Nội dung đề tài đã tiến hành thử nghiệm phân ly tinh dê qua cột dung dịch albumin huyết thanh bò, sau đó thực hiện đông lạnh nhanh mẫu tinh sau thu nhận nhằm bước đầu tạo ra các liều tinh dê hướng đực. Để hiểu rõ hơn mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của bài viết này.
CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC hormone antibodies associated with decreased superovulatory response in goat? Theriogenology, 33: 192 Burcu U., Selim A., Yavuz N., Zekariya N., Deniz N., Bilginer T., Gozde S and Hakan S (2014) Repeated superovulation treatments in Kivircik ewes during breeding and nonbreeding seasons Turk J Vet Anim Sci., 38: 480-84 Chang Z., Fan M.L and Wu-Tan J (2006) Factors affecting superovulation and embryo transfer in Boer goat AsianAustr J Anim Sci., 19: 341-46 Cognie Y (1999) State of art in sheep-goat embryo transfer Theriogenology, 51: 105-16 Holtz W (2005) Recent development in assisted reproduction in goat Small Rum Res., 60: 95-10 Nguyễn Khánh Vân, Quản Xuân Hữu, Phan Trung Hiếu, Vũ Thị Thu Hương, Hoàng Thị Âu, Phạm Thị Kim Yến, Đỗ Chiến Thắng Phạm Doãn Lân (2020) Ảnh hưởng phương pháp tiêm FSH (Follicle-stimulating hormone) đến hiệu gây rụng trứng nhiều dê sữa Saanen Tạp chí KHCN Việt Nam, 62(12): 46-49 Ptak G., Tischer M., Bemabof N and Loi P (2003) Donor dependent development competence of oocytes from lambs subjected to repeated hormonal stimualtion Biol Rep., 69: 278-85 Lehloneya K.C., Greyling J.P.C and Grobler S (2009) Can repeated superovulation and embryo recovery in Boer goat limit donor participation in a MOET programme South Afr J Anim Sci., 39: 193-97 10 Remy B., Baril G., Vallet J.C., Dufour R., Chouvet C., Saumande J., Chupin D and Beckers J.F (1991) Are anitibodies responsible for a decreased superovulatory response in goat which have been treated repeatedly with porcine follicle stimulating hormone Theriogenology, 36: 389-99 11 Ustuner B., Alcay S., Nak Y., Nur Z., Nak D., Tuna B., Simsek G and Sagirkaya H (2014) Repeated superovulation treatments in Kivircik ewes during breeding and nonbreeding seasons Turk J Vet Anim Sci., 38: 480-84 ĐÔNG LẠNH NHANH TINH DÊ SAU PHÂN LY QUA CỘT DUNG DỊCH ALBUMIN HUYẾT THANH BỊ Ngơ Thành Trung1*, Trần Thị Chi1, Tạ Thị Hồng Quyên1, Vũ Hải Yến1 Sử Thanh Long1 Ngày nhận báo: 30/03/2021 - Ngày nhận phản biện: 30/04/2021 Ngày báo chấp nhận đăng: 04/05/2021 TĨM TẮT Thí nghiệm tiến hành với mẫu tinh khai thác từ 12 dê Saanen âm đạo giả Các mẫu tinh dê có hoạt lực tinh trùng ≥70%, nồng độ ≥2,5 tỷ tinh trùng/ml, thể tích tinh ≥0,7ml pha loãng dung dịch Tyrode (Henning, 2015) theo tỷ lệ 1:9 tra 0,5ml lên cột dung dịch albumin huyết bò (cột dung dịch BSA) tạo 4ml dung dịch BSA 15% đáy ống thuỷ tinh dung tích 10ml 4ml dung dịch BSA 6%, đặt ống nghiêng 45 độ ủ 20 phút 37oC Thu nhận lớp 4ml dung dịch 15% BSA từ ống phân tách mẫu tinh dê, xác định hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng tỷ lệ tinh trùng mang thể F Tinh thu nhận ly tâm 2.000 vòng/phút 10 phút 5oC, thu cặn trộn với dung dịch đơng lạnh (Tris-Citrate-Glucose bổ sung 20% lịng đỏ trứng gà 6% glycerol) đạt nồng độ 10 triệu tinh trùng/ml, đóng cọng rạ dung tích 0,25ml, ủ 5oC 120 phút, hơ cọng rạ cách mặt ni tơ lỏng 5cm 20 phút dìm sâu 5cm ni tơ lỏng 20 phút chuyển vào bình bi tơ trữ mẫu Sau 30 ngày bảo quản ni tơ lỏng, cọng rạ rã đông 37oC 60 giây (rã đơng trực tiếp), sau trộn với dung dịch Tyrode theo tỷ lệ 1:1 ủ 37oC 20 phút (rã đông dung dịch Tyrode), xác định hoạt lực tinh trùng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Các thí nghiệm lặp lại 12 lần Kết cho thấy, số tinh trùng thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch BSA đạt 14% tổng lượng tinh trùng ban đầu (mỗi ống dung dịch phân ly thu trung bình 7,5 cọng tinh đơng lạnh, mẫu tinh dê đực phân ly trung bình 20 cột dung dịch BSA), hoạt lực tinh trùng 90%, tỷ lệ tinh trùng mang thể F đạt 90% Hoạt lực tinh trùng sau rã đông trực tiếp đạt trung bình 35%, hoạt lực tinh trùng sau rã đơng dung dịch Tyrode đạt trung bình 45% Từ khóa: Đơng lạnh tinh trùng dê, dê Saanen, cột dung dịch albumin huyết bị Học viện Nơng nghiệp Việt Nam *Tác giả liên hệ: Ngô Thành Trung, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Điện thoại: 0961070980; Email: nttrungcnshhua@gmail.com 58 KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC ABSTRACT A study of fast cryopreservation of goat sperms after separated through bovine serum albumin medium column Experiments were achieved with semen samples collected from 12 Saanen bucks using artificial vagina Goat semen samples with sperm motility ≥70%, sperm concentration ≥2,5 billion sperms/ ml, semen volume ≥0,7ml were extended in Tyrode medium (Henning, 2015) with ratio 1:9 then each 0,5ml covered on bovine serum albumin medium column (BSA medium column) created by 4ml of 15% BSA medium on bottom of 10ml glass tube and 4ml of 6% BSA medium, placed 45o angle and incubated 20min at 37oC Collecting layers of 4ml of 15% BSA medium from separating tubes of each buck semen sample, evaluating sperm motility, sperm concentration and F-body bearing sperm ratio Collected semen samples were centrifuged 2,000rpm 10min at 5oC, sperm pelletes were collected and dilluted with sperm cryopreservation solution (Tris-Citrate-Glucose added 20% chicken egg yolk and 6% glycerol) to sperm concentration 10 millions of sperms/ml, loaded in 0.25ml cryo-straws, incubated 120min at 5oC, placed on 5cm from nitrogen surface for 20min then dept 5cm in liquid nitrogen for second 20min before stored in nitrogen tank After 30 days of preserved in liquid nitrogen, semen cryo-straws were thawed at 37oC 60sec (direct thawing), then diluted 1:1 with Tyrode medium then incubated 20min at 37oC (thawing in Tyrode), evaluated sperm motility and abnormal morphology 12 replications were done Results showed that, collected sperm number percentage after separated through BSA medium columns were 14% compaired with initiated numbers (from each separating medium tube gave average 7.5 sperm cryo-straws, each sperm sample of rach buck gave 20 BSA medium columns), sperm motility ≥90%, percentage of F-body bearing sperm was 90% Average sperm motility after direct thawed was 35%, average sperm motility after thawed in diluted with Tyrode was 45% Keywords: Goat semen cryopreservation, Saanen goat, bovine serum albumin medium column ĐẶT VẤN ĐỀ Mong muốn lựa chọn giới tính cho vật ni để phục vụ nhu cầu sản xuất thực tiễn người vấn đề đặt từ lâu 2.500 năm trước, người Hy Lạp đề cập tới vấn đề Đặc biệt ngành chăn nuôi nay, với mục đích sản xuất sản phẩm để thương mại hóa thịt, trứng, sữa, giống… định hướng giới tính cho vật ni có vị trí quan trọng nơng nghiệp hiên đại Trong đó, lựa chọn cho sản xuất trứng, bơ sữa, đực lựa chọn cho mục đích sản xuất thịt, tinh thương mại nhiều mục đích khác Việc định hướng giới tính đời theo hai hướng: định hướng dựa khác biệt tinh trùng mang nhiễm sắc thể X/Y hai xác định giới tính trước chuyển phơi Dường việc lựa chọn giới tính đời dựa vào việc phân tách hai loại tinh trùng X,Y sau phối giống nhân tạo phương pháp đơn giản có nhiều ưu điểm Các phương pháp để tách tinh trùng KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 X Y dựa khác loại tinh trùng kích thước tinh trùng, hàm lượng DNA, khả vận động, tính ưa pH, tích điện bề mặt, gốc định kháng nguyên màng tế bào tinh trùng Từ lâu chăn nuôi dê sinh kế người dân nghèo Việt Nam, người dân thích ăn thịt dê coi thịt dê thực phẩm chức Gần đây, nhu cầu sữa dê thịt giống dê có sản lượng chất lượng cao ngày lớn với trâu bò, dê đối tượng vật nuôi ưu tiên phát triển dịch tả lợn Châu Phi diễn Năm 2020, Việt Nam có tổng 26 triệu dê Công nghệ thụ tinh nhân tạo cho dê bắt đầu phổ biến Việt Nam đặc biệt khu vực miền Nam với nhiều sở chăn nuôi dê tập trung Nhu cầu giống dê hướng sữa cao, giá sữa dê Việt Nam cao gấp 2-3 lần sữa bị Tuy nhiên, chưa có nguồn cung ứng tinh dê hướng Việt Nam có giống dê địa dê Bách Thảo thích hợp để làm sản xuất dê lai hướng sữa Nhu cầu thịt dê Việt Nam cao, 59 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC chủ yếu thịt dê cỏ giống dê địa Việt Nam Người chăn nuôi Việt Nam biết nhập số dê đực giống hướng thịt Boer, Nubian, dê đực giống hướng sữa Saanen dê kiêm dụng Alpine Tuy nhiên, chưa có cơng nghệ giúp sản xuất tinh phân ly giới tính để cung cấp cho nhu cầu lớn thị trường Việt Nam Do đó, tự chủ việc tạo liều tinh giới tính mang lại lợi ích đáng kể hiệu cao, giảm chi phí sản xuất việc làm cần thiết Trong nhiều phương pháp thực giới áp dụng phương pháp phân tách giới tính tinh trùng cột dung dịch albumin huyết bò cho hiệu phân tách cao, đơn giản không tốn đặc biệt khơng phải đầu tư máy móc thiết bị đắt tiền Trong nghiên cứu tiến hành thử nghiệm phân ly tinh dê qua cột dung dịch albumin huyết bị, sau thực đơng lạnh nhanh mẫu tinh sau thu nhận nhằm bước đầu tạo liều tinh dê hướng đực VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm, dụng cụ, hóa chất Đối tượng, địa điểm: Các mẫu tinh dịch 12 dê đực giống Saanen 12-24 tháng tuổi, khoẻ mạnh, thời kỳ khai thác tinh tốt, huấn luyện thành thục khai thác tinh âm đạo giả thí tình, tinh dịch dê đạt yêu cầu phải có hoạt lực tinh trùng ≥70%, nồng độ tinh trùng ≥2,5 tỷ tinh trùng/ml, thể tích tinh dịch ≥0,7ml Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Sinh sản Tế bào Mơ hình Trung tâm Công nghệ hỗ trợ sinh sản chọn tạo giống Động vật, Bộ môn Ngoại - Sản, Khoa Thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Hóa chất: Tris, Glucose, axit citric, lòng đỏ trứng, Streptomycin, Penicillin, Glycerol, nước cất, NaCl, KCl, MgSO4.7H2O, NaHCO3, CaCl2, Quinacrine HCl, đệm Dulbecco phosphate buffered saline (DPBS), Bovine Serum Albumin Dụng cụ: kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu, tủ 60 bảo ôn, máy ly tâm lạnh, máy đo pH, bình nitơ, dụng cụ đơng lạnh, cọng rạ 0,25ml, micropipette, đĩa ấm, bể ổn nhiệt, tủ sấy, máy đo pH, cân kỹ thuật cân phân tích, máy khuấy từ, buồng đếm Neu Bauer, lam kính, lamen, giấy lau, ống Eppendorf, ống đong, cốc đong, pipet thủy tinh 10ml, ống bóp cao su, giá đỡ 2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm Nghiên cứu đặc tính sinh học tinh dê thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bò: 144 mẫu tinh dê khai thác từ 12 dê đực Saanen (khai thác lần/ tuần, lặp lại 12 lần), tinh dê sau khai thác pha loãng với dung dịch Tyrode tra lên cột dung dịch albumin huyết bò tạo ml dung dịch 15% BSA 4ml dung dịch 6% BSA Tiến hành phân tách tinh trùng qua cột dung dịch albumin huyết bò 20 phút 37oC Thu nhận 4ml lớp 4ml dung dịch 15% BSA từ ống phân tách mẫu tinh dê, xác định hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng tỷ lệ tinh trùng mang thể F Khai thác tinh dê: Tinh dịch dê khai thác nhân tạo âm đạo giả (nhiệt độ âm đạo giả 40-42oC), dê đực nhảy lên dê chịu đực cố định giá sắt (theo phương pháp Chemineau Cagnie) Dụng cụ lấy tinh vô trùng trước sử dụng Tinh dịch lấy vào buổi sáng, với khoảng cách hai lần lấy tinh lần tuần Đánh giá chất lượng tinh nguyên: Chất lượng tinh nguyên đánh giá theo lần khai thác cá thể, mẫu tinh không trộn lẫn Chỉ tiêu theo dõi: (i) Lượng xuất tinh (V, ml): xác định ống hứng tinh có chia vạch (ii) Hoạt lực tinh trùng (A, %): nhỏ giọt tinh nguyên lên lam kính, quan sát kính hiển vi, ước lượng tỷ lệ % tinh trùng tiến thẳng Lấy trung bình hoạt lực quan sát từ giọt tinh lam kính; (iii) Nồng độ tinh trùng (C, tỷ/ml): dùng micropipette hút 5µl tinh nguyên trộn 9995µl NaCl 10% ống Fancol 10ml, lắc đều, đưa dung dịch vào phía buồng đếm Neu Bauer (có đậy KHKT Chăn ni số 267 - tháng năm 2021 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC lamen dùng cho buồng đếm), đưa lên kính hiển vi đếm số lượng tinh trùng có 80 ô tính nồng độ tinh trùng; (iv) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: làm tiêu cố định quan sát kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần Cho 10µl tinh pha vào ống Eppendorf có chứa 700µl dung dịch Formol Citrate 4% Dùng lam kính sạch, sấy khơ, nhỏ giọt tinh pha cố định lên lam Dùng lamen sạch, trong, sấy khơ đặt nghiêng từ từ lên phần lam kính có chứa giọt tinh pha, cho tiêu cố định mà khơng có bọt khí Phần dung dịch thừa thấm hết giấy thấm Đưa tiêu cố định lên quan sát kính hiển vi Đếm tổng số 400 tinh trùng (cả bình thường kỳ hình) cho mẫu xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Phân tách tinh dê qua cột dung dịch albumin huyết bò: Đánh dấu mốc chiều cao từ lên ống nghiệm nhọn đáy theo mức 4ml - 4ml - 0,5ml Dùng micropipette hút chuyển nhẹ nhàng 4ml dung dịch Tyrode 15% albumin vào ống thủy tinh, thao tác thực từ từ, tránh tạo bọt khí Sau đó, tiếp tục hút chuyển nhẹ nhàng 4ml dung dịch Tyrode 6% albumin lên bề mặt lớp dung dịch 15% albumin (việc bơm sử dụng đầu micropipette tiếp xúc từ thành ống nghiệm, dung dịch từ từ chảy xuống để tạo lớp) Tương tự, tạo thêm ống thủy tinh với lớp albumin (6-15%) Bơm 0,5ml hỗn hợp tinh nguyên dung dịch Tyrode ủ khoảng 10 phút 37oC lên phía cột Ủ cột bể ổn nhiệt 37oC Sau 20 phút ủ, dùng micropipette riêng rẽ lớp: 0,5ml lớp (gọi lớp thu nhận cột hai lớp), ml lớp (gọi lớp thu nhận cột hai lớp) 4ml lớp đáy ống (gọi lớp thu nhận cột hai lớp) Xác định họat lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng tỷ lệ tinh trùng mang thể F lớp Đây quy trình cải tiến theo quy trình Erricson ctv (1973) Nhuộm thể F tinh trùng dê: Lấy 0,5ml tinh nguyên, sau bổ sung thêm 1ml dung dịch Tyrode ủ 37oC 10 phút Ly tâm với tốc độ 700 vòng/phút thời gian KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 phút 37oC, loại bỏ lớp dịch phía giữ cặn Bổ sung thêm 1,5 ml dung dịch Tyrode tái huyền phù, sau ly tâm tốc độ 1.500 vòng/phút 15 phút 37oC, loại bỏ lớp dịch phía giữ cặn Bổ sung thêm 1,5ml dung dịch Tyrode, tái huyền phù ly tâm tốc độ 1.500 vòng/phút 10 phút 37oC, loại bỏ lớp dịch phía giữ cặn Lặp lại bước 2, 3, giữ cặn Cặn bổ sung thêm 200µl dung dịch Tyrode, tái huyền phù chia thành hai phần Mỗi phần bổ sung thêm 150µl chymotrypsin ủ 37oC 10 phút Bổ sung thêm 250µl dung dịch quinacrine ủ 60 phút nhiệt độ phòng Quan sát kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng kích thích-exitation wavelength 410nm, bước sóng phát xạemission wavelength 490nm), tinh trùng Y có quầng màu xanh nhạt Đó điểm thể F, nằm đoạn cuối nhiễm sắc thể Y Đếm 200 tinh trùng, để xác định tỷ lệ tinh trùng X/tinh trùng Y Thí nghiệm Đánh giá hiệu đông lạnh nhanh tinh dê thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bò: phân lớp tinh thu nhận từ cột dung dịch albumin huyết bò sau phân tách mẫu tinh dê ly tâm thu cặn tinh tái huyền phù với dung dịch đơng lạnh, đóng cọng rạ 0,25ml đơng lạnh quy trình đơng lạnh nhanh Say 30 ngày bảo quản ni tơ lỏng, mẫu tinh đông lạnh giải đông bước (bước 1, giải đông trực tiếp - cọng rạ ủ 37oC 60 giây, xác định hoạt lực tinh trùng sau giải đông; bước 2, giải đông dung dịch Tyrode tinh sau giải đông trực tiếp trộn với dung dịch Tyrode theo tỷ lệ 1:1 ủ 37oC 20 phút để đánh giá khả hỗ trợ hoạt động tinh trùng dung dịch giải đông Tyrode Đông lạnh tinh dê: Tinh thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bò ly tâm 2.000 vòng/phút 10 phút 5oC, thu cặn trộn với dung dịch đơng lạnh (Tris-Citrate-Glucose bổ sung 20% lịng đỏ trứng gà 6% glycerol) đạt nồng độ 10 triệu 61 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC tinh trùng/ml, đóng cọng rạ dung tích 0,25ml, ủ 5oC 120 phút, hơ cọng rạ cách mặt ni tơ lỏng 5cm 20 phút dìm sâu 5cm ni tơ lỏng 20 phút chuyển vào bình bi tơ trữ mẫu Rã đơng tinh dê: Sau 30 ngày bảo quản ni tơ lỏng, cọng rạ rã đông 37oC 60 giây (rã đông trực tiếp), sau trộn với dung dịch Tyrode theo tỷ lệ 1:1 ủ 37oC 20 phút (rã đông dung dịch Tyrode), xác định hoạt lực tinh trùng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Mỗi mẫu tinh đông lạnh lần khai thác tinh dê đực lấy ngẫu nhiên cọng rạ để tiến hành rã đông 2.3 Xử lý số liệu Số kiệu thu thập theo ngày, tuần theo tháng xử lý số liệu xử lý theo chương trình phần mềm Excel 2013 SAS v9.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chất lượng tinh dê phân tách tinh dê qua cột dung dịch albumin huyết bò 3.1.1 Chất lượng tinh dê Chất lượng tinh dịch sau khai thác nhân tố định hiệu phân tách qua cột dung dịch albumin huyết bị hiệu đơng lạnh tinh thu nhận sau Thể tích tinh dịch (V, ml) số ml tinh dịch lần thực thành công phản xạ xuất tinh Qua việc xác định thể tích tinh dịch đánh giá sức sản xuất đực giống, đánh giá tình trạng sức khỏe đực giống mức độ thành công kỹ thuật khai thác tinh dịch Nồng độ tinh trùng số lượng tinh trùng đơn vị thể tích tinh dịch Nồng độ tinh trùng tiêu quan trọng đánh giá chất lượng tinh dịch Hoạt lực tinh trùng tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng mẫu tinh dịch Hoạt lực tinh trùng phải đạt tối thiểu 70% tinh trùng đạt tiêu chuẩn để sử dụng cho thí nghiệm đơng lạnh tinh để thực phân ly giới tính sau (Batista ctv, 2010) Tổng số tinh trùng tiến thẳng lần xuất tinh (VAC) 62 tiêu quan trọng, giúp đánh giá khái quát chất lượng tinh dịch sức sản xuất đực giống VAC cao chất lượng tinh dịch tốt, số liều tinh sản xuất cho thụ tinh nhân tạo nhiều Tinh trùng kỳ hình tinh trùng có hình thái học khơng bình thường đầu, cổ, thân, Chúng khơng có khả thụ tinh Đây tiêu quan trọng đánh giá chất lượng tinh thời điểm kiểm tra chất lượng tinh trùng Nếu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình q nhiều, tỷ lệ tinh trùng có khả thụ tinh thấp liều tinh bị loại bỏ Kết đánh giá tiêu chất lượng tinh dê đực thí nghiệm trình bày bảng cho thấy so với công bố Karagiannidis ctv (1999) tiêu chất lượng tinh dê Saanen Alpine lần lượt: thể tích tinh dịch 1,15 1,27ml, nồng độ tinh trùng 3,63 3,61 tỷ tinh trùng/ml, hoạt lực tinh trùng 64,4 59,8%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 8,41 10,27% Theo cơng bố Yodmingkwan ctv (2016) tiêu chất lượng tinh dê Boer: thể tích tinh dịch 1,15ml, nồng độ tinh trùng 3,0 tỷ tinh trùng/ ml, hoạt lực tinh trùng 80,83%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 15% Theo tiêu chuẩn chất lượng tinh dê TCVN 9715:2013 Dê giống - Yêu cầu kỹ thuật (chỉ có tiêu chuẩn giống dê Boer) với yêu cầu thể tích tinh dịch tối thiểu 0,6ml, hoạt lực tinh trùng 52%, nồng độ tinh trùng 1,5 tỷ tinh trùng/ml Như vậy, cá thể đực giống thí nghiệm 12 cá thể dê đực nghiên cứu có chất lượng tinh tương đối tốt, tương đương với công bố tác giả giới Việt Nam Bảng Các tiêu chất lượng tinh dê Chỉ tiêu đánh giá Màu sắc tinh dịch V (ml) A (%) C (tỷ tinh trùng/ml) VAC (tỷ) K (%) Mean±SD Trắng sữa 1,1±0,06 80,2±2,7 2,8±0,2 2,5±0,03 12,3±1,9 KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC 3.1.2 Phân tách tinh dê qua cột dung dịch albumin huyết bị Thí nghiệm tiến hành sở nghiên cứu Erricson ctv (1973) ông ctv thực việc phân tách giới tính tinh trùng người quy trình lọc qua cột gradient albumin lớp (6 15% BSA) cột gradient albumin lớp (6-10-20% BSA) Từ kết nghiên cứu, Erricson cho biết khơng có khác biệt hiệu phân tách cột BSA cột albumin Kết luận quan trọng, ta thực phân tách tinh trùng albumin huyết bị thay sử dụng BSA giá thành cao sở cho việc tiến hành nghiên cứu Dung dịch albumin huyết bị có độ nhớt cao, ngăn cản vận động tinh trùng, mà tinh trùng Y có kích thước nhỏ, khả vận động nhanh mạnh tinh trùng X nên bơi xuống phân lớp nhanh Trong nghiên cứu này, tinh dê tiến hành phân tách qua cột dung dịch albumin huyết bò cột lớp chứa 4ml dung dịch albumin huyết bò 15% lớp cùng, 4ml dung dịch albumin huyết bị 6% phía trên, tra 0,5ml tinh pha dung dịch hoạt hóa tinh nguyên dê đực giống pha loãng 10 lần (1 thể tích tinh nguyên : thể tích dung dịch hoạt hóa) lên Sau phân tách thu nhận phần: lớp tinh thu nhận 0,5 ml lớp cùng, lớp tinh thu nhận 4ml dung dịch 6% albumin huyết bò chứa tinh trùng lớp tinh thu nhận 4ml ống dung dịch 15% albumin huyết bò chứa tinh trùng Từng phân lớp dung dịch chứa tinh trùng để đánh giá hoạt lực, nồng độ tinh trùng tỷ lệ tinh trùng mang thể F Kết trình bày bảng Kết cho thấy số tinh trùng thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch BSA đạt 14% tổng lượng tinh trùng ban đầu (mỗi ống dung dịch phân ly thu trung bình 7,5 cọng tinh đơng lạnh, mẫu tinh dê đực phân ly trung bình 20 cột dung dịch BSA), hoạt lực tinh trùng 90%, tỷ lệ tinh trùng mang NST F 90% Kết tương đương với kết thu nhận tốt sau khảo sát nhiều KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 quy trình khác tinh người thực Erricson ctv (1973) Bảng Đặc tính sinh học tinh dê sau phân tách qua cột dung dịch albumin huyết bò Chỉ tiêu đánh giá A (%) C (triệu tinh trùng /ml) Tỷ lệ tinh trùng mang thể F (%) Mean±SD 89,17±2,04 4,92±2,69 89,56±1,58 3.2 Đông lạnh nhanh tinh dê thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bị Đối với tinh đơng lạnh khơng phân biệt giới tính, liều tinh cọng rạ dung tích 0,25ml dê cần có 20 triệu tinh trùng (Tuncer ctv, 2013; Lv ctv, 2018; Zamiri ctv, 2020), Việt Nam 60 đến 70 triệu tinh trùng (Đinh Văn Bình ctv, 2008) Tuy nhiên, tinh phân biệt giới tính bị, cọng rạ dung tích 0,25ml có 2-2,5 triệu tinh trùng (Guerino ctv, 2013 Boneya ctv, 2021) với lượng tinh trùng hiệu thụ tinh đạt 5070% Trên sở đó, nghiên cứu này, mẫu tinh dê thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bị tiến hành đơng lạnh với cọng rạ 0,25ml có 2,5 triệu tinh trùng Như vậy, từ ống dung dịch phân ly tương ứng với cột dung dịch phân ly giới tính thu trung bình 7,5 cọng tinh đơng lạnh, mẫu tinh dê đực phân ly trung bình 20 cột dung dịch BSA tương ứng 150 cọng rạ Các liều tinh này, có chất lượng tinh rã đông tốt (trên 35%) lưu trữ thử nghiệm phối tinh nhân tạo với kỳ vọng đạt hiệu thụ tinh tốt, làm sở tăng hiệu sản xuất tinh phân ly giới tính Và với số lượng tinh trùng hạn chế vậy, đồng thời tinh trùng phải chịu áp lực tiến trình thời gian phân ly qua cột dung dịch, sau lại chịu ảnh hưởng lớn trình đơng lạnh, vậy, chất lượng tinh đơng lạnh mẫu tinh thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bò chịu ảnh hưởng lớn Vì vậy, nghiên cứu tiến hành đồng thời việc kiểm tra 63 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC hoạt lực tinh trùng sau rã đông trực tiếp sau lấy cọng rạ khỏi bình chứa mẫu ni tơ lỏng đồng thời sau kiểm tra hoạt lực tinh trùng sau trộn với dung dịch Tyrode bổ sung thêm số thành phần hỗ trợ cho nguyên vẹn màng tế bào tinh trùng (polyvinyl pirrolidone, polyvinyl alcohol, bovine serum albumin), giúp tăng hoạt lực tinh trùng (ion canxi, bicarbonate), hỗ trợ cho khả thụ tinh tinh trùng (heparin, hypotaurin) dung dịch gọi dung dịch hỗ trợ thụ thai (Henning ctv, 2015) Kết đánh giá hoạt lực tinh trùng sau rã đơng trình bày bảng Kết cho thấy, hoạt lực tinh trùng sau rã đơng trực tiếp đạt trung bình 35%, hoạt lực tinh trùng sau rã đông dung dịch Tyrode đạt trung bình 45% Theo Đinh Văn Bình ctv, 2008; Tuncer ctv, 2013; Lv ctv, 2018; Zamiri ctv, 2020, mức hoạt lực tinh trùng sau giải đông trực tiếp nghiên cứu đạt yêu cầu để sử dụng cho thụ tinh nhân tạo với tỷ lệ đậu thai kỳ vọng đạt mức 50-60% Kết cho thấy, với việc sử dụng dung dịch Tyrode cải tiến với bổ sung nhiều thành phần hỗ trợ cho hoạt động tinh trùng hoạt lực tinh trùng tăng lên mức 45% trì ủ 20 phút sau thời điểm rã đông Bảng Hoạt lực tinh trùng sau rã đông mẫu tinh dê thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bị đơng lạnh nhanh cọng rạ dung tích 0,25ml Chỉ tiêu đánh giá Mean±SD A sau rã đông trực tiếp (%) 35,3±1,2 A sau ủ dung dịch Tyrode cải 45,6±2,3 tiến (%) KẾT LUẬN Hiệu suất phân tách tinh dê qua cột dung dịch albumin huyết bò đạt 14% (số tinh trùng thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch BSA đạt 14% tổng lượng tinh trùng ban đầu) với hoạt lực tinh trùng 90%, tỷ lệ tinh trùng mang thể F đạt 90% Hoạt lực tinh trùng tinh đông lạnh sau rã đơng trực tiếp đạt trung bình 35%, hoạt lực tinh trùng sau rã đông dung dịch Tyrode đạt trung bình 45% 64 LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu kết thực đề tài tài trợ Dự án Nâng cao lực nghiên cứu trường đại học Việt Nam Ngân hàng giới tài trợ, kết đề tài nghiên cứu sinh học viên Ngô Thành Trung, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đồng thời thành viên nhóm nghiên cứu tinh hoa Cơng nghệ Sinh sản Tế bào, Học viện Nông nghiệp Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Đinh Văn Bình, Chu Đức Tuỵ, Đỗ Văn Thu Lê Thành Đô (2008) Ảnh hưởng số yếu tố kỹ thuật đến kết thụ tinh nhân tạo cho dê tinh đông lạnh cọng rạ Tạp chí KHCN Chăn ni, 14(10.08): 67-74 Boneya G (2021) Sexed Semen and Major Factors Affecting Its Conception Rate in Dairy Cattle International Journal of Advanced Research in Biological Sciences ISSN: 2348-8069 Int J Adv Res Biol Sci., 8(1): 99-07 Ericsson R.J., langevin C.N and Nishino M (1973) Isolation of fractions rich in human Y sperm Nature, 246(5433): 421-24 Guerino G., Sa Filho M.F de, Vasconcelos R., Ferreira M and Sampaio P (2013). The use of sexsorted sperm for reproductive programs in cattle Success in AI - quality of semen and diagnostics employed. doi:10.5772/52180 Henning H., Ngo T.T and Waberski D (2015) Centrifugation stress reduces the responsiveness of spermatozoa to a capacitation stimulus in in vitro-aged semen Andrology, 3(5): 834-42 Karagiannidis A., Varsakeli S and Karatzas G (1999) Characteristics and seasonal variations in the semen of Alpine, Saanen and Damascus goat bucks born and raised in Greece Thriogenology, 53: 1285-93 Lv C., Wu G., Hong Q and Quan G (2018) Spermatozoa Cryopreservation: State of Art and Future in Small Ruminants Biopreservation and Biobanking doi:10.1089/bio.2018.0113 Martins A.D., Agarwal A and Henkel R (2019) Sperm Cryopreservation In Vitro Fertilization Springer Nature Switzerland AG 2019 Pp: 625-42 doi:10.1007/978-3319-43011-9_51. Tiêu chuẩn Việt Nam (2013) TCVN 9715:2013 Dê giống - Yêu cầu kỹ thuật 10 Tuncer P.B., Taşdemir U., Büyükleblebici S., Özgürtaş T., Coşkun E., Erol H., Aydin F.N and Gürcan İ.S (2013). Effects of different doses of trehalose supplementation in egg yolk extender in frozen–thawed Angora buck semen Small Rum Res., 113(2-3): 383-89. 11 Yodmingkwan P., Guntaprom S., Jaksamrit J and Lertchunhakiat K (2016) Effects of Extenders on Fresh and Freezing Semen of Boer Goat Agr Agr Sci Pro., 11: 125-30 12 Zamiri M.J (2020) Update on semen cryopreservation in sheep and goats: A review J Liv Sci Tech., 8(1): 01-15 KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 ... lệ tinh trùng X /tinh trùng Y Thí nghiệm Đánh giá hiệu đông lạnh nhanh tinh dê thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bò: phân lớp tinh thu nhận từ cột dung dịch albumin huyết bò sau. .. lượng tinh dê phân tách tinh dê qua cột dung dịch albumin huyết bò 3.1.1 Chất lượng tinh dê Chất lượng tinh dịch sau khai thác nhân tố định hiệu phân tách qua cột dung dịch albumin huyết bò hiệu... động tinh trùng dung dịch giải đông Tyrode Đông lạnh tinh dê: Tinh thu nhận sau phân ly qua cột dung dịch albumin huyết bò ly tâm 2.000 vòng/phút 10 phút 5oC, thu cặn trộn với dung dịch đông lạnh