Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

Phần 1 MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli (E coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi

sinh vật đường ruột của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một

số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non E coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng E coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài Nếu quá trình vệ sinh kém thì E coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi,

nhất là trong quá trình giết mổ Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không

thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E coli hoàn toàn có thể xảy ra.

E coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong đó,

nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E coli) mang nhiều gen độc lực như gen eaechịu

trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội

chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu

(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E

coli) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st

sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật

nuôi Nhóm EPEC (Enteropathogenic E coli) mang gen eae sản sinh protein intimin, …Trước đây, để phát hiện E coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền

thống Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới

có kết quả Hơn nữa, E coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E coli trong phân để tìm nguyên

nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản

ánh được khả năng gây độc của chúng Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E

coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật

nuôi và con người PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh.

Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi

khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”

1.2 Mục tiêu

- Phát hiện một số gen độc lực của E coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ mẫu

phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.

1.3 Mục đích

- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E coli gây ra cho động vật và

người.

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Định nghĩa

- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa

người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn này vào năm 1885.

- Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ

thống phân loại của Bergey).

- E coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng

1,5µm x 0,5µm, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996) E

coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng,

ở phần cuối của ruột non và ruột già Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan khác.

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2 – 7,4).

- E coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau

trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí E coli thường được phân lập

bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB) Trên môi

trường thạch EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac Conkey, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường SMAC

(Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các

nhóm E coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).

- E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24

giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm.

- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E coli làm đục nhẹ môi trường, càng để

lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường.

- Để phân biệt E coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate) E coli cho kết quả là + + - -

(biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên

Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular) Có trên 700 loại serotype

của E coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K Theo Jay (2000),

E coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30 type

kháng nguyên H.

2.1.4 Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli

Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli:

- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC

- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC

Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).

2.1.5 Phân loại E coli

Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),

E coli được chia thành 5 nhóm sau:

 STEC (Shiga toxin – producing E coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E

coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)

 EPEC (Enteropathogenic E coli) EAEC (Enteroaggregative E coli) ETEC (Enterotoxigenic E coli)

 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:

- EIEC (Enteroinvasive E coli)- DAEC (Diffusely adherent E coli)

2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHECa Danh pháp

Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác nhau

để đặt tên cho nhóm E coli này:

- Tên gọi Verotoxigenic E coli hoặc Vero cytotoxin producing E coli

(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997 Tên gọi VTEC được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.

- Tên gọi Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây

viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).

- Tên Shiga toxin - producing E coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như

độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997) Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các tạp chí khoa học ở Mỹ.

STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng

nhóm E coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù vậy, không

phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác

Những dòng E coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe

mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995) Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).

b Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC* Shiga toxin

Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt).

Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và

Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2 Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA) Cả hai gen stxA và

stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc thể (NST)

của STEC Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2 Ba dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv, 1998) Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh ở người Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv, 1994) Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv, 1997) Hầu hết những phương

pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000).

* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thể là heat – stable enterotoxin (EAST1) Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 – MDa mà plasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải O157 Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994) Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc lực

thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E coli có Stx âm tính và Ehly

dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989) EAST1 đầu tiên được mô tả trong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều dòng STEC EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì không được biết, nhưng nó có thể liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyên được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).

Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế bào ruột Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Protein

intimin được mã hóa bởi gen eae (E coli attaching và effacing) Intimin gây tổn thương

dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám

chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993) Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là

vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để vận chuyển intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E Tuy nhiên, không phải tất

cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998)

Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài vi khuẩn (protein intimin) và protein Tir Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997).

Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người ta cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác Dấu hiệu sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặc không tạo raβ- glucuronidase Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào

việc phát hiện E coli không lên men sorbitol O157:H7 và các serotype không phải

O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:HNM và O113:H21 (WHO, 1994).

c Nguồn lây nhiễm

STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu, dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000) Loài động vật quan trọng nhất trong việc lây nhiễm cho người là bò Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong quá trình giết mổ (Butler, 1996).

STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang người khác Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001).

2.1.5.2 Nhóm EPEC

Thuật ngữ enteropathogenic E coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để chỉ những dòng E coli gây tiêu chảy ở trẻ em.

a Đặc điểm

Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn

bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố Shiga.

b Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998) Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô

Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V

cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao) Gen cần thiết

cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993) Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei,

nhưng không hiện diện ở những dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông

thường

c Dịch tễ của sự nhiễm EPEC

Cũng như những E coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường

miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm.

Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em Người trưởng thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có thể là do mất các thụ thể đặc hiệu Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ cao.

2.1.5.3 Nhóm ETEC

a Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột

(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)

 Độc tố ruột enterotoxin

Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT).

(1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):

Độc tố LT của E coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức

năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra

LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên động vật hay trong nuôi cấy tế bào LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch.

- LT-I: Được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú LT-I là một

oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT) Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập

từ người Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể

chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA).

Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động Điều này dẫn đến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mô Kết quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl- một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus) Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998).

- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II cũng làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đến bệnh trên người và thú.

(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)

Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành hai nhóm là STa và STb Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cả hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn

Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V cholerae không phải O1 ST giống

50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1 Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.

- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử

khoảng 2 kDa STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E coli phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E coli phân lập trên người

Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người

Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và / hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy.

- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào bên trong tế bào Không gây ra sự tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb còn kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992)

 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)

Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens).

CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm Có ít nhất 20 loại CF trong ETEC ở người Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996) Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh

b Dịch tễ

Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch Dịch tễ của bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểu hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh.

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981) Sự nhiễm ETEC, ở những vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước.

Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng có dịch ETEC Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ô nhiễm.

c Khía cạnh lâm sàng

Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50 giờ) Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có hiện tượng sốt và ói mửa Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng cũng có

thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.

Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy.

d Phát hiện và chẩn đoán

Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST Có nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…

2.2 Kỹ thuật PCR2.2.1 Nguyên tắc

PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 PCR là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào).

Sự khuếch đại những primer oligonucleotide Primer là những phân tử DNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverse primer) Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi Sự tổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập.

Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online).

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút.

 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.

 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.

* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m*2n

Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa

* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức:

Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x n : Số chu kỳ

2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2x : Số bản sao của chuỗi mã hóa

+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

 Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng. Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.

 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp với nhau.

Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu là 105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40.

Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR

Giai đoạn biến tính (denaturation)Giai đoạn ủ bắt cặp

(anealing)Giai đoạn kéo dài

(elongation hay extension)

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR

- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.

- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, cĩ trình tự bổ sung với trình thự base của hai đầu mạch khuơn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR Các primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gen, khơng cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuơi và primer ngược và cũng khơng cĩ những cấu trúc kẹp tĩc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide) Trình tự nằm giữa hai primer xuơi và ngược khơng quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.

- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nĩng Taq DNA polymerase

khơng bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng

5’→3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C.

Biến tính94-950C

Ủ bắt cặp

Kéo dài720C

Lặp lại n lần

Thời gian (phút)

- Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.

- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ=300 nm) thành vạch màu đỏ da cam.

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).

2.2.5 Những ứng dụng của PCR

2.2.5.1 PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ

PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứa một copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này

Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phân tích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting được sử dụng chỉ với một sợi tóc và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới pháp luật PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bị giết (trong một vài trường hợp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xác còn lại đã bị phân rã, do đó không thể sử dụng các phương pháp phân tích thông thường.

Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổ sinh vật học, bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu vết DNA hiện diện trong các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch Phương pháp PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền từ các dấu vết DNA được giữ trong xương hay được bảo tồn trong các xác ướp.

2.2.5.2 PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cách nhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR Khả năng nhận biết đột biến một cách nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh di truyền.

PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Ví dụ: Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng Từ đó ta có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại.

2.2.5.3 PCR được dùng để khuếch đại RNA

PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) nhờ enzyme reverse transcriptase

Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của một mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điểm khác nhau Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạt

động của gen cha mẹ Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đổi trong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm soát

2.2.5.4 PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau

Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là kỹ thuật hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiến hóa và suy vong của các loài hay các nhóm sinh vật khác Hai sinh vật có quan hệ thân tộc sẽ có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown, 1994).

2.2.6 Các hạn chế của phương pháp PCR

Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề Tuy nhiên, ta không thể quên rằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả Có thể kể ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR:

2.2.6.1 Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên

Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.

2.2.6.2 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao đối với phương pháp này

Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quả rất nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau những lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín trong phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị dung cụ…rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau:

- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau

- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng cho các thao tác khác Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm vào đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.

- Tất cả các thành phần phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho 1, 2 lần thao tác.

2.2.6.3 Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide) Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,…

Phần 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

3.1.1 Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/20053.1.2 Địa điểm

- Mẫu phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai; mẫu phân heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An – Bình Dương.

- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP HCM.

3.2 Nội dung

- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.

- Nuôi cấy, phân lập E coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.- Chọn khuẩn lạc điển hình của E coli / nhóm E coli.

- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA

- Ly trích DNA của E coli phân lập được.

- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E coli.

3.3 Phương pháp nghiên cứu3.3.1 Lấy mẫu

- Mẫu phân tiêu chảy

Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair Bảo quản ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ).

- Mẫu bề mặt thịt

Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào chai có sẵn 50 ml nước peptone đệm Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông buộc kỹ Bảo quản 4 - 80C, chuyển về phòng thí nghiệm.

- Số lượng mẫu: Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi

khuẩn E coli từ các mẫu đã lấy.

Bảng 3.1 Số lượng mẫu

3.3.2 Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E coli

3.3.2.1 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), Sorbitol-SMAC, thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CT- SMAC), hóa chất thử IMViC…

3.3.2.2 Nuôi cấy và phân lập

(1) Mẫu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC để có

những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37oC Mẫu bề mặt thịt được làm đồng đều trong 125 ml peptone đệm phosphate có bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125 mg/l, vancomycin với nồng độ 8 mg/l (FDA, 2002) Ủ 24 giờ ở 37oC, cấy sang môi trường

CT-SMAC Vi khuẩn E coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm đục, E coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường MAC.

(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E coli

- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, SMAC.

CT Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E coli của mẫu

khảo sát Các nhóm khuẩn lạc như sau:

Phân tiêu chảy

 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM).

 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS).

 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS).

 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT – SMAC (Ký hiệu TC).

(3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA).

- Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA Phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml nước cất khử ion vô trùng để ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tổng).

Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E coli

của Cerna và ctv (2003) và Botteldoorn và ctv (2003) để tiến hành ly trích DNA từ vi

khuẩn E coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau: đun sôi 10 phút rồi

chuyển vào tủ -70oC để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm).

- Quy trình phân lập vi khuẩn E coli như sau:

Cạo tất cả những khuẩn lạc đã chạm theo từng nhóm riêng:(1) 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC

(2) 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC(3) 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC(4) 6 – 10 khuẩn lạc hồng CT – SMAC(5) 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT - SMAC

Phân Thịt Peptone (vancomycin, cefixime)(37oC/24h)

MAC(37oC/24h)

SMAC(37oC/24h)

CT - SMAC(37oC/24h)

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn để cấy qua ống NA theo từng nhóm riêng, cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H2O cất

khử ion 2 lầnCấy từng khuẩn lạc

được chọn vào từng ống NA nghiêng

(37oC/24h)Chọn 6-10 khuẩn

lạc đỏ hồng

Chọn 6-10 khuẩn lạc trắng và / hoặc đỏ hồng

Chọn 6-10 khuẩn lạc trắng và / hoặc đỏ hồng

Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)Multiplex - PCR

Ly trích DNA riêng theo từng ống NA Loại bỏ các ống NA

Multiplex- PCR

Thử IMViC(+/-;+;-;-)

Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E coli và phát hiện gen độc lực

3.3.3 Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E coli phân lập

được bằng multiplex - PCR

- Việc phát hiện các gen độc lực của E coli được thực hiện bằng 2 phản ứng

multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):

 Multiplex – PCR1: Phát hiện các gen eae, hly, stx1, stx2.

 Multiplex – PCR2: Phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I.

- Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với mẫu khảo sát.

 EDL933 là đối chứng dương với các gen eae, hly, stx1, stx2.

 H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I.

Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Trường đại học Thú y Toulouse (Pháp).

AB gene 0.5UI; DNA khuôn mẫu 1µl; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50µl.

* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR1 (Paton và Paton, 1998a):

Bước 1

950C / 1 phút

650C / 2 phút 10 chu kỳ720C / 1,5 phút

Bước 2

950C / 1 phút

640C / 2 phút 1 chu kỳ720C / 1,5 phút

Bước 3

950C / 1 phút

630C / 2 phút 1 chu kỳ720C / 1,5 phút

Bước 4

950C / 1 phút

620C / 2 phút 1 chu kỳ720C / 1,5 phút

Bước 5

950C / 1 phút

610C / 2 phút 1 chu kỳ720C / 1,5 phút

Bước 6

950C / 1 phút

600C / 2 phút 10 chu kỳ720C / 1,5 phút

Bước 7

950C / 1 phút

600C / 2 phút 11 chu kỳ720C / 2,5 phút

 Multiplex – PCR2

* Trình tự các đoạn primer được sử dụng trong multiplex – PCR2:

(Dẫn liệu của Blanco và ctv, 1997)

*Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR2:

PCR buffer 1X: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25oC) 750 mM, (NH4)2SO4 200 mM, 0,1 % Tween 20; MgCl2 2mM; dNTP 200µM; primer: LTa-F 150 ng, LTa-R 150 ng, STa-F

150 ng, STa-R 150ng, STb-F 45 ng, STb-R 45 ng, Vt2e-F 225 ng, Vt2e-R 225 ng; Taq -

polymerase AB gen 0.5UI; DNA khuôn mẫu 3,5µ l; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50µ

* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002):

3.3.4 Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di

Sau phản ứng multiplex - PCR, 6µl sản phẩm PCR cùng với 1,2µl loading dye

được điện di trên gel agarose 1,4% trong TBE 0,5X Ladder cũng được điện di đồng thời Thời gian điện di là 30 – 35 phút ở 100V, 250mA

Gen

độc lựcPrimerTrình tự đoạn primer (5’→ 3’)

Kích cỡ đoạn DNA khuếch

600C / 45 giây 25 chu kỳ720C / 1 phút

720C / 10 phút