XÁC ĐỊNH các KIỂU GEN THỤ THỂ PROLACTINTRÊN một số GIỐNG HEO CÔNG NGHIỆP BẰNGKỸ THUẬT PCR RFLP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỖ MINH TRÍ XÁC ĐỊNH CÁC KIỂU GEN THỤ THỂ PROLACTIN TRÊN MỘT SỐ GIỐNG HEO CÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH CÁC KIỂU GEN THỤ THỂ PROLACTIN TRÊN MỘT SỐ GIỐNG HEO CÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực TS VÕ THỊ TUYẾT ĐỖ MINH TRÍ KS BÙI THỊ TRÀ MI KHĨA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY DETECTING THE PRESENCE OF GENOTYPES OF PRLR IN PUREBRED YORKSHIRE AND LANDRACE IN BY USING PCR ─ RFLP TECHNIQUE GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr VO THI TUYET DO MINH TRI COURSE: 2002 - 2006 HCMC, 9/2006 XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẨN Họ tên sinh viên thực tập: Đỗ Minh Trí Tên luận văn: Xác định diện kiểu gen prolactin receptor số giống heo công nghiệp phƣơng pháp PCR - RFLP Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu giáo viên hƣớng dẫn, ý kiến nhận xét, đóng góp hội đống chấm thi tốt nghiệp Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn TS Võ Thị Tuyết KS Bùi Thị Trà Mi iii LỜI CẢM ƠN Với tất lòng thành, đời đời nhớ ơn công lao sinh thành, dƣỡng dục tất cha mẹ dành cho để có đƣợc nhƣ ngày hơm Với tất lịng kính trọng, em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tất Quý Thầy Cô giảng dạy truyền thụ kiến thức cho em suốt bốn năm học qua Con xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Thị Tuyết - ngƣời tận tâm hƣớng dẫn, dạy dỗ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập làm khóa luận Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Em xin chân thành cảm ơn Kỹ sƣ Bùi Thị Trà Mi - Giảng viên Khoa Chăn Nuôi - Thú Y tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Trong lúc thực đề tài này, chúng tơi có đƣợc giúp đỡ tận tình Ban giám đốc Xí nghiệm heo giống Đồng Hiệp, anh chị công nhân viên, kỹ thuật viên tạo điều kiện thuận lợi, cung cấp cho thông tin cần thiết để thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn chị Hƣng, anh Vũ, chị Hạnh, chị Vƣơng, anh Trƣờng, anh chị trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn động viên ủng hộ tinh thần cho em suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn bạn Lê Hồng Chung lớp Chăn ni 28 giúp đỡ tơi thực hiên đề tài Tôi xin cảm ơn bạn lớp DH02SH - Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh gắn bó giúp đỡ tơi suốt bốn năm học qua SV: Đỗ Minh Trí iv TĨM TẮT KHĨA LUẬN Đỗ Minh Trí, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 “ Xác định diện kiểu gen Prolactin receptor số giống heo công nghiệp phƣơng pháp PCR-RFLP ” Hội đồng hƣớng dẫn: TS VÕTHỊ TUYẾT KS BÙI THỊ TRÀ MI Gen thụ thể prolactin (PRLR) gen đánh dấu có liên quan đến tính trạng sinh sản heo Từ kết nghiên cứu năm gần giới cho thấy gen thực có ảnh hƣởng đến số đẻ số sống heo Để tiếp tục nghiên cứu vấn đề này, đề tài “Xác định diện kiểu gen Prolactin receptor số giống heo công nghiệp phƣơng pháp PCR-RFLP” đƣợc tiến hành từ ngày tháng năm 2006 đến ngày tháng năm 2006 đàn nái Y, L, D XNCN heo giống Đồng Hiệp Các kết thu đƣợc: + Ở nhóm heo thuộc giống L đƣợc khảo sát, kiểu gen PRLR xuất với tần số kiểu gen BB cao 20/48 (47,46 %), AB 19/20 (35,59%), AA 9/48 (16,95 %) Trên nhóm heo Y, tỷ lệ mẫu thành cơng 11/23 Trong kiểu gen BB chiếm 8/11(72,73 %) mẫu, AB 2/11 (18,18 %), cuối AA 1/11 (9,09 %) + Phân tích mối liên quan kiểu gen giống heo L với suất sinh sản cho thấy nái mang kiểu gen BB có trung bình số ổ cao (11,59 ± 2,83 con/ổ), nái mang kiểu gen AB 11,11 ± 3,31 con/ổ, nái mang kiểu gen AA 10,84 ± 3,06 con/ổ Đây khác biệt có ý nghĩa Có thể nói nái có kiểu gen BB có suất sinh sản cao nái có kiểu gen khác v ADSTRACT The prolactin receptor gene (PRLR) has been researched for recent years as a gene indicated the traits relevant to reproduction power of sows Researching in 110 purebred sows in Donghiep farm, there had 84 Landrace, 23 Yorkshire, and Duroc The results were the purebred sows had the genotypes of BB, their reproduction power got highest, and this genotype appeared with high frequency, the next was AB, and the last was AA In 84 samples of Landrace, there had 48 samples gave positive (57,14 %), with the positive samples was homozygote BB appeared with high frequency and these sows had high reproduction power (41,67 %), the homozygote AA gave lowest reproduction power (18,75 %), the genotype AB was 39,58 % In 23 samples of Yorkshire, there were 11 positive samples (47,83 %), there were 8/11 samples with homozygote BB (72,73 %), the genotype AB was 2/11 (18,18 %), and the last AA was 1/11 (9,09 %) With totally samples, The Duroc has been assayed and gotten the results well All of almost samples gave homozygote AA (100 %), although quantity of sample was low but this could point out the way to analyze about Duroc Comparison among the reproduction power and the genotype of sows, there were significant association of the PRLR locus with reproduction performance traits Through the results gave above and previous researchs of Vo Thi Tuyet et al (2005), we can foresee to conclude that in purebred sows with the homozygote BB give high reproduction power vi MỤC LỤC TRANG Trang tựa Xác nhận giáo viên iii Lời cảm ơn iv Tóm tắt khóa luận v Abstract vi Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng xi Danh sách hình xii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu PH ẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc tình hình chăn ni heo nái sinh sản Xí nghiệp chăn ni heo Đồng Hiệp 2.1.1 Lịch sử Xí nghiệp 2.1.2 Vị trí địa lí 2.2 Đặc điểm giống 2.2.1 Heo Yorkshire 2.2.2 Heo Landrace 2.2.3 Heo Duroc 2.3 Năng suất sinh sản 2.4 Những yếu tố ảnh hƣởng đến thành tích sinh sản heo nái 2.5 Giới thiệu vật liệu di truyền 2.5.1 Lịch sử nghiên cứu thành tựu di truyền học kỹ thuật gen 2.5.2 Acid nucleic vật liệu di truyền vii 2.5.3 Cấu trúc đặc điểm DNA 2.5.4 Cơ chế tự nhân đôi DNA 2.5.5 Sự biến tính hồi tính DNA .11 2.5.6 Phƣơng pháp tách chiết DNA 11 2.6Kỹ thuật PCR 11 2.6.1 Nguyên tắc 11 2.6.2 Các yếu tố ảnh hƣởng 12 2.6.2.1 DNA mẫu 12 2.6.2.2 Dung dịch đệm 12 2.6.2.3 Taq DNA polymerase 12 2.6.2.4 Các nucleotide (dNTP) 13 2.6.2.5 Các chu kì phản ứng .13 2.6.2.6 Nhiệt độ pH 13 2.6.2.7 Các vấn đề thƣờng gặp PCR phƣơng pháp khắc phục 14 2.6.2.8 Các enzyme cắt giới hạn .15 2.6.2.9 Ứng dung kỹ thuật PCR 15 2.7 Kỹ thuật PCR-RFLP 16 2.7.1 Nguyên tắc 16 2.7.2 Ứng dụng 16 2.8 Gen prolactin 17 2.8.1 Nguồn gốc cấu tạo 17 2.8.2 Tác dụng prolactin 17 2.8.3 Cơ chế tác động prolactin 17 2.8.4 Gen thụ thể prolactin 18 2.8.5 Tính đa hình gen prolactin 19 2.8.5.1 Tính đa hình gen 19 2.8.5.2 Tính đa hình gen thụ thể prolactin 20 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thời gian địa điểm .21 3.2 Đối tƣợng khảo sát 21 3.3 Nội dung thực 21 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 viii 3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc thiết bị làm thí nghiệm .21 3.4.2 Thu thập mẫu 22 3.4.3 Ly trích DNA 22 3.4.3.1 Ly trích DNA từ mẫu da tai 3.4.3.2 Định lƣợng DNA quang phổ kế 22 23 3.4.3.3 Khuyếch đại mẫu cắt enzyme giới hạn 23 3.4.4.3 Điện di gel agarose 25 3.4.4.4 Đọc kết điện di 26 3.4.4.5 Thu thập số liệu suất 26 3.5 Các tiêu theo dõi 26 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Đánh giá quy trình ly trích DNA từ mẫu da tai 27 4.2 Tỷ lệ thành công phản ứng PCR 28 4.3 Tỷ lệ thành công xử lý enzyme cắt tần số xuất kiểu gen gen thụ thể prolactin 30 4.4 Năng suất sinh sản nái ứng với kiểu gen gen PRLR .32 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC ix kháng bệnh cao so với giống heo ngoại nhập, loại heo dễ nuôi, thích hợp với điều kiện khí hậu miền Nam Bộ 2.2.2 Heo Landrace Có nguồn gốc Đan Mạch Heo có lơng trắng tuyền, khơng có đốm đen thân, đầu nhỏ, mông đùi to, hai tai xụ bít mắt, thân nhỏ, ngón, nhìn ngang thân hình giống nhƣ tam giác Ở tháng tuổi, loại heo trọng từ 80-90 kg, nọc nái trƣởng thành có trọng lƣợng từ 200-250 kg Heo nái năm đẻ từ 1,8-2,2 lứa, chăm sóc ni dƣỡng tốt đạt 2,5 lứa/năm.Mỗi lứa đẻ trung bình từ 1112 Heo nái Landrace có tiếng sốt sữa sai con, nuôi giỏi, tỷ lệ ni sống cao Heo có nhu cầu dinh duỡng cao, thức ăn hàng ngày phải đảm bảo cung cấp đủ protein lƣợng loại acid amin thiết yếu, nhu cầu dƣỡng chất khác cao giống heo ngoại nhập khác Chính mà loại giống heo chƣa đƣợc đại trà nuôi vùng nông thôn Trong tổng đàn heo ngoại, heo giống Landrace đứng thứ hai sau giống Yorkshire đƣợc nhà chăn nuôi quan tâm sử dụng làm chất liệu “nạc hoá” đàn heo thịt nhiều tỉnh thành 2.2.3 Heo Duroc Heo xuất xứ từ Mỹ, có đặc điểm màu long dễ phân biệt màu đỏ nâu (nơng dân thƣờng gọi heo bị) Heo chủng có màu đỏ nâu đậm, nhƣng heo lai, màu đỏ thƣờng nhạt màu vàng, vàng nhạt xuất đốm bơng đen Cũng có nhiều trƣờng hợp heo lai Duroc có phần thân sau lơng có ánh vàng nhiều đốm đen trịn, bầu dục mơng Heo Duroc chân có móng màu đen nâu, khơng có móng trắng Hai tai Duroc thƣờng nhỏ xụ, nhƣng gốc tai đứng, đặc biệt lƣơng Duroc cong ngắn địn, phận sinh dục trở nên thấp (nhất lứa tuổi hậu bị chờ phối) gây khó khăn cho đực giống giao phối Đực hậu bị bị nhƣợc điểm chân sau thấp thƣờng không phối phận sinh dục nái giống khác có phần chân sau cao hơn, heo Duroc heo cho nhiều nạc, sáu tháng tuổi heo đạt thể trọng từ 80-85 kg, nọc nái trƣởng thành đạt từ 200-250 kg, heo nái năm đẻ từ 1,8-2 lứa, lứa trung bình khoảng Đây giống heo có thành tích sinh sản hai giống Landrace Yorkshire Vì sản xuất nhiều nạc nên nhu cầu dinh dƣỡng heo Duroc thoả mãn đầy đủ, cân đối dƣỡng chất, protein phải cung cấp đầy đủ số lƣợng chủng loại acid amin thiết yếu Nếu thiếu dinh dƣỡng, heo nhanh chóng giảm suất tăng trƣởng, cho thịt sinh sản Bảng 2.1 So sánh tổng quát đặc điểm ba giống Y, L, D Giống Đặc điểm Có màu lơng trắng, tai đứng, mõm Yorkshire (ký hiệu Y) thẳng, ngực rộng, nuôi khéo, chịu đƣợc kham khổ, đẻ nhiều Dài địn, mơng nở, ngực hẹp, mõm dài Landrace (ký hiệu L) thẳng, tai co cụp phía trƣớc, bốn chân yếu, đẻ sai con, nuôi giỏi, chịu đựng thời tiết nóng Có khung vững chắc, bốn chân khoẻ mạnh, màu lông thay đổi từ nâu Duroc (ký hiệu D) nhạt đến đậm, tai nhỏ cụp phía trƣớc Là giống có tỷ lệ nạc cao, nhƣng thƣờng đẻ sữa 2.3 Năng suất sinh sản Năng suất sinh sản tiêu chuẩn để xác định giá trị thú chăn nuôi, theo nghĩa khác hình thái suất sản xuất biểu tƣợng đặc trƣng tính di truyền giống Đối với thú nuôi heo, tầm quan trọng kinh tế tiêu sinh sản nái đƣợc đánh giá cao Trong đó, tiêu nhƣ số đẻ ra, số cai sữa, số lứa đẻ/nái/năm có ảnh hƣởng to lớn đến lợi nhuận ngƣời sản xuất heo giống nhƣ ngƣời nuôi heo thƣơng phẩm Tuy nhiên, tiêu đƣợc biết chịu ảnh hƣởng yếu tố ngoại cảnh di truyền Xu hƣớng chọn lọc loại bỏ gia đình cá thể có thành tích sinh sản kém, tránh cận huyết đƣợc thay nái có thành tích cao Theo King (2005), để đánh giá suất sinh sản nái ngƣời ta tính theo số heo cai sữa/nái/năm Tại buổi hội thảo chuyên đề “Nâng cao thành tích sinh sản heo nái” ngày 8/3/2005 Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Dourmad đánh giá thành tích sinh sản heo nái dựa vào tiêu số lứa đẻ/nái/năm, số heo cai sữa/ổ Ngoài để đánh giá khả sinh sản thực tế cá thể, nhóm giống đàn nái phải dựa vào số tiêu cụ thể nhƣ tuổi đẻ lứa đầu, số lứa đẻ/nái/năm, số heo đẻ ra/ổ, trọng lƣợng heo sơ sinh, số heo cai sữa trọng lƣợng heo cai sữa 2.4 Những yếu tố ảnh hƣởng đến thành tích sinh sản heo nái Dinh dƣỡng yếu tố quan trọng, tạo động lực cho nái nái có thành tích sinh sản tốt Nếu thiếu quan tâm yếu tố suất sinh sản nái không cao Hay suất sinh sản nái giảm chúng ăn phải loại thức ăn thiếu protein, vitamin, khoáng chất, thức ăn bị thối mốc Bệnh tật nhƣ bệnh sảy thai truyền nhiễm, viêm đƣờng sinh dục dẫn đến sảy thai, chết thai dẫn đến suất sinh sản giảm Đặc tính di truyền chất lƣợng đực nhƣ tinh trùng bị khuyết tật, kỳ hình làm ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai, tỷ lệ sinh sản tỷ lệ ni sống Tiểu khí hậu chuồng ni nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, độ thơng thống, kiểu chuồng,…đều ảnh hƣởng đến sức sinh trƣởng sinh sản heo Nếu tiểu khí hậu chuồng ni khơng đƣợc tốt nguyên nhân để mầm bệnh sinh sôi, gây bệnh cho heo Chăm sóc quản lý ngƣời chăn ni yếu tố quan trọng tác động đến sinh lí sinh sản nái giống Không nên nhốt heo lạ chuồng để tránh gây thƣơng tích cạnh tranh vị trí, thức ăn, sinh lí heo,… Các tác nhân gây bệnh nhƣ vi khuẩn, virus, nội ngoại ký sinh trùng khí gây độc cho thú nhƣ H2O, NH3, CO, CO2,…nếu không đƣợc kiểm soát chặt chẽ gây thiệt hại cho ngƣời chăn nuôi heo 2.5 Giới thiệu vật liệu di truyền 2.5.1 Lịch sử nghiên cứu thành tựu di truyền học kỹ thuật gen Vào năm cuối kỷ XX, khoa học kỹ thuật phát triển cách chóng mặt, nhiều thành tựu thay đời, đƣợc ứng dụng thực tiễn hiệu Con ngƣời thật thay đổi phƣơng thức lao động, hình thức lao động trí óc thật thay lao động chân tay Sự phát triển di truyền học kỹ thuật gen giúp cho ngƣời hiểu biết sở khoa học số bệnh nan y, nhiều loại thuốc đặc trị đời giúp chữa số bệnh mà trƣớc không cứu đƣợc Sự phát triển khoa học không dừng lại lĩnh vực, mà đƣợc mở rộng sang lĩnh vực khác nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, y tế,… Mốc đầu cho phát triển di truyền học thực nghiệm đƣợc đánh dấu cơng trình Gregor Mendel (1865), thành tựu lớn năm đầu kỷ XXI cơng trình giải mã gen ngƣời nhân vơ tính ngƣời 2.5.2 Acid nucleic vật liệu di truyền Từ thí nghiệm Griffith (1928) chuột với hai chủng vi khuẩn gây bệnh viêm phổi Staphylococcus pneumoniae , chủng có tế bào vỏ nhầy gây bệnh viêm phổi kí hiệu S, chủng có vỏ khơng nhầy khơng độc kí hiệu R Năm 1944 Oswald Avery, Colin McLeod, Maclyn McCarty phát triển chứng minh vật liệu gây bệnh DNA Hình 2.1 Từ tế bào đến DNA Không giống nhƣ Griffith, năm 1952, Alfred Hershey Martha Chase dùng phóng xạ S 35 đánh dấu vỏ protein phage T2 kí sinh vi khuẩn E.coli, dùng P 32 đánh dấu phần lõi DNA loại phage T khác Sau gây nhiễm loại phage T đánh dấu vào đồng vị phóng xạ vào chủng E.coli riêng biệt, phân tích kết cho thấy chủng E.coli có S 35 bên tế bào, chứng tỏ protein vỏ phage T không đƣợc đƣa vào tế bào, không tham gia vào sinh sản tế bào phage T Một chủng E.coli khác có P 32 bên tế bào, điều khẳng định tham gia vào trình tái tế bào T2 hay DNA vật liệu di truyền phage T2 2.5.3 Cấu trúc đặc điểm DNA Acid nucleic vật chất mang thông tin di truyền thể sống Acid nucleic đƣợc cấu tạo từ đơn phân (monomer) nucleotide Mỗi nucleotide gồm có ba thành phần: nhóm phosphate, đƣờng pentose, nhóm bazơ hữu Bazơ hữu gồm có hai nhóm: nhóm bazơ purin nhóm bazơ pyrimidine Nhóm purin gồm có: adenine (A) guanine (G) Nhóm pyrimydine gồm có: thymine (T) cytosine (C) Bốn loại bazơ hữu kết hợp với nhóm phosphate đƣờng pentose tạo thành bốn loại nucleotide, ngƣời ta viết tắt chúng A, T, G, C Các nucleotide nối với thành chuổi dài hay mạch DNA Hình 2.2 Cấu trúc DNA Phân tử DNA có cấu trúc xoắn kép gồm hai mạch đơn, mạch đơn chuổi nucleotide Hai mạch đơn liên kết với liên kết hidro, liên kết đƣợc hình thành bazơ bổ sung A với T G với C A liên kết với T hai liên kết hidro, G liên kết với C ba liên kết hydro Mỗi mạch đơn có đầu -OH tự gốc phosphate tự Ngƣời ta qui ƣớc đầu chứa gốc phosphate tự đầu 5’, đầu chứa gốc OH tự đầu 3’ Một đặc điểm có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu phân tử DNA khả hồi tính biến tính DNA:  Sự biến tính tƣợng hai mạch DNA tách rời đứt gãy liên kết hidro nhiều yếu tố vật lý hoá học nhƣ: nhiệt độ, dung dịch kiềm, formaline, urea…Hiện tƣợng biến tính nhiệt độ xảy nhiệt độ nóng chảy (melting temperature, Tm) DNA thấp nhiệt độ môi trƣờng T m cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần DNA DNA chứa nhiều G, C nhiệt độ nóng chảy cao G liên kết với C ba liên kết hidro tƣơng đối bền vững nên cần nhiều nhiệt lƣợng để phá hủy liên kết  Hồi tính tƣợng hai mạch đơn DNA sau tách rời ban đầu gắn với theo nguyên tắc bổ sung hình thành nên phân tử DNA mạch kép Đặc điểm hồi tính biến tính DNA sở để thực phản ứng PCR (polymerase chain reaction) Hình 2.3 Cấu trúc bốn loại nucleic liên kết chúng 2.5.4 Cơ chế tự nhân đôi DNA DNA đƣợc xem vật chất sống có khả tự nhân đôi Đặc điểm tái tái theo nguyên tắc bán bảo tồn (semiconservative replication) Khi bắt đầu q trình chép có tách rời chuổi xoắn kép DNA tạo thành hai mạch đơn Mỗi mạch đơn đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp mạch Kết từ phân tử DNA ban đầu tạo hai phân tử DNA giống hệt giống với DNA mẹ, phân tử DNA đƣợc hình thành từ mạch mạch cũ Ở lần tái bản, có tháo xoắn chuổi DNA mẹ nhờ enzyme topoisomerase protein DNA A Trong trình chép chuổi tách rời dƣới dạng mạch đơn nhờ enzyme helicase, enzyme phá vỡ liên kết hidro nucleotide 10 Nhiều loại helicase họat động đồng thời, số gắn lên mạch 3’ – 5’, số gắn mạch 5’ – 3’ Các mạch tách rời đƣợc ổn định dƣới dạng mạch đơn nhờ protein SSB (single strand binding) gắn lên khắp mạch đơn làm mạch gắn lại với Sự tái đƣợc khởi đầu việc kéo dài đoạn mồi có chất RNA (ribonucleotide acid) bắt cặp sẵn mạch khuôn nhờ DNA polymerase Sự thêm nucleotide theo hƣớng 5’– 3’ Tức hai mạch DNA có mạch tái diễn theo chiều thuận mạch lại tái diễn theo chiều nghịch Trên mạch khuôn 3’- 5’ tái theo chiều 5’- 3’ hƣớng với chiều tháo xoắn tái mạch diễn cách liên tục đƣợc gọi sợi tiến nhanh Trên mạch lại tái diễn ngƣợc với chiều tháo xoắn Sự tổng hợp mạch không diễn liên tục mà dƣới dạng đoạn ngắn gọi đoạn Okazaki Sự tái bán bảo tồn có vai trị quan trọng qua tế bào phân chia truyền sang tế bào nguyên vẹn tồn cấu di truyền Trong phân bào bình thƣờng DNA đƣợc nhân đơi nhiễm sắc thể tách rời Hình 2.4 Sự tái DNA mang tính bán bảo tồn 2.5.5 Sự biến tính hồi tính DNA Sự liên kết cầu nối hydro nucleotide DNA liên quan đến tính bền vững đoạn DNA Đoạn DNA dễ bị tách đoạn DNA có nhiều cặp AT cặp G-C, đơn giản kết hợp G-C có tới ba liên kết hydro A-T chí có hai liên kết hydro Do đó, nhiệt độ gây biến tính DNA tách thay đổi tùy theo đặc tính đoạn DNA Trái lại, DNA bắt cặp trở lại điều kiện nhiệt độ thích hợp, đoạn DNA khơng bắt cặp trở lại nhiệt độ gây biến tính dài 11 2.5.6 Phƣơng pháp tách chiết DNA DNA đƣợc tách chiết từ mô quan động thực vật Ở động vật, DNA đƣợc tách chiết từ da, vân, mơ mỡ từ máu Qui trình gồm bƣớc + Bƣớc 1: phá vỡ màng tế bào màng nhân Tiến hành nghiền mô, tế bào dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) proteinase (proteinase K) Hỗn hợp phá hủy màng tế bào màng nhân, giải phóng DNA mơi trƣờng, đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA + Bƣớc 2: loại bỏ thành phần không mong muốn dung dịch chứa DNA hỗn hợp dung dịch phenol chloroform kết hợp với phƣơng pháp ly tâm + Bƣớc 3: tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc ethanol isopropanol 2.5 Kỹ thuật PCR 2.5.1 Nguyên tắc Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực chế tự nhân đôi DNA invitro Quá trình đƣợc tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase Phản ứng PCR gồm bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuổi đơn nhiệt độ 90 – 95 C Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp primer mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự primer, thông thƣờng khoảng 40 – 60 C Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp DNA đƣợc tiến hành 72 C Mỗi chu kỳ gồm bƣớc đƣợc lập lại nhiều lần 12 Hình 2.5 Chu trình phản ứng PCR 2.6.2 Các yếu tố ảnh hƣởng 2.6.2.1 DNA mẫu Phản ứng PCR tối ƣu DNA thật tinh Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR tốt DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng < 250 ng nhằm giảm việc tạo sản phẩm phụ không mong muốn 2.6.2.2 Dung dịch đệm 2+ Thành phần quan trọng dung dịch đệm ion Mg Nó cần thiết cho trình liên kết dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy DNA mạch kép Nồng độ MgCl2 tối ƣu 1,5 mM Môi trƣờng đệm KCl áp dụng rộng rãi, chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR Tuy nhiên nhiều trƣờng hợp môi trƣờng không 2+ hiệu nên ngƣời ta lựa chọn sử dụng Mg Những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate làm giảm sản phẩm đƣợc phát triển cách khơng hồn tồn PCR với Taq Phƣơng pháp dùng phát đoạn gen có kích thƣớc nhỏ chạy gel acrylamide 2.6.2.3 Taq DNA polymerase Taq polymerase enzyme tham gia vào q trình tổng hợp mạch DNA Enzyme cịn có khả phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện 13 cho việc bổ sung nucleotide vào mạch DNA Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus Enzyme có tính chịu nhiệt cao, o chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94 C Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động o Taq polymerase khoảng 70 – 72 C Trong phản ứng PCR nồng độ enzyme thấp không đủ lƣợng enzyme xúc tác cho phản ứng tạo sản phẩm PCR không mong muốn 2.6.2.4 Các nucleotide (dNTP) Deoxyribonucleotide-5-triphosphate-dNTP hỗn hợp loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA Nồng độ nucleotide phản ứng PCR cân làm cho phát sinh lỗi chép Taq polymerase 2.6.2.5 Số chu kì phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR thực tế không vƣợt qua 40 chu kỳ Số chu kỳ cho phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu Nếu chu kỳ sản phẩm PCR thu đƣợc Nếu kéo dài tiến trình PCR hiệu khuyếch đại giảm hẳn do: cạn kiệt thành phần phản ứng, giảm hoạt tính enzyme dùng phản ứng 2.6.2.6 Nhiệt độ pH Những enzyme đƣợc sử dụng mẫn cảm với nhiệt độ Sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến suất độ chuyên biệt sản phẩm PCR Để biến tính khoảng nhiệt độ từ 94 – 95 C thích hợp nhất, nhiệt độ cao làm hoạt lực Taq polymerase Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng 72 C, nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ đƣợc xác định tùy loại primer Primer có trình tự nhiều G, C nhiệt độ bắt cặp cao Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56 C Hầu hết enzyme, mẫu DNA đƣợc đệm mơi trƣờng tối ƣu có pH = Ở pH DNA ổn định Trong môi trƣờng acid bazơ purin dễ bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR pH thay đổi từ 6,8 – 7,8 14 2.6.2.7 Các vấn đề thƣờng gặp PCR phƣơng pháp khắc phục Ta có bảng sau: Bảng 2.3 Các vấn đề thƣờng gặp PCR phƣơng pháp khắc phục Có nhiều phẩm sản Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp; gia tăng thời gian ủ bắt cặp chuổi Gia tăng thời gian kéo dài chuổi ngắn không đặc trƣng o Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuổi lên đến 74 – 78 C Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 mức 1,5 – nM Gia tăng nồng độ MgCl2 lên – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP; giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn; giảm lƣợng Taq polymerase Có nhiều sản Giảm thời gian ủ bắt cặp; gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp phẩm chuổi dài Giảm thời gian kéo dài o không đặc trƣng Giảm nhiệt độ kéo dài xuống 62 – 68 C Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – X, giữ nồng độ MgCl2 mức 1,5 – mM Gia tăng nồng độ MgCl2 lên – 4,5 nM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi; giảm lƣợng DNA khuôn; giảm lƣợng Taq polymerase Khơng có sản Đảm bảo thành phần PCR cho vào phản ứng phẩm Đổi dung dịch dNTP dNTP nhạy cảm với việc cấp rã đông Gia tăng hàm lƣợng mồi.Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu o Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống – 10 C Sản phẩm PCR Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể; gia tăng lƣợng mồi; gia tăng lƣợng DNA khn Gia tăng lƣợng Taq polymerase ( Nguồn: Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Tuấn Kiệt-CNSH khóa 2001- 2005, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh) 15 2.6.2.8 Các enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn đƣợc khám phá váo cuối năm 1960, có khả cắt DNA vị trí xác, đóng vai trị quan trọng phân tích gen Ngƣời ta phân làm loại enzyme: Loại 1: Khi enzyme nhận biết đƣợc trình tự, di chuyển đoạn khoảng 100-5000 nucleotide giải phóng khoảng vài chục nucleotide Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự vị trí Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách khoảng 20 nucleotide Loại nhóm đƣợc sử dụng công nghệ sinh học phân tử Mỗi enzyme nhận biết trình tự cắt từ – nucleotide Có hai kiểu cắt enzyme cắt theo đầu dính cắt theo đầu bằng:  Kiểu cắt đầu bằng:  Kiểu cắt đầu dính: 16 2.6.2.9 Ứng dụng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng ngành sinh học PCR với cặp primer đƣợc thiết kế riêng phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn Từ đƣợc ứng dụng lĩnh vực: Y khoa: dùng chẩn đoán bệnh tác nhân vi khuẩn virus, xác định gen gây bệnh hay gen di truyền gây ảnh hƣởng tính cách, giới tính, sức khỏe,… Nơng nghiệp: dùng chọn giống xác định yếu tố gây bệnh trồng Dùng chuẩn đốn bệnh cơng tác chăn nuôi, chọn giống Dùng phát gen dự tuyển suất sinh sản chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin Thực phẩm: Xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn vius có mẫu thực phẩm Dùng chứng nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên sản phẩm chuyển gen… 2.7 Kỹ thuật PCR-RFLP 2.7.1 Nguyên tắc Nhằm khắc phục tƣợng tạo nhiều băng DNA phân cắt genome enzyme giới hạn phải thiết kế probe thích hợp việc phân tích đa hình DNA kỹ thuật RFLP ngƣời ta đƣa kỹ thuật PCR – RFLP PCR – RFLP kỹ thuật dựa sở khuyếch đại có chọn lọc đoạn DNA kỹ thuật PCR trƣớc Sau tiến hành phân cắt đoạn DNA enzyme thích hợp Sự khác băng DNA sau chạy điện di nhuộm ethium bromide cho ta biết đƣợc đa hình đoạn DNA Nhƣ trình thực kỹ thuật PCR – RFLP gồm giai đoạn sau: Tải FULL (59 trang): https://bit.ly/3y45X3p Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích đa hình Tiến hành phân cắt đoạn DNA với enzyme cắt thích hợp Chạy điện di xác định khác băng DNA đƣa kết luận 2.7.2 Ứng dụng Trong chọn giống thực vật sử dụng kỹ thuật RFLP để chọn lọc trực tiếp gen lặn mong muốn, không cần phân tích qua nhiều hệ Mặt khác đặc điểm nhiều gen kiểm soát, có liên kết gen, sử dụng kỹ thuật RFLP để xác định quan hệ gen Đây kỹ thụât xác định 17 phân li di truyền số tính trạng theo qui luật Mendel Ví dụ nhƣ kiểm tra gen xác định màu hoa,… Trong chọn giống động vật, kỹ thuật hữu hiệu để xác định giống có đặc điểm di truyền tốt nhƣ gen liên quan đến sinh sản, liên quan đến ngoại hình, liên quan đến phẩm chất thịt, sữa,… 2.8 Gen prolactin 2.8.1 Nguồn gốc cấu tạo Prolactin gọi LTH (Luteotropic hormone) Ở ngƣời loài động vật hữu nhũ prolactin đƣợc tổng hợp phân tiết tế bào ƣa acid tuyến não thùy Nó polypeptide gồm mƣời chín cấu tử amino acid trọng lƣợng phân tử khoảng 23000 Da 2.8.2 Chức prolactin Prolactin có tác động sinh học lên phát triển tuyến vú, tiết sữa ngƣời thú thời gian mang thai ni Trên số lồi động hữu nhũ, prolactin cịn tác động đến hồng thể kích thích phân tiết hormone progesterone Prolactin đƣợc phân tiết từ tế bào ƣa acid tuyến não thùy theo máu di chuyển đến quan đích, xảy tiếp nhận prolactin Sự tiếp nhận đƣợc định thụ thể có quan đích Bình thƣờng heo mẹ, heo bố hay heo phân tiết đƣợc prolactin, nhƣng cá thể có thụ thể tiếp nhận prolactin (prolactin receptor) chịu ảnh hƣởng hormone Sự xuất thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu yếu tố di truyền (prolactin receptor gene) Tải FULL (59 trang): https://bit.ly/3y45X3p Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net 2.8.3 Cơ chế tác động prolactin Prolactin đến tế bào mục tiêu kết hợp với protein chuyên biệt (receptor) tạo thành phức hợp hormone – receptor màng tế bào, phức hợp hoạt hóa enzyme adenylcyclase định vị màng tế bào xúc tác phản ứng thành lập c.AMP từ ATP c.AMP trực tiếp gây hiệu ứng sinh học tế bào chất nhân, nhƣ tác động vào đơn vị ức chế protein kinase, giúp cho protein kinase hoạt động xúc tác phản ứng phosphoryl hóa cấu tử serine protein tế bào mục tiêu dẫn đến hoạt hóa enzyme, tăng phân tiết tế bào, tăng vận chuyển chất qua màng 18 2.8.4 Gen thụ thể prolactin Cùng với phát gen thụ thể estrogen, gen halothan Ngƣời ta phát gen thụ thể prolactin Gen đƣợc nghiên cứu nhƣ gen dự tuyển cơng tác chọn giống dịng heo: Large White, Landrace, Duroc Theo nghiên cứu Linville, Drogemuler (2001), Võ Thị Tuyết (2005) cá thể heo có xuất gen thụ thể prolactin số ổ đẻ nhiều, tỷ lệ sống sót heo cao Đặc biệt, trọng lƣợng heo sinh trì mức bình thƣờng khơng có chênh lệch đáng kể so với ổ đẻ có số Ngồi ra, nhà nghiên cứu thấy tăng khối lƣợng ngày cá thể heo có diện gen thụ thể prolactin cao cá thể khơng có diện gen Các nghiên cứu gen thụ thể prolactin dừng lại mức xác định mối tƣơng quan diện gen thụ thể prolactin với tăng suất sinh sản tăng trọng thể heo không xác định rõ chế gen lên tăng suất sinh sản hay tăng trọng thể Có nhiều giả thuyết cho xuất gen kèm theo xuất gen khác kiểm sốt tính trạng suất heo (Vincent, 1998) Ở heo gen PRLR đƣợc định vị nhiễm sắc thể 16 Gen liên kết chặt chẽ với ba marker nằm locus: S0006 (LOD – 10,29), GHR (6,35), S0077 (3,23) Để xác định đƣợc tính đa hình gen PRLR, Vincent cộng dùng kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism) Trƣớc đó, ơng dùng kỹ thuật PCR để phân lập đoạn DNA gen PRLR, sau dùng enzyme AluI phân cắt đoạn DNA Với cách ơng xác định đƣợc kích thƣớc băng cắt DNA nhƣ sau: 124, 110, 90, 79 77, 67, 20 bp Trong đó, băng 110 90 bp đƣợc xác định đa hình Những sản phẩm PCR có diện băng 90 bp đƣợc xác định alen A, băng 110 bp đƣợc xác định alen B Gen PRLR có tính đa hình cao Ở dịng heo khác xử lý enzyme AluI gen PRLR đoạn cắt có nhiều kích thƣớc khác Hai alen A B tạo thành kiểu gen AA, AB, BB Trong ba kiểu gen giống heo Large White, Meishan, Landrace kiểu gen AA có suất sinh sản cao hơn, trọng lƣợng heo sinh đồng số ổ đẻ nhiều kiểu gen AB, BB Theo kết nghiên cứu Võ Thị Tuyết cộng (2005) giống heo Yorkshire kiểu gen AA có tiềm số đẻ cao kiểu gen AB, BB Tất kết 7865955 ... MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH CÁC KIỂU GEN THỤ THỂ PROLACTIN TRÊN MỘT SỐ GIỐNG HEO CÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng... nhiều gen kiểm sốt, có liên kết gen, sử dụng kỹ thuật RFLP để xác định quan hệ gen Đây kỹ thụ? ?t xác định 17 phân li di truyền số tính trạng theo qui luật Mendel Ví dụ nhƣ kiểm tra gen xác định. .. màng 18 2.8.4 Gen thụ thể prolactin Cùng với phát gen thụ thể estrogen, gen halothan Ngƣời ta phát gen thụ thể prolactin Gen đƣợc nghiên cứu nhƣ gen dự tuyển công tác chọn giống dòng heo: Large