Nghiên cứu nhân giống cây chanh dây (passiflora edulis) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào và thử nghiệm tạo cây vi ghép

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC **** TRẦN HIẾU NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY CHANH DÂY (Passiflora edulis) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CÂY VI GHÉP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ, 2021 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC **** TRẦN HIẾU NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY CHANH DÂY (Passiflora edulis) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CÂY VI GHÉP Ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 9.42.01.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS DƯƠNG TẤN NHỰT PGS.TS CAO ĐĂNG NGUYÊN HUẾ, 2021 LỜI CẢM ƠN Khi chập chững bước bước chân vào đường nghiên cứu khoa học, chặng đường đầy khó khăn, gian nan thách thức Nhưng bước chân chập chững chẳng đến đâu khơng có hỗ trợ, giúp đỡ dìu dắt từ quý thầy, cô, anh, chị, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Đầu tiên tơi xin chân thành cảm ơn dành lời tri ân sâu sắc đến thầy GS.TS Dương Tấn Nhựt Thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt thời gian thực luận án Thầy không người thầy đơn truyền thụ cho kiến thức chuyên môn quý báu, say mê công việc đam mê nghiên cứu khoa học mà dạy cho học đạo đức làm người, nhân cách sống Thầy gương sáng cho hệ trẻ noi theo để trở thành nhà khoa học thực thụ tương lai giúp ích cho xã hội Cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy PGS.TS Cao Đăng Nguyên, giảng viên trường Đại học Khoa học, Đại học Huế phối hợp với thầy GS.TS Dương Tấn Nhựt hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận án Nhân dịp này, xin cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học, phòng đào tạo sau đại học trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, quý thầy khoa Sinh học tận tình dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Xin cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Cao đẳng Sư phạm Ninh Thuận Ban Giám đốc Phân hiệu Ninh Thuận thuộc Trường Đại học Nơng lâm Thành phố Hồ Chí Minh, nơi công tác tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập thực luận án i Tiếp đến, xin cảm ơn đến anh, chị, em công tác thực tập Phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng giúp đỡ suốt thời gian thực tập Và cuối cùng, xin dành lời tri ân, lời chúc sức khỏe tốt đẹp sâu sắc đến Má Cô Sáu Má người tần tảo chăm lo nuôi nấng lớn khôn ngày hôm Má bên cạnh con, động viên ủng hộ Em xin gửi lời cảm ơn đến anh chị gia đình cháu giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em để học tập hoàn thành tốt luận án Anh xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến vợ trai, bên cạnh, ủng hộ giúp đỡ anh nhiều gặp khó khăn Vợ ln lo lắng, động viên anh chán nản công việc, buồn phiền sống Ninh Thuận, tháng 09 năm 2021 Tác giả Trần Hiếu ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống chanh dây (Passiflora edulis) kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào thử nghiệm tạo vi ghép” cơng trình nghiên cứu hướng dẫn GS.TS Dương Tấn Nhựt PGS.TS Cao Đăng Nguyên Những kết nghiên cứu người khác số liệu trích dẫn luận án thích đầy đủ Đề tài hỗ trợ Phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Tôi xin cam đoan số liệu kết luận án hồn tồn trung thực Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường cam đoan Ninh Thuận, tháng 09 năm 2021 Tác giả Trần Hiếu iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT : Môi trường MS giảm phn t khoỏng a lng ẳ MS ẵ MS : Mơi trường MS giảm phần hai khống đa lượng ½ MSM: Môi trường cải biên MSM giảm phần hai khống đa lượng ¾ MS lTCL B lTCL-L BA lTCL-T CĐH ST DN A FL IBA Kin LED : Mơi trường MS giảm ba phần tư khống đa lượng : Blue light; LED xanh dương : 6benzylad enine : Chất điều hòa sinh trưởng : Deoxyribonucleic acid : Flourescent Lamp; ánh sáng đèn huỳnh quang : Indole-3-butyric acid : Kinetin : Light-Emitting Diode; ánh sáng LED : Longitudinal thin cell layer; lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc : Mẫu cắt lớp mỏng theo chiều dọc : Mẫu đoạn thân cắt lớp mỏng theo chiều dọc i v MS : Môi trường Murashige Skoog, 1962 MSM : Môi trường cải biên Monteri cs, 2000 NAA : α- Naphthalene acetic acid PGRs : Plant growth regulators, chất điều hoà sinh trưởng thực vật R : Red light; LED đỏ RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcriptase-PCR SPAD : Soil Plant Analysis Development; số chlorophyll TCL : Thin cell layer; lớp mỏng tế bào tTCL : Transverse thin cell layer; lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang tTCL-L : Mẫu cắt lớp mỏng theo chiều ngang tTCL-T : Mẫu đoạn thân cắt lớp mỏng theo chiều ngang v MỤC LỤC Lời cảm ơn i Lời cam đoan iii Danh mục chữ viết tắt iv Mục lục vi Danh mục hình xi Danh mục bảng xv MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY CHANH DÂY 1.1.1 Phân loại, nguồn gốc phân bố 1.1.2 Hình thái đặc tính sinh học chanh dây 1.1.3 Một số virus gây bệnh thƣờng gặp chanh dây 1.1.4 Các thành phần dinh dƣỡng chanh dây 1.1.5 Giá trị kinh tế 1.1.6 Tình hình trồng chanh dây Lâm Đồng 1.1.7 Các phƣơng pháp nhân giống chanh dây 1.1.7.1 Phương pháp truyền thống 1.1.7.2 Phương pháp vi nhân giống 10 1.1.8 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh 13 1.1.9 Kỹ thuật vi ghép 15 1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO 16 1.2.1 Giới thiệu chung 16 1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL 18 1.2.2.1 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL ăn thân gỗ 18 1.2.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL dược liệu 21 1.3 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG TÁI SINH, SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT 22 1.3.1 Ảnh hƣởng mẫu cấy 22 vi 1.3.1.1 1.3.1.2 Vị trí loại mẫu cấy 1.3.2 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng th 1.3.3 Ảnh hƣởng ánh sáng 1.3.4 Ảnh hƣởng AgNO3 nano bạc (AgNP 1.3.4.1 1.3.4.2 1.3.5 Ảnh hƣởng giá thể 1.3.6 Ảnh hƣởng môi trƣờng khống 1.3.7 Sự thống khí nồng độ CO2, O2 Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Vật liệu thực vật 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 2.1.3 Thiết bị chiếu sáng 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu vi nhân giống chanh dây tím thuật ni cấy TCL 2.2.2 Nghiên cứu tạo chanh dây lai sinh dƣỡn vàng kỹ thuật vi ghép 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1.1 nguồn mẫu lên tái sinh chồi in vitro giống chanh dây tím vàng 2.3.1.2 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng BA riêng lẻ, kết hợp NAA lên khả tái sinh chồi từ TCL giống chanh dây tím vàng 2.3.1.3 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng BA riêng lẻ, kết hợp NAA lên khả tái sinh chồi từ TCL đoạn thân giống chanh dây tím vàng vii 4.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 CDR Duncan a NT 8.00 7.00 1.00 2.00 4.00 3.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a NT 8.00 1.00 2.00 4.00 3.00 7.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a NT 1.00 5.00 2.00 8.00 3.00 4.00 7.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 SPAD Duncan NT 1.00 a 8.00 2.00 3.00 4.00 5.00 7.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Bảng 3.28 Kết phân tích thống kê đặc điểm sinh trưởng chanh dây tím có nguồn gốc từ ánh sáng LED sau 10 tuần vườn ươm TLS a Duncan NT 8.00 7.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 NT Duncan a 8.00 1.00 7.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 SL NT Duncan a 8.00 1.00 4.00 3.00 2.00 7.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 NT Duncan a 1.00 8.00 2.00 3.00 4.00 7.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 NT a Duncan 1.00 8.00 4.00 2.00 3.00 5.00 7.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Bảng 3.29 Kết phân tích thống kê đặc điểm sinh trưởng chanh dây vàng có nguồn gốc từ ánh sáng LED sau 10 tuần vườn ươm Duncan a Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 CCC Duncan a NT 8.00 1.00 4.00 7.00 2.00 3.00 5.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a NT 1.00 2.00 3.00 7.00 4.00 5.00 8.00 6.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Bảng 3.30 Kết phân tích thống kê ni cấy mơ phân sinh đỉnh giống chanh dây tím sau 4, 10 tuần ni cấy ONEWAY TLN TLS TLTS SC CCC HSTS BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Descriptives TLN TLS TLTS SC CCC HSTS TLN 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total Between Groups Within Groups TLS Total Between Groups Within Groups TLTS Total Between Groups Within Groups SC Total Between Groups Within Groups CCC Total Between Groups Within Groups HSTS Total Between Groups Within Groups Total Bảng 3.31 Kết phân tích thống kê ni cấy mơ phân sinh đỉnh sinh giống chanh dây vàng sau 4, 10 tuần nuôi cấy ONEWAY TLN TLS TLTS SC CCC HSTS BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Descriptives TLN 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total TLS TLTS SC CCC HSTS ANOVA TLN Between Groups Within Groups TLS Total Between Groups Within Groups TLTS Total Between Groups Within Groups SC Total Between Groups Within Groups CCC Total Between Groups Within Groups HSTS Total Between Groups Within Groups Total Bảng 3.32 Kết phân tích thống kê đặc điểm chồi từ mẫu TCL giống chanh dây tím vàng có nguồn gốc mô phân sinh đỉnh sau tuần nuôi cấy ONEWAY TLTS SC CCC BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05) Descriptives 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total TLTS SC CCC ANOVA Between Groups TLTS Within Groups Total Between Groups SC Within Groups Total Between Groups CCC Within Groups Total Bảng 3.33 Kết phân tích thống kê đặc điểm chồi (từ mẫu TCL giống chanh dây tím vàng) nhân nhanh có nguồn gốc mơ phân sinh đỉnh sau tuần nuôi cấy ONEWAY SC CCC SL SPAD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05) Descriptives SC CCC SL SPAD 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total ANOVA Between Groups SC Within Groups Total Between Groups CCC Within Groups Total Between Groups SL Within Groups Total Between Groups SPAD Within Groups Total Bảng 3.34 Kết phân tích thống kê đặc điểm chanh dây vi ghép sau 10 tuần nuôi cấy ONEWAY TLTC TLRR SR CDR CCC SL SPAD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Descriptives TLTC TLRR SR CDR CCC SL SPAD 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total ANOVA TLTC Between Groups Within Groups TLRR Total Between Groups Within Groups SR Total Between Groups Within Groups CDR Total Between Groups Within Groups CCC Total Between Groups Within Groups SL Total Between Groups Within Groups Total Between Groups SPAD Within Groups Total Bảng 3.35 Kết phân tích thống kê đặc điểm sinh trưởng vi ghép sau 10 tuần vườn ươm ONEWAY TLS CCC SL CDL CRL BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) 1.00 TLS CCC SL CDL CRL 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total ANOVA Between Groups TLS Within Groups Total Between Groups CCC Within Groups Total Between Groups SL Within Groups Total Between Groups CDL Within Groups Total Between Groups CRL Within Groups Total Hình 3.1 Kết phân tích thống kê biểu đồ hệ số tái sinh chồi nguồn mẫu giống chanh dây tím chanh dây vàng sau tuần ni cấy Giống chanh dây tím HSTS Duncan NT 7.00 8.00 9.00 4.00 1.00 5.00 2.00 6.00 3.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Giống chanh dây vàng Duncan NT 4.00 7.00 1.00 5.00 8.00 2.00 6.00 9.00 3.00 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Hình 3.8 Kết phân tích thống kê biểu đồ hệ số tái sinh chồi từ tTCL-L, lTCL-T giống chanh dây tím vàng sau tuần ni cấy Giống chanh dây tím ONEWAY TLTS SC HSNC BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) Descriptives TLTS SC HSTS 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total ANOVA TLTS Between Groups Within Groups SC HSTS Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Giống chanh dây vàng ONEWAY TLTS SC HSNC BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=DUNCAN LSD ALPHA(0.05) TLTS SC HSTS 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total 1.00 2.00 Total TLTS Between Groups Within Groups SC HSTS Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Hình 3.35 Kết phân tích thống kê biểu đồ hệ số tái sinh chồi thông qua nuôi cấy mơ phân sinh đỉnh giống chanh dây tím chanh dây vàng Đam Rông (T1, V1), Đức Trọng (T2, V2) sau 10 tuần Giống chanh dây tím ONEWAY HSTS BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05) Descriptives HSTS N 1.00 2.00 Total HSTS Between Groups Within Groups Total Giống chanh dây vàng ONEWAY HSTS BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05) HSTS N 1.00 2.00 Total HSTS Between Groups Within Groups Total Kết giải trình tự thu đoạn DNA có độ dài 344 nucleotid, xác định rõ 326 nucleotid Trình tự virus có mẫu v1 > v1 Pos NNNNGTACGCATTTGATTTTTATGAAGTCAACTCAAAGACTCCTGAGAGAGCCAGAGAAGCGGTTGCACAGATG AAAGCAGCAGCCCTCGCCAACGTTAACACTAGGATGTTTGGCCTAGATGGTAACGTGGCAACCACCAGCGAAA ATACTGAAAGGCATACTGCACGTGATGTAAATCAGAACATGCATACTCTTTTGGGTATGGGACCAGTCCAGTAAA GGATTGGTAAACTCTCCACAGTTAGCATTTCGCAACGCTAGTATCTACGTATAGTAAATAGTACTTTAAGGTTCAA TCAGTGTGGTTATACCACCTCGCATTATCTTANNNNN Trình tự xác định rõ thành phần nucleotide >v1Pos GTACGCATTTGATTTTTATGAAGTCAACTCAAAGACTCCTGAGAGAGCCAGAGAAGCGGTTGCACAGATGAAAG CAGCAGCCCTCGCCAACGTTAACACTAGGATGTTTGGCCTAGATGGTAACGTGGCAACCACCAGCGAAAATACT GAAAGGCATACTGCACGTGATGTAAATCAGAACATGCATACTCTTTTGGGTATGGGACCAGTCCAGTAAAGGAT TGGTAAACTCTCCACAGTTAGCATTTCGCAACGCTAGTATCTACGTATAGTAAATAGTACTTTAAGGTTCAATCAG TGTGGTTATACCACCTCGCATTATCTTA ... kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào thử nghiệm tạo vi ghép? ?? thực Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện tối ưu nhân giống in vitro chanh dây tím vàng kỹ thuật ni cấy TCL Tạo chanh dây vi ghép chanh dây. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC **** TRẦN HIẾU NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY CHANH DÂY (Passiflora edulis) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CÂY VI GHÉP Ngành: Sinh lý học thực vật Mã... NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu vi nhân giống chanh dây tím thuật nuôi cấy TCL 2.2.2 Nghiên cứu tạo chanh dây lai sinh dƣỡn vàng kỹ thuật vi ghép 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU