Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm sinularia nanolobata, sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển trung bộ việt nam TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Ninh Thị Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA LỒI SAN HƠ MỀM SINULARIA NANOLOBATA, SINULARIA LEPTOCLADOS, SINULARIA CONFERTA THU THẬP Ở VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9.42.01.16 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành tại: - Học Viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh biển Người hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Hoài Nam Người hướng dẫn khoa học 2: TS Trần Mỹ Linh Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Đình Thắng Phản biện 2: PGS TS Trần Thu Hương Phản biện 3: TS Bùi Thị Thúy Luyện Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, nhiều quốc gia khai thác chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ nghiên cứu tìm kiếm loại thuốc chữa trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, viêm gan, bệnh viêm nhiễm virus gây Cho đến thời điểm có số dược phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biển đến tay người sử dụng, điển Cytarabine, Vidarabine, Eribulin, Trabectedin…Để có thành này, viện nghiên cứu giới sàng lọc hoạt tính sinh học hàng triệu hợp chất từ loài sinh vật biển, đồng thời đầu tư nguồn lực tài thời gian cho giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng lâm sàng hợp chất tiềm Với lợi sở hữu đường bờ biển dài 3.260 km với nhiều đảo vịnh, Việt Nam có tiềm lớn lao việc khai thác với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú thành phần loài trữ lượng Tuy nhiên, nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam chưa nhiều hạn chế bước thử nghiệm hoạt tính in vivo nghiên cứu chế tương tác thuốc tế bào ung thư Các nghiên cứu giai đoạn đầu so với nuớc khu vực lùi xa so với nước tiên tiến Nguyên nhân cịn số khó khăn như: việc khảo sát thu thập mẫu sinh vật biển yêu cầu trang thiết bị đại, hợp chất phân lập từ sinh vật biển thường có hàm lượng nhỏ, cấu trúc phức tạp, số hợp chất dễ phân hủy q trình phân tích Do đó, yêu cầu cấp thiết nước ta cần phát triển nghiên cứu nhằm bước hệ thống thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài sinh vật biển Chi Sinularia chi san hô mềm nhiều nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu Cho đến có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học nhiều hợp chất phân lập từ đối tượng san hô mềm thuộc chi Tuy nhiên, nghiên cứu lồi san hơ mềm thuộc chi Sinularia S nanolobata, S leptoclados, S conferta Việt Nam chưa có nghiên cứu cách hệ thống lồi nêu Xuất phát từ thực tế trên, tơi lựa chọn đề tài luận án “Nghiên cứu hoạt tính gây độc số dịng tế bào ung thư hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập vùng biển Trung Bộ Việt Nam” Mục tiêu luận án: - Xác định thành phần hóa học ba lồi san hơ mềm S nanolobata, S conferta, S leptoclados thu thập vùng biển Trung Việt Nam - Phát hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có lồi san hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho nghiên cứu y sinh dược học Nội dung luận án bao gồm: Xác định tên khoa học ba lồi san hơ mềm thu thập vùng biển Trung Bộ Việt Nam thị phân tử Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ ba lồi san hơ mềm S nanolobata, S conferta, S leptoclados Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro hợp chất phân lập Đánh giá chế gây độc tế bào số hợp chất tiêu biểu CHƯƠNG TỔNG QUAN Bao gồm phần tổng quan nghiên cứu nước quốc tế việc khai thác hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển điều trị ung thu, nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư, đặc điểm chung san hô mềm chi Sinularia, thành phần hóa học hoạt tính sinh học san hô mềm chi Sinularia 1.1 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 1.1.1 Các dòng tế bào ung thư 1.1.2 Vai trò thử nghiệm sinh học tìm kiếm hoạt chất chống ung thư 1.1.3 Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa apoptosis 1.1.4 Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan đến chu kỳ tế bào 1.2 Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển điều trị ung thư 1.2.1 Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển 1.2.2 Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính chống ung thư từ san hơ mềm Việt Nam 1.3 Giới thiệu chung san hô mềm 1.3.1 Đặc điểm san hô mềm 1.3.2 Tổng quan san hô mềm chi Sinularia 1.3.3 Ứng dụng thị phân tử phân loại san hơ mềm 1.3.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ lồi san hơ mềm thuộc chi Sinularia Thống kê nghiên cứu công bố cho thấy hợp chất phân lập từ san hô mềm chi Sinularia chủ yếu bao gồm hợp chất sesquiterpen, diterpen steroid Nhiều hợp chất số thể hoạt tính sinh học thú vị hoạt tính gây độc tế bào, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng vi rút, bảo vệ thần kinh chống oxy hóa… CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu san hô mềm S nanolobata Verseveldt, 1977 thu thập vùng biển Lăng Cô, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng năm 2015 Mẫu san hô mềm S leptoclados Ehrenberg, 1834 thu thập vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng năm 2016 Mẫu san hơ mềm lồi S conferta Dana, 1846 thu thập vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng năm 2015 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xác định tên khoa học mẫu san hô mềm thị phân tử (msh1 28S RNA) 2.2.1.2 Khuyếch đại xác định trình tự đoạn ADN thị Hình 2.5 Ảnh điện di sản M SN SLE SCO M SN SLE SCO phẩm PCR nhân đoạn đoạn gen thị từ mẫu san hô mềm nghiên cứu (A) đoạn gen 28S rARN sử dụng cặp mồi 28SF 28SR (B) đoạn gen msh1 sử dụng cặp mồi MSHF MSHR M: A B GeneRulerTM ladder 1kb ADN M M 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19 20 21 Hình 2.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR-colony từ số khuẩn lạc sau biến nạp vector pTZ57R/T gắn gen 28S rARN mẫu san hô mềm SN (giếng số 17), SLE (giếng số 8-14), SCO (giếng số 15-21) M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder M 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 M 35 36 37 38 39 40 41 42 Hình 2.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR-colony từ số khuẩn lạc sau biến nạp vector pTZ57R/T gắn gen msh1 mẫu san hô mềm SN (giếng số 22-28), SLE (giếng số 29-35), SCO (giếng số 36-42) M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder 2.2.1.3 Xác định lồi phân tích đa dạng di truyền 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 2.2.2.1 Phân lập hợp chất từ mẫu san hơ mềm S nanolobata Hình 2.8 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài nanolobata S 2.2.1.2 Phân lập hợp chất từ mẫu san hô mềm S leptoclados Hình 2.9 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài S leptoclados 2.2.1.2 Phân lập hợp chất từ mẫu san hơ mềm S conferta Hình 2.10 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài S conferta 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chế gây độc tế bào ung thư CHƯƠNG KẾT QUẢ 3.1 Xác định loài thị phân tử 3.1.1 Giải trình tự tự đoạn gen 28S rARN msh1 mẫu san hô mềm - Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 mẫu SN với độ dài 639 bp, bao gồm 190 A, 113 C, 121 G, 215 T - Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 mẫu SLE với độ dài 639 bp, bao gồm 189 A, 113 C, 119 G, 218 T - Trình tự nucleotit đoạn gen msh1 mẫu SCO với độ dài 639 bp, bao gồm 189 A, 113 C, 122 G, 215 T - Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN mẫu SN với độ dài 695 bp, bao gồm 139 A, 194 C, 228 G, 134 T - Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN mẫu SLE với độ dài 709 bp, bao gồm 145 A, 197 C, 231 G, 136 T - Trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN mẫu SCO với độ dài 709 bp, bao gồm 144 A, 199 C, 228 G, 138 T 3.1.2 So sánh trình tự mẫu san hơ mềm chương trình BLAST Kết phân tích trình tự đoạn gen msh1 28S rARN mẫu nghiên cứu với các trình tự tham khảo ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy trình tự gen thị mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao với trình tự tương ứng ngân hàng gen, cụ thể: - Trình tự đoạn gen msh1 mẫu SN có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số FJ621451.1) mẫu S nanolobata vourcher RMNH coel.38441 ngân hàng gen NCBI - Trình tự đoạn gen msh1 mẫu SLE có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số KC542857.1) mẫu S leptoclados vourcher ZMTAU:CO35308 ngân hàng gen NCBI - Trình tự đoạn gen msh1 mẫu SCO có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số FJ621389.1) mẫu S conferta vourcher NTM C13972 ngân hàng gen NCBI - Trình tự đoạn gen 28S rARN mẫu SN có độ tương đồng 99,8% so với trình tự tương ứng (mã số KF915519.1) mẫu Sinularia sp voucher RMNH:Coel.41326 ngân hàng gen NCBI - Trình tự đoạn gen 28S rARN mẫu SLE có độ tương đồng 100% so với trình tự tương ứng (mã số KC542837.1) mẫu S leptoclados voucher ZMTAU:CO34095 ngân hàng gen NCBI - Trình tự đoạn gen 28S rARN mẫu SCO có độ tương đồng 99,6% so với trình tự tương ứng (mã số MF817932.1) mẫu Sinularia sp ngân hàng gen NCBI Bảng 3.1 Kết phân loại mẫu san hô mềm nghiên cứu dựa vào phân tích độ tương đồng (%) trình tự đoạn ADN thị (gen 28S rARN msh1) mẫu nghiên cứu với trình tự tham khảo ngân hàng gen Ký hiệu mẫu SN SLE SCO Chỉ thị msh1 Loài Sinularia nanolobata Sinularia leptoclados Sinularia conferta độ tương đồng Chỉ thị 28S rARN Loài độ tương đồng 100% Sinularia sp ≥ 99.8% 100% Sinularia leptoclados 100% 100% Sinularia sp ≥ 99.6% Kết luận chung dựa theo thị ADN Sinularia nanolobata Sinularia leptoclados Sinularia conferta 12 dòng tế bào ung thư thử nghiệm Các hợp chất cịn lại khơng thể hoạt tính Bảng 3.4 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất SCO Mẫu thử SCO 27 SCO 35 SCO 37 Etoposide * Camptothecin* A-549 3,64±0,18 78,73±2,11 27,12±1,69 IC50 (µM) Hela 19,34±0,42 30,5±0,77 24,64±1,28 27,99±2,01 PANC-1 1,78±0,69 9,35±0,37 20,51±2,72 1,17±0,42 12,65±1,01 *: Đối chứng dương; 3.3.4 Nghiên cứu chế gây độc tế bào ung thư hợp chất SLE 27 và hợp chất SCO 27 3.3.4.1 Nghiên cứu chế gây độc tế bào ung thư hợp chất SCO27 tế bào ung thư phổi A549 a Đánh giá tác động SCO 27 đến thay đổi hình thái tế bào ung thư Hình 3.5 Hình thái tế bào A549 tác động SCO 27 nồng độ khác đối chứng dương (camptothecin µM) Mũi tên tế bào trạng thái apoptosis b Đánh giá khả kích thích sản sinh enzym caspase SCO27 13 Hình 3.6 Khả kích thích sản sinh caspase SCO 27 sco-10 µM; sco-5 µM sco-2,5 µM: mẫu phân tích bổ sung SCO 27 nồng độ tương ứng Đối chứng: mẫu phân tích khơng bổ sung hợp chất SCO 27 Camptothecin: mẫu phân tích bổ sung camptothecin c Xác định khả cảm ứng apoptosis tế bào ung thư phổi A549 SCO 27 Bảng 3.2 Tỉ lệ tế bào apoptosis tác động SCO 27 dòng tế bào ung thư phổi A549 Mẫu thử Control SCO 27 - µM SCO 27 - 10 µM Camptothecin5µM A C Tỉ lệ tế bào sống (%) 89,08 88,50 83,33 Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm (%) 3,89 4,90 4,76 Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn (%) 5,18 5,72 8,93 Tỉ lệ tế bào hoại tử (%) 1,85 0,88 2,99 79,17 15,49 1,57 3,77 B D Hình 3.7 Tác động SCO 27 đến trình apoptosis tế bào A549 thời điểm 24h nồng độ khác µM (C), 10 µM (D), đối chứng âm (A) đối chứng dương (B) sử dụng phương pháp nhuộm Annexin V/P 14 3.3.4.2 Nghiên cứu chế gây độc tế bào ung thư hợp chất SLE 27 tế bào ung thư vú MCF-7 a Đánh gá tác động hợp chất SLE 27 lên thay đổi hình thái tế bào ung thư Hình 3.8 Tác động hợp chất SLE 27 nồng độ 10, 30 100 µM lên hình thái tế bào ung thư vú MCF-7 Mũi tên tế bào trạng thái apoptosis b Xác định khả cảm ứng apoptosis tế bào ung Độ thưphóng vú MCF-7 đại 10X hợp chất SLE 27 20X Control: đối Bảng 3.3 Tỉ lệ tế bào apoptosis tác động SLEchứng 27 dòng âm – Tế bào tế bào ung thư vú MCF-7 Mẫu thử Control SLE 27-10 µM SLE 27-30 µM SLE 27-100 µM Tỉ lệ tế bào sống (%) 97,08 97,39 86,08 39,10 MCF-7 không bổ sung Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm (%) 0,67 1,15 1,72 3,71 Tỉ lệ tế bào Tỉ lệ tế hợp chất SLE apoptosis bào 27 hoại muộn (%) tử (%) 1,93 0,32 1,28 019 7,16 5,04 23,02 34,16 c Đánh giá tác động hợp chất SLE 27 đến chu kì tế bào ung thư vú MCF-7 Bảng 3.4 Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 pha G0/G1, S, G2/M apoptosis (sub-G1) sau 48 xử lí với hợp chất SLE 27 Mẫu thử Control SLE 27 - 10 µM SLE 27 - 30 µM SLE 27- 100 µM Tỉ lệ tế bào pha chu trình phân bào (%) Pha sub-G1 Pha G0/G1 Pha S Pha G2/M 0,54 41,21 41,22 14,81 0,23 36,57 33,41 17,78 0,76 40,59 27,19 15,86 10,24 66,08 15,96 4,42 15 Hình 3.10 Ảnh hưởng hợp chất SLE 27 (nồng độ 10; 30; 100 µM) đến chu kì tế bào MCF-7 thời điểm 48h, sử dụng hệ thống Flow cytometer Novocyte CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Xác định lồi mẫu san hơ mềm dựa vào trình tự DNA thị Sau tách dịng giải trình tự đoạn gen thị từ mẫu san hơ mềm, trình tự DNA Sinularia leptoclados (MW077896, MW077906); Sinularia conferta (MW077897, MW077907) Sinularia nanolobata (MW077898, MW077908) đăng ký Ngân hàng gen quốc tế NCBI 16 Sinularia-abruptaMF817864 Sinularia-slieringsiMH516803 Sinularia-penghuensisJX991181 Sinularia-molestaJX991172 30 Sinularia-abrubtaFJ621374 Sinularia-abruptaJX991168 37 Sinularia-leptocladosKC542857 66 SLE 46 Sinularia-compactaFJ621384 Sinularia-bisulcaFJ621378 99 Sinularia-acutaFJ621375 46 Sinularia-verseveldtiKC542859 Sinularia-robustaFJ621473 Sinularia-diffusaFJ621399 Sinularia-sp.KF915757 64 Sinularia-abhishiktaeFJ621373 Sinularia-tumulosaFJ621482 50 Sinularia-siaesensisFJ621478 Sinularia-polydactylaKU230374 90 Sinularia-confertaFJ621389 99 43 SCO Sinularia-peculiarisJX023274 64 Sinularia-ornataJX991173 Sinularia-nanolobataFJ621451 65 90 SN Sinularia-brassicaKF915724 48 47 0.01 Hình 4.1 Kết phân tích chủng loại theo phương pháp NJ (NeighborJoining) MEGA6 mẫu san hơ mềm dựa vào đa hình trình tự nucleotit đoạn gen msh1 mẫu nghiên cứu mẫu san hô mềm liên quan ngân hàng gen NCBI Các số đầu nhánh chủng loại giá trị Bootdtrap thể độ tin cậy phân nhánh di truyền trình tự nhóm trình tự Phân tích chủng loại dựa trình tự đoạn gen msh1 nghiên cứu 23 trình tự tham khảo NCBI Kết hình 4.1 cho thấy mẫu SLE có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài cơng bố trình tự ngân hàng gene quốc tế Sinularia leptoclados KC542857 (bootstrap 66%) Mẫu SCO có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài S conferta FJ621389 (bootstrap 90%) Mẫu SN có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài S nanolobata FJ62621451 (bootstrap 90%) Tương tự thế, phân tích phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN thực trình tự nghiên cứu 21 trình tự tham khảo NCBI Kết cho thấy mẫu SLE 17 có quan hệ di truyền tương đồng cao với lồi cơng bố trình tự ngân hàng gene giới S leptoclados KC542857, S leptoclados MF817912, S.densa KC542829, S abrupta KC542822, S.australiensis KC542825, Sinularia sp MF817932 (bootstrap 100 %) Mẫu SCO có quan hệ di truyền tương đồng cao với lồi S bisulca KC542826, S slieringsi MK333594, S penghuensis KC542842, S robusta KC542843, S verseveldti KC542845, S eilatesis KC542832, S corpulentissima KC542827, S maxima KC542839 (bootstrap 100%) Mẫu SN có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài Sinularia sp KC915519 S polydactila KF915515 (bootstrap 98%) Như vậy, tổng hợp kết so sánh trình tự đoạn gen thị msh1 28S mẫu san hơ mềm trình bày Bảng 3.1 Mẫu SN xác định thuộc loài S nanolobata, mẫu SLE xác định thuộc loài S leptoclados, mẫu SCO xác định thuộc loài S conferta Kết hoàn toàn tương đồng với kết xác định lồi dựa phân tích đặc điểm hình thái mẫu san hơ mềm nghiên cứu GS.TS Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên môi trường biển thực Điều góp phần khẳng định vai trò hỗ trợ hiệu thị phân tử công tác phân loại số nhóm sinh vật biển san hơ mềm 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi S nanolobata Từ lồi san hơ mềm S nanolobata phân lập 10 hợp chất Trong bao gồm: hợp chất đặt tên là: 24(S),28- epoxyergost-5-ene-3β,4α-diol (SN 6), 3β,4α-dihydroxyergosta- 5,24(28)-diene (SN 8), nanolobatol B (SN 20), nanolobatol A (SN 30) hợp chất biết: 16α-Hydroxysarcosterol (SN 3), 18 sarcophytosterol (SN 4), sinularianin B (SN 10), sinularianin D (SN 11), Cholesta-5,24(28)-dien-3β-ol-7-one (SN 16), dissesterol (SN 17) Các hợp chất phân lập có cấu trúc thuộc lớp chất sterol sesquiterpen 4.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi S leptoclados Từ lồi san hơ mềm S leptoclados phân lập xác định cấu trúc 15 hợp chất: tất 15 hợp chất thuộc lớp chất sterol, có hợp chất đặt tên là: Leptosteroid (SLE 10), 5β,6β-epoxygorgosterol (SLE 21) 13 hợp chất biết: sarcophytosterol (SLE 13), Ergosta-24(28)-en-3β-ol (SLE 19), Ergosta-5,22,24(28)-trien-3β-ol (SLE 20), 3β,4α-Dihydroxyergosta5,24(28)-die (SLE 22), Ergosta-5,24(28)-dien-3β-ol-7-one (SLE 23), 7-oxogorgosterol (SLE 25), Ergosta-5-en-3β-ol-7-one (SLE 26), Ergosta-5,24(28)-dien-3β,7β-diol (SLE 27), Ergosta-5-en-3β,7β-diol (SLE 28), 7β-hydroxygorgosterol (SLE 29), Ergosta-5,24(28)-dien3β,7α-diol (SLE 30), Ergosta-5-en-3β,7α-diol (SLE 31), 7αhydroxygorgosterol (SLE 32) 4.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi S conferta Từ lồi san hơ mềm S conferta phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất: tất 12 hợp chất thuộc lớp chất sterol, có hợp chất đặt tên là: 7α-Methoxygorgosterol (SCO 29), 7α-Methoxy-ergosta-5-ene-3β-ol (SCO 30), 3β-Hydroxyergosta4-ene-6-one (SCO 44), 3β-Hydroxyergosta-4,24(28)-diene-6-one (SCO 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-3-monoacetate 32), (SCO 42) hợp chất biết: 3β-Hydroxy-24-methylenecholest-5en-7-one (SCO 26), 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-6- 19 monoacetate (SCO 27), 7-methoxyergosta-5,24(28)-diene-3 -ol (SCO 31), 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol (SCO 35), Ergosta-3β,5α,6β-triol (SCO 37), 3β,7α-Dihydroxyergosta-5,24(28)dien (SCO 34.1) (24S)-ergost-5-en-3β,7α-diol (SCO 34.3) 4.5 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập 4.5.4.1 Nghiên cứu chế gây độc tế bào ung thư hợp chất SCO27 tế bào ung thư phổi A549 a Đánh giá tác động SCO 27 đến thay đổi hình thái tế bào ung thư Kết phân tích hình thái tế bào ung thư phổi A549 (hình 3.5) cho thấy tế bào mẫu xử lý với SCO 27 xuất tượng apoptosis số tế bào với đặc điểm đặc trưng thay đổi hình thái tế bào như: tế bào co đặc, nhân phân mảnh Số lượng tế bào apoptosis tăng lên tăng nồng độ chất thử SCO 27 từ 2,5 đến 10 µM Mẫu đối chứng dương (camptothecin) hoạt động ổn định, tế bào sau xử lý có nhân bắt thuốc nhuộm có màu sáng, trịn đồng Như vậy, hợp chất SCO 27 tác động làm thay đổi hình thái tế bào, sở để tiến hành nghiên cứu để xác định khả gây apoptosis tế bào hợp chất b Đánh giá khả kích thích sản sinh enzym caspase SCO27 Kết hình 3.6 cho thấy, mẫu SCO 27 có khả cảm ứng tế bào A549 sản sinh caspase Hoạt tính thể rõ nồng độ 10 µM với số lần kích thích tăng 1,74 lần so với đối chứng âm Chất đối chứng dương camptothecin hoạt động ổn định thí nghiệm với hoạt tính caspase nồng độ µM 2,86 lần so với đối chứng âm (P