - 37,2 c.gallinarum 34,3 - 36,4 33,7 - 36,4 p.pentosaceus 44,0 Streptococcus Camobaterium Lactococcus L.lactis subsp lactis D(-) 38,4 - 38,6 C.piscicola L.lactissúbsp.cremoris L lactissubsp hordniae D(-) 38,0 - 40,0 35,2 Weisseũa W.confusa DL 44,5 - 45,0 L.garvieae 38,3 - 38,7 w.hellenica D(-) 37-47 L.plantarum 36,9 - 38,1 W.halotolerans DL 45 L.raffinolactis 40,0 - 43 w.kandler DL 39 W.minor DL 44 V.ýluvialis 33,6 w paramesenteroides D(-) 38-39 v.salmoninarum 36,0 - 36,5 w.viridescens DL 43 DL 38-42 Vagococcus Oenococcus O.oeni 2.3.1 Vỉ khuẩn lactỉc dị hình [9] Tất vi khuẩn lactỉc dị hình thường thiếu hai loại enzỵtn quan trọng aldolase hexose isomerase Do giai đoạn đầu q trình lên men, chúng thường tiến hành theo đường hexose monophosphate hay gọi đường pentose phosphate (PP ) Q trình chuyển hóa đường trình bày sau: ơluc ose \[/ Glu cos e -ố - ph ospha te M/ - ph osph oglu c on a t e \/ Ribulose-5 -ph-osphate 'V Xylulose-5-phospbate p hosphoketola se Glyceraldehyde-3-phosphate Acetyl-phosphate ;3"dipbosphoglycerat.e ị Acetyl-CũA A c e taldehvđe -ph o s ph ogíyc e r at e M -phosph oglyc / er ate I V Ethanol phosph oenolpyiTi va te I pyiaívate ĩ A c i d lactic 3.2 VỈ khuẩn lactíc đằng hình Q trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase hexose ỉsomerase thỉếu phosphoketolase Chúng sử dụng đường Embden-Meyerhoí-Pamas (EMP) để tạo phân tử lactat từ phân tử glucose [9], [19], [20] Q trình chuyển hóa trình bày sau: Glucose V Gluc ỬS e-6-ph ửsphate iructose-6 -ph s phat e ị Fructose-l,6-diphosphate Aldolase Glyc e ralde hy de - -ph o s ph a t > D ihydroxy-ac etone -phosphate / 1,3-ầphosp ìoglyc erate M/ 3~phosphoglycerate ị 2-phos plì oglycerate v|/ phosphoenlpyruvate T pyruvate ị Âcid lactic > 4.4 So sánh tạo acid tổng L acidophilus, L bulgaricus giống Dỉplococcus Từ việc khảo sát điều kiện tối ưu cho khuẩn lạc tiếp tục so sánh môi trường cấp 1, cấp môi trường sản xuất thu số kết sau: - Môi trường cấp Bảng 4.18: So sánh lưọng acid tổng tạo L acừbphiìus, L bidgarìcus Dipbcoccus ^xCác yếu tố Nhiệt độ Môi trường cấp Giống Thời gian Acid tổng Các khuẩrMạc pH (°C) (ml) (%) (giờ) L acidophilus 37 10MRS 10 24 10,41 45 10MRS 10 24 7,8 L bulgaricus m Diplococcus 37 10MRS 10 24 13,26 Qua bảng 4.18 thấy lượng acid tổng tạo Diplococcus nhiều nhất, L acidophilus cuối L bulgaricus - Môi trường cấp Bảng 4.19: So sánh lượng acid tổng tạo L acừbphilus, L bidgarìcus Diplococcus ''\^Các yếu tố Các pH khưarTlạc, Nhiệt độ (°C) Môi trường cấp Giống (50 ml) Thời Acid tổng (%) gian (giờ) (g/1) L acidophilus 37 45 MRS+ mật rỉ 10 24 12,24 L bulgaricus 45 45 MRS+ mật rỉ 10 24 6,75 Diplococcus 37 45 MRS + mật rỉ 10 24 13,02 Qua bảng 4.19 thấy lượng acid tổng tạo Diplococcus nhiều nhất, L acidophilus cuối L bulgaricus - Môi trường sản xuất Bảng 4.20: So sánh lưọng acid tổng tạo L acừbphilus, L bulgaricus Diplococcus Các yếu tố Các pH Nhiệt độ Môi trường sản xuất khưẩntầc (°C) Giống (50 ml) Thời gian Acid tổng (giờ) (g/1) (%) L acidophilus 37 MRS + 45 mật rỉ 10 24 22,2 L bulgaricus 45 MRS + 45 mật rỉ 10 24 5,28 Diplococcus 37 MRS +45 mật rỉ 10 24 23,5 Từ bảng 4.20 thấy lượng acid tổng tạo Diplococcus nhiều nhất, tới L acidophilus cuối L bulgaricus 20 - ^ 15 bọ c - □ L _ acỉdophỉlus - ■ L bulgaricus □ Diplococcu s "1 10 - I- - - - o < - -5 - — 1—1—®—L-^-l———I—■—I—L_— cấp cấp Sản xuất Mơi trường Biểu đồ: 4.7 So sánh lượng acid tổng tạo thành khuẩn lạc môi trường Qua biểu đồ 4.7 thấy Diplococcus tạo acid tổng nhiều môi trường, tới L acidophilus cuối L bulgaricus L bulgaricus tạo acid tổng giảm dần từ môi trường cấp môi trường sản xuất, mơi trường có chứa mật rỉ nhiều khả tạo acid tổng giảm, nên mơi trường mật rỉ khơng phù hợp, mơi trường sữa phù hợp cho L bulgaricus tạo acid hon Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất, nhiên chưa định danh lồi nên khơng chọn để sản xuất acid lactic L acidophilus tạo acid tổng tăng nhiều từ môi trường cấp môi trường sản xuất Lượng acid tổng tạo thành cao hon L bulgaricus nhiều thấp so với Diplococcus với số lượng nhỏ, hon vi khuẩn lactic đồng hình tạo acid lactic chủ yếu từ trình lên men đường Chúng thấy L acidophilus phù hợp để lên men lactic nên chọn để sản xuất acid lactic 4.5 Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 4.5.1 Xác định đường khử - Thực phần phưong pháp, dựng đồ thị tuông quan nồng độ đường độ hấp thu OD 540 nm Bảng 4.21: Nồng độ glucose tương ứng OD 540 nm Nồng độ glucose (mg/ml) OD 540 nm 0 0,1 0,172 0,2 0,475 0,3 0,791 0,4 0,5 1,037 1,308 Từ kết ta có đồ thị sau: y=-0,0936+2,834x Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính OD 540 nm nồng độ glucose (mg/ml) - Dựa vào đồ thị đo hàm lượng đường khử mẫu sau: + Mau mật rỉ chưa xử lý có đường khử: 176 mg/ml + Mau mật rỉ xử lý H2SO4 có đường khử : 244 mg/ml + Mau sau lên men có đường khử : 198 mg/ml Lượng đường khử mật rỉ ban đầu 176 mg/ml Sau xử lý mật rỉ lượng đường khử 244 mg/ml Lượng đường khử tăng H2SO4 biến đường saccharose thành đường glucose íructose Sau lên men lượng đường khử 198 mg/ml 4.5.2 Định lượng vỉ sinh vật Các bước tiến hành phần phương pháp, dựng đường chuẩn tương quan mật độ tế bào độ hấp thu bước sóng 610 nm Bảng 4.22: Mật độ tế bào tương ứng với OD 610 nm khuẩn lạc L acidophilus OD 610 nm Mật độ tế bào (N/ml) Log (N/ml) Oxl o6 0,1 32,2xl06 7,508 0,2 61,9xl06 7,792 0,3 110,4xl06 8,043 y=7,2833+2,453x 0,4 175,7xl06 8,245 0,5 321,9xl06 8,508 Từ kết ta có đồ thị sau: OD 610 nm Đồ thị 4.2: Đường tương quan tuyến tính OD 610 nm mật độ tế bào khuẩn lạc L acidophilus - Dựa vào đồ thị ta xác định số lượng vi sinh vật + Số lượng vi sinh vật trước lên men : 2877,5 X 106 tế bào/ml + Số lượng vi sinh vật sau lên men : 40,25 X 106 tế bào/ml - Tiến hành lên men Hình 4.15: Quá trình lên men lactic + Ket trình lên men lactic từ mât rỉ đuờng Luợng đuờng khử cho vào lên men: 244 g/1, luợng đuờng khử sau lên men: 198 g/1 Vậy hiệu suất chuyển hóa đuờng khử: 18,85 % Luợng giống cho vào lên men: 2877,5 X 106 tế bào/ml, luợng giống sau lên men: 40,25 X 106 tế bào/ml Hiệu suất chuyển hóa đuờng khử thấp số luợng giống giảm thiết bị lên men khơng có cánh khuấy làm cho trình trao đổi chất L acidophilus đuờng diễn chậm bị ức chế nên L acidophilus dễ tiến đến phase suy tàn luợng đuờng lại nhiều Sau lên men thu đuợc luợng acid lactic: 9,7 g Luợng acid lactic thu đuợc thấp khơng có cánh khuấy làm giảm tiếp xúc chất dinh duõng tế bào vi sinh vật Cho nên khả trao đổi chất xảy chậm nên luợng acid lactic tạo thấp Theo so đồ chuyển hóa acid lactic từ phân tử glucose íructose chuyển hóa theo đuờng EMP cho phân tử acid lactic, 180 g đuờng glucose íructose tạo 180 g acid lactic 46 g đuờng glucose íructose chuyển hóa thành 46 g acid lactic Hiệu suất chuyển hóa thành acid lactic: 21,1 % Theo (Hui H Y ctv, 1994) cho vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đuờng tạo thành 90 % acid lactic Luợng acid lactic thu đuợc hiệu suất cao thiết bị lên men tốt (thiết bị có cánh khuấy) hay giống có chất luợng cao thiết bị tách acid lactic phuong pháp đại Nên trình trao đổi chất vi sinh vật co chất diễn mạnh hon, bên cạnh chất luợng giống tốt làm cho q trình lên men diễn nhanh hon cho suất cao hon Trong trình tách acid lactic, tách acid lactic thiết bị đại giảm hao hụt acid lactic Đối với hiệu suất acid lactic thu thấp tác giả thiết bị lên men khơng có cánh khuấy làm hạn chế khả tiếp xúc L acidophilus chất nên lượng acid lactic thu thấp q trình tách lọc acid lactic không tốt nên lượng acid lactic thu bị hao hụt PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đuợc rút số kết luận nhu sau: - Phân lập định danh đuợc dạng khuẩn lạc: L acidophilus, L bulgaricus Diplococcus từ Antibio, Biolactyl Đại mạch - Đã khảo sát điều kiện tối uu cho: + L acidophilus: nhiệt độ tối uu 37° c, pH tối uu = 6, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % thời gian 24 + L bulgaricus: nhiệt độ tối uu 45° c, pH tối uu = 6, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % thời gian 24 + Diplococcus: nhiệt độ tối uu 37° c, pH tối uu = 5, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % thời gian 24 - Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất, L acidophilus cuối L bulgaricus môi truờng cấp 1, cấp sản xuất 5.2 Chọn L acidophilus sản xuất acid lactic Đề nghị - Phân lập thêm nhiều khuẩn lạc tự nhiên để tuyển chọn chủng vi khuẩn tạo acid lactic nhiều để phục vụ cho qui mô công nghiệp - Thiết kế bồn lên men mang tính qui mơ cơng nghiệp - Huớng ứng dụng sản phẩm acid lactic thu đuợc: + Bảo quản chế biến thực phẩm (dùng sản xuất dua chua, ủ chua rau quả, sản xuất sản phẩm lên men từ sữa.v.v.) + Y học (trong phẩu thuật chỉnh hình, nha khoa.v.v.) + Mỹ phẩm + Môi truờng PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Ái, 2003 Công nghệ lên men ứng dụng công nghệ thực phẩm Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HỒ Chí Minh, trang 9-11 Kiều Hữu Anh, 1999 Giảo trình vỉ sinh vật cơng nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, trang 113-118 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty, 2000 Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo Dục, trang 141-160, 221-229 Nguyễn Thị Nam Định, 2000 Phân lập-nhân giống vi khuẩn lactic từ dưa chua dùng cho sản phẩm lên men Khóa luận tốt nghiệp Kỹ su Thực phẩm, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, trang 5-8 Vuông Thị Việt Hoa, 2002-2003 Thực tập vi sinh đại cương Tủ sách Truông Đại học Nông Lâm TP.HỒ Chí Minh, trang 7-14, 39-49 Du Lý Thùy Huong, 2000 Chọn khảo sát vài đặc tỉnh vi khuẩn lactic để muối chua nam rơm, măng, đậu Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HỒ Chí Minh, trang 13-17 Lý Thành Kiệt Huỳnh Văn Thuận, 2002 Bước đầu nghiên cứu phân lập nhăn giong hai khuẩn lạc vi khuẩn lactic streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus để cung cấp giong cho chế biến yogurt quy mô nhỏ Khóa luận tốt nghiệp Kỹ su Thực phẩm, Đại học Nơng Lâm TP.HỒ Chí Minh, trang 7-8 Nguyễn Đức Luợng, 2001 Công nghệ sinh học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HỒ Chí Minh, trang 278-280 Nguyễn Đức Luợng, 2002 Công nghệ vi sinh, tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HỒ Chí Minh, trang 322-336 10 Nguyễn Đức Luợng Cao Cuông, 2003 Thỉ nghiệm công nghệ sinh học, tập 1, thi nghiệm Hóa sinh Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HỒ Chí Minh, trang 33-34 11 Nguyễn Đức Luợng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết, 2003 Thỉ nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thỉ nghiệm Vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HỒ Chí Minh, trang 72-73, 414-434, 450-461 12 Nguyễn Đức Luợng Nguyễn Thị Thùy Duong, 2003 Công nghệ sinh học môi trường, tập 2, Xử lý chất thải hữu Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, trang 195-209 13 Bùi Thị Ngọc Phương Lê Thị Thủy, 2003 Thử nghiệm sản xuất bột giống vi khuẩn lactic streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus dùng chế biến yaourt Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Thực phẩm, Đại học Nơng Lâm TP.HỒ Chí Minh, trang 6-10 14.Lê Xuân Phương, 2001 Vi sinh vật công nghiệp Nhà xuất Xây dụng, trang 157-161 15 Trần Minh Tâm, 2000 Công nghệ vi sinh ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp, trang 111-115 16 Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phượng Trang Phạm Thị Hồng Tươi, 2001 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HỒ Chí Minh, trang 52-56 17 Lê Thị Hồng Tuyết, 2004 Nghiên cứu Bacteriocin sản xuất Lactobacillus acidophilus NRRL B-2092 Luận văn thạc sĩ chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HỒ Chí Minh, trang 4-9 TIẾNG ANH 18 Breed s Robert, Murray D G E, and Hitchens Parker A, 1948 Bergey s manual determinative bacteriology Sixth edition, The Williams &Wilkins Company p 305331,349-361 19 Hui H Y, and Khachatourians G George, 1994 Food Biotechnology Microorganisms p 249-254 20 Jay M James, 1996 Modern Food Microbiology Fifth edition, ITP International Thomson Publishing p.131-145 21 Klein Harley Prescott, 1996 Microbiology TMrd Edition, volumne two p.124- 126 22 Pelczar J Michael, Chan E c s Jr, and Krieg R Noel, 1993 Mỉcrobỉology concepts and applications p 873-874 23 Salminen Seppo, 1961 Lactic Acid Bacteria, mỉcrobỉology andýunctional Aspects p 415,22-29 24 Somogyi p L, Ramaswamy s H, and Hui H Y, 1958 Biology, Principles and Applications 25 Stanier Y Roger, Doudoroff Michael, and Adelberg A Edward, 1957 The Microbial World p 225-229 Tài liệu mạng internet 26 (http://www.baocantho.com.vn/vietnam/suckhoe/5345/ ->) 27 http://www.hanoimoi.com.vn 28 VACS Tạp chí Thế giới Phụ nữ http://www.vnn.vn/chuyenmuc/camnang/mypham/lamdepvoisua.htm 29 http://www.nld.com.vn/tintuc/kinh-te/tin-the-gioi/97615.asp —> Báo Người Lao Động - Tin giới Ralph p Tittsler, Carl s Pederson, Esmond E Snell, David Hendlin, and Charles F Niven, Jr, 1952 symposium on the lactic acid bacteria1 36 http://www.dsmz.de/media/med01 l.htm 37 http://l41.150.157.117:8080/prokPUB/chaphtm/256/COMPLETE.htm 38 http://www.nld.com.vn/tintuc/kinh-te/tin-the-gioi/97615.asp ~> 39 http://www.chemsystems.com/newsletters/perp/jun02_01-s3abs.cfm — > 40 http: //www the-info shop ,com/study/bc27352_fermentation_ingredients html - - > [Report] Global Fermentation Ingredients Market Research, Trends, Analysis