Nghiên cứu đa hình gen mthfr ở 2 vị trí 677 và 1298 trên phụ nữ mất thai tái diễn

-■c -ÍM Qỉ ugc V Hl LỊÌ CÁM ƠN Trai qua năm học tập rèn luyện trường Đại Hex: Y Hã Nội em xin chân thánh cam ơn Đáng ủy Ban giảm hiệu nhã trường cãc thầy giáo, cô giáo Trường Dại học Y Hà Nội tận tinh, tâm huyết trụyèn dạy cho em kiến thức chuyên mòn quý báu lòng nhiệt huyết vã tinh yêu nghề Em nit may man tự hào dược thực Khóa luận tổt nghiệp Bộ mơn Y sinh học - Di truyền Thịi gian tham gia nghiên cứu Bộ môn dà mờ cho em gỏc nhìn thú vị bồ ích chuyên ngành Di truyền với nhiều kỳ thuật sinh học phân từ đại Em xin gưi lởi cám ơn chân thánh tới TS.BS Doãn Thị Kim Phượng Phó Trướng Bộ mịn Y sinh học - Di truyền, lả người đà trực tiếp hướng dẫn tán tinh chi dạy giúp dờ động viên em sát trinh lảm nghiên c ửu đe em hỗn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thảnh câm ơn thầy, cỏ giáo, cảc anh chị kỳ thuật viên vã cãc anh chị bác sỳ nội trú Bộ môn dà nhiệt tỉnh giúp dờ tạo diều kiện thuận lựi cho em trinh thực hồn thành nghiên cứu Con xin bày to lịng biết ơn sâu sấc tới gia dính ln dộng viên, có vù vượt qua khó khãn lã chồ dựa vừng cho suốt chặng đường vừa qua Xin cam ơn bạn bè đà giúp đờ hồ trợ nhiều sáu năm học q trinh hồn thành khóa luận Hả Nội ngày 26 tháng năm 2021 Đoàn Nguyền T rã My -ÍM Qỉ ugc V Hl LỊÌ CAM ĐOAN Tơi Doãn Nguyền Trà My sinh vicn Y6 chuyên ngành Bác sf đa khoa, xin cam đoan nhùng điều sau: Dày khóa luận tịi trực tiếp thực cách khoa học chinh xác hưởng dần cùa TS.BS Doãn Thị Kim Phượng Các số liệu, thơng tin khóa luận hồn tồn trung thực, khách quan thu thập từ quã trinh nghiên cứu cùa chưa đăng lai cõng trinh nghiên cúu hay tài liệu khoa học não Hả Nội ngây 26 thảng năm 2021 Sinh viên Doản Nguyễn Trã My -ÍM Qỉ ugc V Hl MỤC LỤC DẠT VĂN ĐẺ M .- Chương I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU- 1.1 Tố ng quan VC thai tái điền 1.1.1 Định nghía 1.1.2 Dịch tẻ học 1.1.3 Nguyên nhân vã yếu tổ nguy .4 1.1.4 Điều trị 1.2 Gen MTHFR (Methylenetetrahydroíolate Reductase) .12 1.2.1 Tông quan VC gen MTHFR .12 1.2.2 Vị tri vả cấu trúc cùa gen MTHFR 13 1.2.3 cắu trúc vả chức nâng protein MTHFR .13 1.2.4 Đa hình gen MTHFR 14 1.2.5 Tinh hình nghiên cứu mối liên quan da hỉnh gcn MTIIFR thai tãi diễn 16 1.3 Một sổ kỳ thuật phát đa hỉnh gen MTIIFR 17 1.3.1 Kỹ thuật PCR 17 1.3.2 Kỳ thuật real - time PCR 18 1.3.3 Kỳ thuật phàn tích đoạn DNA 19 1.3.4 Kỹ thuật giái trinh tự gen Sanger 20 Chương 2: ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU 22 2.1 Đối tượng nghiên cửu 22 2.1.1 Tiêu chuấn lựa chọn 22 2.1-2 Tiêu chuằn loụi ưìr .22 2.2 Thời gian địa diêm nghiên cứu .22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Thiết kế nghiên củu 22 2.3.2 Cờ mầu nghiên củu .23 2.4 Biến số chi số nghiên cứu .24 2.5 Quy trinh nghiên cứu 25 2.6 Kỳ thuật real time PCR đế xác định đa hình 25 2.6.1 Lấy mầu tách chiết DNA .25 2.6.2 Phím ứng real time PCR .26 2.6.3 Phán tích kết 28 2.7 Xử lý sổ liệu 29 2.8 Dạo đức nghiên cửu 29 Chương 3: KÉT QUẢ NGHIÊN cứt’ 30 3.1 Đặc diêm cua doi tượng nghiên cứu 30 -ÍM CỊỈ ugc V Hl 3.2 Xác dinh da hỉnh kiêu gen MTHFR C677T vã A1298C 30 3.2.1 Kct qua tách chiết DNA 30 3.2.2 Hĩnh anh tin hiệu chạy máy real time PCR 31 3.2.3 Phân bố kiểu gen vả tẳn sổ alen cua da hình MTHFR C677T A129SC cùa dối lượng nghiên cứu 33 3.3 Mối liên quan kiêu gen MTHFR C677T A1298C với mắt thai tải diền cùa dổi tượng nghiên cứu 36 Chương 4: BÀN LUẬN - 39 4.1 Đặ c diêm đối tượng nghiên cứu 39 4.2 TylệkicugenNíTHFRC677TvàA1298Cbằngkỳthuậỉteal tintPCR.39 4.2.1 đa hỉnh C677T .39 4.22 da hỉnh A1298C .41 4.2.3 phổi hợp da hinh gen MTHFR C677T A1298C 42 -c -ÍM Qỉ ugc V Hl 4.3 Mối liên quan giừa kieu gen MTHFR C677T A1298C vói ĩliai tái diễn 43 4.4 Điềm mạnh điềm yếu cua nghiên cứu 45 KÉT LUẬN - - .46 KIẾN NGHỊ _~ _48 TÀI LIỆU THAM KH AO PHỤ LỤC -ÍM Qỉ ugc V Hl DANH MỤC CÁC CHỪ MÉT TẤT Tiếng Anh ASRM American Tiếng Mệt Society for Hiệp hụi Y học sinh san Hoa Kỳ DNA Reproductive Medicine Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate HLA Human leukocyte antigen MTHFR Methvlenetetrahydrofolate Khăng nguyên bạch cầu người Reductase NIPS Non Invasive Prenatal Sàng lọc trước sinh không xảm Screening lần PCR Polymerase Chain Reaction Phan ứng chuối polymerase STR Short tandem repeat Trinh tự lặp lại ngán TNF Tumor necrosis factor Yèu tồ hoại tư u -W -ÍM Qỉ ugc V Hl H& DANH MỤC BÁNG Bang 2.1 Bien số chi sổ nghiên cứu 24 Bang 22 Thành phần mầu phan ứng PCR .27 Bang 23 Chu trinh luân nhiệt cua phàn úng real time PCR 27 Bang 2.4 Phản tích kết qua real - time PCR 28 Bang 3.1 Đậc diêm chung cua dối tưựng nghiên cứu .30 Bang 32 Nồng độ DNA độ tinh trung bình 31 Bâng 3.3 Phân bố kiêu gen tằn số alen cùa đa hình C677T nhóm thai tái diễn nhóm chứng 33 Bang 3.4 Phản bỗ kiêu gen vã tẩn sổ- alen cùa đa hình A1298C nhỏm mầt thai tải dièn nhóm chửng 34 Bang 3.5 Ty lệ kiều gen phối hợp cua C677T A1298C nhóm thai tái điền vả nhõm chứng 35 Bang 3.6 Đánh giá da hỉnh C677T A1298C liên quan den mat thai tái diễn theo cãc kiêu gen đa hình .36 Bang 3.7 Tý lộ da hĩnh cua C677T nhóm thai tái diễn 37 Bang 3.8 Tý lộ da hình cua A1298C nhỏm thai tái điền 37 Bang 3.9 Tý lệ phối hợp hai da hình C677T A1298C nhõm thai tải diễn 38 -ÍM CỊỈ ugc V Hl DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí gen MTHFR nhiẻm sắc thè 13 Hình 1.2 Chuyển hỏa homocystein vã vai ưô cua MTHFR 14 I lính 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25 II inh 3.1 Hình anh đồ thị phán ímg cua chứng ám khơng có DNA 31 Hình 3.2 Hĩnh ánh đồ thị phan img cua kicu gcn đồng hợp ur bình thưởng mầu bệnh chứng dương đong hợp tữ .32 Hình 3.3 Hĩnh anh đồ thị phan ứng cua kiêu gen dị hợp tư mầu bệnh vã chứng dương dị hợp tư 32 Hình 3.4 Hình anh đổ thị phán úng cứa kiêu gen dồng hợp tư da hình mẫu bệnh chửng dương dồng hợp tứ .32 -W -ÍM Qỉ ugc V Hl TÓM TẤT Lý lựa chọn đề tài: Da hình gen MTHFR dược sổ nghiên cứu trẽn thề giời chì yểu tồ nguy gây thai tái diễn Tuy nhiên, rần suất đa hình anh hương cùa cảc da hình khác trẽn chung tộc người vùng địa lý khác Do dó chủng lòi th tre de tài de hước dầu khao sát mồi liên quan da hình gen MTHFR C677T A1298C với mat thai tái diễn phụ nữ Vìỳt Nam Mục tiêu: Phát da hình gen MTHFR hai vị tri C677 AI298 phụ nữ mẩt thai tái diễn bước dầu khao sát moi lìèn quan hai da hình gen VỚI rình trạng mấr thai tái diễn Đối tượng phương pháp: Nghiên cửu bệnh chứng 60 phụ nừ độ tuồi từ 18 dền 45 dò 30 phụ nừmất thai tái diễn hai lằn trỡlên 30 phụ nữ khoe mạnh dã sinh sồng, không cỏ tiền sứ sày thai, thai chắt lưu Xác dịnh da hình gen MTHFR C677T A1298C kỳ thuật real - time PCR Kef quá: Ty lý da hình cùa MTHFR C677T lã 63,33% 33.33% nhóm bệnh vá nhõm chừng Ty lệ da hình cua MTHFR AỈ298C nhõm bịnh chứng 40% 26.67% Tỳ lè kiểu gen 677CT nhóm bệnh cao lum dâng kể so với nhóm chủng với pT allele of 5.10 methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR): findings from over 7000 newborns from 16 areas world wide Journal of Medical Genetics, 40(8); 619-625 67 Zhang Y Zhan w vã Du Q (2020) Variants C.677 C>T C.1298 A>c in MTHFR and C.66 A>G in MTRR Affect the Occurrence of Recurrent Pregnancy Loss in Chinese Women Genetic Testing and Molecular Biomarkers, 24(11) 717-722 6S Xie X Zhang ¥ Xin L (2017) Relationship of folate metabolism related enzymes MTHFR and MTRR gene polymorphisms with unexplained recurrent spontaneous abortion Jw J Clin Eyp Pathol 10(3) 3746 3752 69 Abu-Asab N.S, Ayesh S.K vã Ateeq R.o (2011) Association of Inherited Thrombophilia with Recunent Pregnancy Loss in Palestinian Women Obsteưics and Gynecology International 2011 e6S9684 -c -ÍM Qỉ ugc V Hl 70 Al-Achkar w., Wafa A Ammar s cộng (2017) Association of Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T and A129SC Gene Polymorphisms With Recurrent Pregnancy Loss in Syrian Women Reprod ScL 24(9) 1275 1279 -■c -ÍM Qỉ ugc V Hl PHỤ LỤC BỌ CẢU HOI SÀNG LỌC Cảu hóỉ STT Chi ti? Từ tnrớc tới chị mang thai lân? Từ trước tới chị đà có lần mang thai thành cơng chưa? Trá lịi Chị đà chân đoán say thai lần? Lúc tuổi thai lã bao nhiêu? Chị dược chân đốn thai diet lưu lần? Lúc tuôi thai bao nhiêu? Chị đà three chân đoản nguyên Bầt thường nhiễm nhân sáy thai, thai chết lưu chưa? sắc Cớ' Khơng Ngun nhân gi? (nếu cỏ) Rổi loạn nội tiềt Có' Khơng Bât thường tư cung Có' Khơng Hội chứng khảng phospholipid Có' Khơng Các roi loụn đóng máu Có' Khơng Khác cỏ' Khơng Từ trước đen chi đà bi nhùng bệnh lý gi? Khác -W -ÍM Qỉ ugc V Hl H& PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN T T ỉ 11 21 31 41 51 61 71 S1 92 02 12 22 32 42 52 72 82 93 'l en bộnh nhân Nảm sinh Tuổi Đa hinh C677T Có khơng có Kiểu đa hình gen )M BI.-NH Có Có Khơng Có Khơng Khơng Cõ Cỏ Có Khơng Co Cỏ Cỏ Khơng Khơng Khơng Khơng Co Có Khơng Có Phạm T Vũ T Nguyen T Trà M Nguyễn Thị T Trân Hà M Phạm Thu II Đậng Hồng H Mai Thu H DÒ Ilu Ọ Nguyễn T Hậu T Phạm Thi N Nguyen Thị N Bui Thị H Nguyễn Thị H Do T Thu II Nguyên lh| H Pham Ngọc A Nguyen Thạch T Nguyen Thị H Nguyen Thi p Trịnh T Minh T Kiều Hống H 1990 19S6 1987 1989 1991 1991 1989 1985 1991 1990 1990 1987 1991 1983 198S 19S9 1991 1976 1977 19S9 1987 NH( 30 34 33 31 29 29 31 35 29 30 28 33 29 332 31 29 41 41 29 31 BủiThilL Lê Thi Đ Trân Thị N Thân Thị L Vương Ngọc H Nguyen Thu H Hoàng T Huyền T Hoàng Thi Y Phạm Thị X 19SS 1987 1994 1984 1993 1987 1995 19S6 1989 30 31 24 34 25 31 24 33 30 Không Có Khơng Cỏ Co Có Cỏ Cỏ Có -ÍM Qỉ ugc V Hl H& CT CT cc CT cc cc CT CT CT cc TT CT CT cc cc cc cc CT CT cc CT cc CT cc CT CT er CT CT TT Đahính AI298C Cơ khơng có Kiêu đa hình gen Khơng Có Có Khơng Cơ Co Khơng Khơng Khơng Cõ Khơng Co Khơng Khơng Có Khơng Khơng Khơng Có Có Khơng AA Có Khơng Có Khơng Khơng cc Cỏ Không Không Không cc AC AA AC AC AA AA AA AC AA AC AA AA cc AA AA AA cc AC ÁÁ AẤ cc AA AA AC AA AA AA Không Co Không Không Cỏ Co Không Không cc C cc cc C C cc Không Khơng Cõ Khơng Khơng Khơng Khơng Có 1984 1999 1OO 36 _2Ị_ 24 21 24 24 28 36 37 39 33 34 31 32 40 37 40 34 34 39 cc C TV cc cc cc cc cc cc T Không Không 1996 1999 1996 1996 1992 1984 19S3 19S1 1987 19S6 1989 19SS 1980 19S3 1980 19S6 1986 1981 Khơng Cỏ ĨA VO cỏ 1993 27 Ngun Till II Nguyen Thị II Đặng T Thủy N Phym T Thu II Nguyên T Mai L Nguyen Thị V Biũ T Thu H Nguyên Thị II 1995 1995 19S7 19SS 19S9 1993 1994 1992 Nguyên T, kim A Nguyen T Hồng II 17 lí 17» IV II1 11 Truong T Nhu Y Nguyen Thị N Nguyên I hị A Cao Linh G Dào II Ngọc A Do T Thanh B Tran Bích H lỗng Thi QNguyên Thị T Phíun Thị L Trần T 111U H Nguyên Thúy N Phạm Quỳnh T Trán Báo L Nguyen Huệ p Hoàng T Ánh T Trần Thanh T 31 41 51 61 IS 92 02 12 22 32 42 52 62 72 82 93 Tạ T Kim NHÓM CHUNG 25 25 33 32 31 27 26 28 Khơng Khơng Khơng Khơng Khơng Khơng Có Không Không Không Co Không Không Co Co Không 'không Khơng -■c -ÍM Qỉ ugc V Hl cc cc cc cc C cc cc C TT cc cc cc AA AA cc AA AA AA AA cc A AA rkHOiig Khơng Khơng Có Khơng Khơng Khơng Khơng Khơng CĨ Co Khơng Khơng Khơng Co Cơ Khơng Khơng Có •vl AA AA Không AA CC AA AA AA AA AA AC AC AA AA AA cc AC AA AA AC PHỤ LỤC Mà số mầu s 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Nồng độ DNA (ng/pl) OD 260/280 NHOM BỆNH 1.87 180,2 106*6 1.96 2004 1.78 103.8 1.92 217,2 1.80 SO,9 1,76 1,84 110,2 122'4 1'93 1403 1.79 172,2 1.84 187,3 1.88 90.6 75 138.5 1.77 1,84 110,2 1083 1’74 97,2 2,01 101,7 1,72 90.8 1.98 205,2 1.92 100'4 1.83 82.9 1.79 90,2 1.74 105,2 1.97 102,3 2,03 89 1006 77,5 1,77 174.1 1.79 213.0 1.S7 -W -ÍM Qỉ ugc V Hl H& OD 260/230 1,76 L87 2.13 2.04 1.75 1.84 1,89 L80 1.85 1,77 1,75 1.94 1.91 1,77 L79 1,73 1.80 2.17 1.86 1.81 1.99 1.81 1,77 1.S1 1.83 1,91 1,76 L80 29 30 72,1 129.1 NHOM c 151.4 187,3 174 223,0 17Ị2 119,1 190,1 206,7 118.3 113.2 97,2 172,0 130.3 132,2 110.6 98,0 87^2 120.4 88.5 97,1 112.6 110 135 208.4 113.8 87,2 180.0 150,3 17Ị7 120.6 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 -■c TÍM Qỉ ugc V Hl 1.77 1.73 IỬNG 1.91 1.87 1,79 1,78 1.76 1,73 1.81 1.83 1.89 1.77 1,75 89 1,75 1,77 1.95 1,74 1.73 1.87 1,79 88 1,79 87 1,74 1,81 92 2.01 1.97 1,85 81 91 1.80 1,87 2.2 1.84 1.87 1,98 í,92 1.78 1.81 90 2.14 2.12 1,87 1,72 85 L76 1.86 1,84 2J8 1.91 1,77 89 1,83 L79 1.80 1,86 L91 1,79 1.82 2,10 191 1.78 ... hình gen MTHFR C677T A 129 8C với mat thai tái diễn phụ nữ Vìỳt Nam Mục tiêu: Phát da hình gen MTHFR hai vị tri C677 AI298 phụ nữ mẩt thai tái diễn bước dầu khao sát moi lìèn quan hai da hình gen. .. diêm nghiên cứu .22 2. 3 Phương pháp nghiên cứu 22 2. 3.1 Thiết kế nghiên củu 22 2. 3 .2 Cờ mầu nghiên củu .23 2. 4 Biến số chi số nghiên cứu .24 2. 5 Quy trinh nghiên. .. "Nghiên cứu da hình gen MTHFR ô vị trí 677 129 8 trèn phụ nữ thai táỉ diễn' vói mục tiêu: Phár liai đa liính C677T vá /1? ?29 8C cua gen MTHFR ? ?phụ nà niấỉ thai íái diễn kỹ thuật Realtime PCR Bưởe