Nghiên cứu quy trình sản xuất vật liệu sinh học nhằm cải tạo thảm cỏ làm tiểu cảnh cho khuôn viên

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THANH NHÀN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẬT LIỆU SINH HỌC NHẰM TÁI TẠO THẢM CỎ LÀM TIỂU CẢNH CHO KHUÔN VIÊN Chuyên ngành: Khoa học môi trường Mã số: 60 44 03 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thanh Nhàn 2 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc giáo TS Nguyễn Thị Minh tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Môi trường – Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thanh Nhàn 3 MỤC LỤC 4 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt CT ĐC VLSH VSV Nghĩa tiếng Việt Công thức Đối chứng Vật liệu sinh học Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG 6 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Arbuscular Mycorhizae loài nấm rễ nội cộng sinh rễ mang lại nhiều lợi ích cho chủ làm tăng sinh trưởng phát triển trồng tăng cường hấp thụ chất dinh dưỡng nâng cao khả chống chịu với điều kiện bất lợi mơi trường Vi khuẩn Rhizobium lồi sống cộng sinh với họ đậu hay điền thanh, lục lạc trịn,… có khả cố định Nitơ cung cấp cho phát triển trồng cải thiện tính chất đất Đề tài lợi dụng đặc tính nấm rễ Rhizobium vào sản xuất vật liệu sinh học, sâu vào nghiên cứu khả khai thác tối đa hiệu hiệp đồng Arbuscular Mycorrhizae Rhizobium để giúp tái tạo nhanh cho thảm thực vật nói chung, thảm cỏ nói riêng khn viên đồng thời cải tạo đất Mục đích đề tài bước đầu xây dựng quy trình sản xuất VLSH dùng cho tái tạo thảm thực vật thử nghiệm tái tạo thảm thực vật tạo cảnh quan cho khuôn viên để tiến tới chuyển giao quy trình cơng nghệ ứng dụng thực tiễn Trên sở 13 chủng AM phân lập từ loại đất khác nhau, giống AM Gigaspora sp6 Dentiscutata nigra với hoạt tính sinh học cao khả cộng sinh chủ tuyển chọn để sản xuất VLSH Cây đậu xanh cỏ đuôi phụng lựa chọn làm chủ để nhân giống nấm rễ có thời gian sinh trưởng ngắn, rễ phát triển nhanh khỏe mạnh, có khả tạo sinh khối lớn thời gian ngắn phù hợp nấm rễ phát triển nhân sinh khối nhanh chóng Từ 24 chủng Rhizobium phân lập đất phù sa sông Hồng, giống Bradyrhizobium japonicum Shinorhizobium fredii có đặc tính sinh học cao (thích ứng nhiệt độ pH rộng, kháng kháng sinh cao) tuyển chọn làm giống để sản xuất vật liệu sinh học Chất cho VLSH lựa chọn đất phù sa cũ có điều kiện thích hợp cho AM Rhizobium sinh trưởng phát triển, phân bón NPK 15-0-15 bổ sung vào VLSH với tỷ lệ 15g/kg vật liệu có tác dụng kích thích nảy mầm phát triển sợi nấm rễ AM Rhizobium Quy trình sản xuất vật liệu xây dựng gồm bước chính: (i) Chọn nhân giống AM Rhizobium, (ii) xử lý chất nền, (iii) bổ sung dinh dưỡng, (iv) thêm hạt giống (nếu trồng hạt), (v) phối trộn kiểm tra chất lượng trước sử dụng Kiểm tra cho thấy vật liệu sinh học có chất lượng ln ổn định phát huy hiệu sử dụng sau tháng sản xuất 7 Vật liệu sinh học thử nghiệm cỏ lạc cảnh (Arachis pintoi) khu thí nghiệm khoa Mơi trường Theo dõi sau tuần thử nghiệm thấy rõ chênh lệch mức độ sinh trưởng phát triển trồng mức sai số có ý nghĩa cơng thức thí nghiệm Ở cơng thức sử dụng VLSH, cỏ sinh trưởng nhanh, trọng lượng thân, trọng lượng rễ mức độ xâm nhiễm rễ số bào tử cao hẳn so với cỏ công thức đối chứng, đặc biệt tiêu sinh trưởng rễ: Chiều dài rễ gấp 1,76 lần; Trọng lượng rễ gấp 3,64 lần; Mức độ xâm nhiễm rễ gấp 9,35 lần; Số lượng bào tử gấp 7,91 lần; Số lượng nốt sần gấp 3,03 lần so với công thức đối chứng Bên cạnh đó, tỷ lệ che phủ cơng thức VLSH cao hẳn so với đối chứng Điều chứng tỏ, bước đầu VLSH phát huy tính tích cực theo giả thuyết ban đầu, đem lại sinh trưởng phát triển tốt cho trồng Hơn nữa, so sánh số đánh giá chất lượng đất trước sau thí nghiệm nhận thấy VLSH làm cho tính chất đất chuyển biến nhẹ theo chiều hướng tốt Kết sử dụng VLSH mở triển vọng ứng dựng quy trình sản xuất VLSH vào thực tiễn với quy mô lớn nhằm đem lại hiệu cao việc tái tạo thảm thực vật, tăng cường độ che phủ cải tạo tính chất đất, 8 THESIS ABSTRACT Arbuscular mycorrhizal (AM) is an endosymbiotic fungi in plant roots brings many benefits to the host plants as increasing the growth and development of planting crops by enhancing the absorption of nutrients and improving the resistance to the adverse conditions of the environment Rhizobium is a symbiosis species with legumes or Fabaceae plants (Sesbania sesban, Crotalaria pallida Aiton, ) with ability in nitrogen fixing and providing for plant growth and improving soil properties This subject aim is to use those advantage of mycorrhizal fungi and Rhizobium in the production of biological materials, research deeply on the capabilities of maximize exploiting the synergistic effect of AM and Rhizobium leading to restore faster for revegetaion in general and grass greenery in particular, at the same time to land reclamation The purpose of this research is preliminary constructing the production process of biomaterial for revegetation and testing in revegetation grass which could make landscape, forward to transfer technology process in the practical application Based on 13 AM strains were isolated from different soil types, AM strains (Gigaspora SP6 and Dentiscutata nigra) with high biological activities and symbiotic capabilities on host plants have been selected to produce biomaterial The green bean and Calathea lancifolia plants were chosen as hosts for propagation mycorrhizal fungi by growth time short, root develop fast and strong, capable of producing large biomass in a short time and suitable for AM symbiosis From 24 Rhizobium strains isolated on alluvial soils of Red river, strains (Bradyrhizobium japonicum and Shinorhizobium fredii) with highest biological activities (adaptive wide temperature and pH, high antibiotic resistance) were selected as species for biomaterial production Main substrate for biomaterial was chosen as the old alluvial soil due to it including the conditions suitable for AM and Rhizobium growth and development, NPK 15-0-15 be added at a rate of 15g/kg, give effect in stimulating the germination and growth of AM mycelium and Rhizobium The production process of biomaterial is constructed consisting of main steps: (i) Select, propagation AM and Rhizobium, (ii) substrate treatment, (iii) nutritional supplements, (iv) adding seeds (if planted by seeds) and (v) mixing and quality checking before using Results showed that biomaterial have stable quality and still give efficient after months production 9 Biomaterials are tested on scene peanut plants (Arachis pintoi) in the experimental station of faculty of Environment There was clearly difference in the growth and development of plants after weeks observation at significant levels among treatments In the treatment using biomaterial, grass grow and develop fast, the stem weight, root weight and root colonization level and spores number significantly higher than in the control, especially in the root growth parameters: root length in biomaterial treatment was higher 1.76 times; root weight was higher 3.64 times; The colonization rate was higher 9.35 times; The spores number was higher 7.91 times; The nodule number was higher 3.03 times compared to control treatment Besides, the covered rate in the biomaterial treatment was also much higher compared to the control Those results prove that biomaterial has been promoting positive according to the initial hypothesis, bringing the growth and development of crops better Furthermore, the results of quality soil before and after the tested experiment suggested that biomaterial given slight changes in soil properties in a good way Results using biomaterial opens up promising applying the biomaterial production processes into practice on a large scale in order to bring highly effective in revegetation, increasing covered rate and improving soil properties, 10 10 Căn vào kết cấu sợi nấm có vách ngăn vịi hút, người ta chia loại khơng có vách ngăn có vách ngăn (Trần Văn Mão, 2011; Trần Thị Dạ Thảo, 2007) + Ectoendmycorrhizae Là loài nấm Mycorrhizae nội ngoại cộng sinh có đặc trưng loại Ectomycorrhizae Endomycorrhizae (Trần Văn Mão, 2011; Trần Thị Dạ Thảo, 2007) 2.4.2 Nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhizae (AM) Nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhizae (AM) cộng sinh thực vật phân hóa thành dạng cấu trúc khác bao gồm: - Cấu trúc rễ ngăn: + Sợi nấm (Hypha): Khơng có vách ngăn cịn non đâm nhánh bên lớp vỏ rễ hình thành nên cấu trúc bụi túi + Bụi (Arbuscule): Phân nhánh ngoằn nghèo tế bào vỏ + Túi (Vesicles): Là cấu trúc dự trữ dinh dưỡng cho nấm - Cấu trúc đất: Bào tử sợi nấm: + Bào tử: Vơ tính, hình cầu lớn (đường kính: 20 – 1000µm) tạo thành từ sợi nấm đất rễ + Sợi nấm: Mạng lưới sợi nấm đất có hình dạng sợi mỏng, chức ống dẫn để hấp thu chất dinh dưỡng Trong đó: + Bào tử: Là chỗ phình to lên sợi nấm, bào tử hình thành dinh dưỡng cạn kết hợp nấm chủ bị già yếu Bào tử chứa đựng lipid, tế bào chất nhiều nucleid + Sợi nấm: Sự kết hợp Mycorrhiza bắt đầu nảy mầm bào tử có diện rễ Sợi nấm có khả phát triển giới hạn, chúng chết sau vài tuần nảy mầm mà không gặp rễ ký chủ Chúng có nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng làm gia tăng kết hợp với rễ hình thành bào tử nấm Bụi: Bụi phân nhánh phức tạp hình thành bên tế bào vỏ rễ Bụi hình thành từ chia đôi nhánh nén bề rộng sợi nấm, thân sợi nấm (đường kính: 5-10µm) kết thúc phát triển mạnh cành nhánh sợi nấm (đường kính 1µm) Bụi xem vị trí chủ đạo để trao đổi dinh dưỡng nấm chủ 23 23 Túi: Túi phát triển để tích lũy sản phẩm dự trữ nhiều loại VAM Túi chỗ phình to lên sợi nấm tế bào vỏ rễ, chứa lipid tế bào chất Túi nằm ngồi gian bào Túi có chức yếu tố lan truyền giống (Trần Văn Mão, 2011; Trần Thị Dạ Thảo, 2007) - 2.4.3 Mối quan hệ cộng sinh AM chủ Cơ chế cộng sinh AM chủ: Trong dạng cộng sinh AM, sợi nấm xâm nhập vào tế bào vỏ rễ, phát triển bên tế bào hình thành cấu trúc dạng bụi (arbuscules) hay dạng bọng (vesicules) Cấu trúc Arbuscules cành nhánh sợi nấm bao gọn bên huyết tương tế bào nguyên vẹn chủ làm tăng bề mặt tiếp xúc sợi nấm nguyên sinh chất tế bào rễ giúp cho việc trao đổi dinh dưỡng nấm thực vật trở nên hiệu (Nancy clooins Jonhnson, 2007) Mối quan hệ tương hỗ cung cấp cho nấm lượng cacbon đáng kể glucoza, saccaroza tạo từ trình quang hợp Cacbonhydrat chuyển từ đến rễ sau đến hệ thống sợi nội bào nấm liên kết chặt chẽ với tế bào rễ Ngược lại, nhận nhiều khoáng chất nước từ hệ sợi lan tỏa nấm đất Hệ sợi xâm nhập bên đâm nhánh ngồi phát triển dài dọc theo bề mặt rễ hình thành thêm nhiều điểm xâm nhập vào rễ Chúng phát triển vào sợi đất, sợi nấm kết hạt đất lại Smith (1990) chiều dài sợi nấm phát triển đất ước lượng trung bình khoảng 1m sợi nấm 1cm rễ Mạng lưới sợi nấm mở rộng hàng nghìn centimet bên từ bề mặt rễ cây, qua khu vực cạn kiệt dinh dưỡng cho rễ hấp thu khoáng linh động từ đất cung cấp cho trồng (Smith, 1990) - Vai trò chủ nấm rễ: Chủ yếu nấm rễ lấy nguồn dinh dưỡng Cacbon từ chủ để sinh trưởng phát triển Bên cạnh đó, rễ giá đỡ để bào tử nấm rễ cộng sinh với trồng (Trần Văn Mão, 2011; Geogre E, 1995) - Vai trò nấm rễ: Nấm rễ có vai trị quan trọng đời sống thực vật cạn, chúng có vai trị thực tiễn kinh tế, khoa học chu trình vật chất, lượng tự nhiên (Brudrett MC, 2012) + Mở rộng diện tích hấp thu rễ cây: Sợi nấm cộng sinh quan hấp thu chủ yếu rễ thực vật, nấm rễ làm tăng diện tích bề mặt hấp thụ rễ từ 24 24 10 – 100 lần, cải thiện đáng kể khả tận dụng dinh dưỡng từ đất tăng khả hòa tan chất P, Fe để hấp thụ Quá trình lấy dinh dưỡng trồng dễ dàng khơng địi hỏi nhiều phân bón Nấm rễ tạo thành mạng lưới phức tạp để huy động chất dinh dưỡng Trong điều kiện khơng có nấm rễ, dinh dưỡng bị khỏi đất bị rửa trôi (Sefi, 2010) + Hình thành chất kích thích sinh trưởng: Trong q trình cộng sinh với rễ cây, nấm rễ hình thành nhiều chất kích thích sinh trưởng Auxin, Cytokinin, Gibberelin, Vitamin B1, IAA (Trần Văn Mão, 1999) + Tăng khả hấp thu dinh dưỡng: Sự gia tăng số lượng sợi nấm đất giúp rễ hấp thu dinh dưỡng tốt hơn, mà làm gia tăng khả hấp thu dinh dưỡng bị cố định, đặc biệt Photpho (P) – nguyên tố quan trọng trồng, có nhiều đất dạng khó hấp thu Trong đất có lượng P định, gốc Photphat khó di động, kết hợp với ion Fe, Al, Na cố định đất tạo thành P không tan, trồng không hấp thụ được, số P không hấp thụ chiếm 90 – 95%, có lượng P hịa tan sử dụng Nấm rễ sản sinh enzim photphotaza chuyển P không tan thành P hịa tan giúp trồng dễ dàng sử dụng (Zaki, 2008) Đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng phân bón đến hoạt động AM chủ Tiêu biểu năm 1995, Geogre cộng công bố nghiên cứu cần thiết photpho loại nấm cộng sinh Năm 2001, nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm độ phì nhiêu đất đến phân bố AMF, Augree (2001) nhận thấy: Mức độ đa dạng AMF tỷ lệ thuận với phần trăm lượng chất hữu tỷ lệ nghịch với hàm lượng Ca, Mg P đất Số lượng bào tử tăng đồng thời với mức tăng hàm lượng chất hữu N đất, giảm hàm lượng Ca, Mg P cao + Phương tiện quan trọng làm nhiệm vụ vận chuyển cacbon vào đất nấm rễ Theo nhà khoa học đất người Úc Christine Jones, lồi có nấm rễ vận chuyển nhiều cacbon vào đất 15% so với lồi khơng có nấm rễ Nấm rễ xâm nhập vào đất tốt so với rễ sợi chúng mỏng rễ Quan trọng hơn, nấm rễ có khả sản xuất raglomalin – chất đặc biệt giúp đất trì cấu trúc giữ cacbon đất khỏi bị phân hủy thời gian dài 25 25 + Nâng cao sức chống chịu cây: Cùng với gia tăng hấp thụ dinh dưỡng, sợi nấm cho phép gia tăng hấp thu nước Hơn mạng lưới sợi nấm rộng rãi ngăn chặn công bệnh hại đến rễ, gia tăng chống chịu hạn dịch hại Bên cạnh đó, AM làm giảm bớt tác hại kim loại nặng gây ra, nấm AM tập hợp kim loại vùng rễ lại làm thay đổi khả hấp thu kim loại trồng Khi trồng rừng núi đá vôi, tỷ lệ sống nhiễm nấm cộng sinh tăng 14% điều kiện khô hạn tuyệt đối Khả chống chịu điều kiện khác tăng chống mặn, nhiệt độ, độ ẩm, pH cực đoan, (Trần Văn Mão, 1999) + Tăng khả kháng bệnh trồng: Bệnh thực vật kiểm sốt thuốc đối kháng làm giảm mầm bệnh Nấm AM tương tác cộng sinh chúng với thảm thực vật làm giảm bớt thiệt hại gây tác nhân gây bệnh (Harier L.A and Watson C.A, 2004) + Cải thiện cấu trúc đất: Sợi nấm rễ nội cộng sinh chứng minh thải chất đường dính keo, gọi “Glomaline”, giúp hạt đất kết lại với làm cấu trúc đất cải thiện Bên cạnh đó, tiết axit mùn làm cho đất tơi xốp Sự diện Mycorrhizae làm tăng tính đa dạng mật độ VSV đất, tạo nên hệ sinh thái đất khỏe mạnh Hệ sinh thái đất khỏe mạnh tất điều kiện để trồng gia tăng chu trình dưỡng chất, gia tăng mối liên hệ khơng khí nước quan trọng kháng lại xâm nhập thành lập vi sinh vật có hại 2.4.4 Sự phản hồi trồng với nấm rễ nội cộng sinh Nhiều tác giả nghiên cứu chuyên sâu nấm rễ AM cho thấy hầu hết trồng tăng suất sau nhiễm nấm AM (Jakobsen and Nielsen, 1983; Baon et al., 1992; Talukda av Germida, 1994; Xavier and Geermida, 1997; Alkaraki et al., 1998), đặc biệt đất có nguồn photpho thấp (Thoson, 1990; Rubio et al., 2003) Kết nghiên cứu ảnh hưởng nấm rễ AM đến giống dưa chuột (Cucumis sativus L, 2010) cho thấy: AM có ảnh hưởng đáng kể đến đường kính gốc cây, số lá, chiều cao chiều dài rễ AM khơng có nhiều tác dụng đến tỷ lệ nảy mầm hạt giống mà có ảnh hưởng đến thời gian nảy mầm hạt Với công thức tiêm chủng Gigaspora margarrita, dưa chuột mọc sớm đối chứng mọc muộn (Sefi, 2010) 26 26 Khi nghiên cứu ảnh hưởng nấm rễ AM đến sinh trưởng Piper longum L – thuộc họ tiêu, P.Gogoi and R.K.Singh (2011) nhận thấy tất chủng AM gia tăng tăng trưởng thực vật, sinh khối hàm lượng dinh dưỡng (N P) Chiều dài chồi đạt cao công thức nhiễm Gigaspora fasicutalum, tổng sinh khối nhiễm Gigaspora fasicutalum đạt cao 0,84g tổng sinh khối đối chứng đạt 0,23g (P.Gogoi and R.K.Singh, 2011) 2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CỦA NẤM RỄ VÀ VẬT LIỆU SINH HỌC TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.5.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng AM vật liệu sinh học giới Nấm rễ nội cộng sinh AM, mối quan hệ cộng sinh trồng nấm từ đất có vai trò đặc biệt quan trọng sức sản xuất cây, sinh thái học đất đóng vai trị then chốt thuật ngữ “Nơng nghiệp bền vững” Mối quan hệ cộng sinh nhận nhiều quan tâm tăng khả ứng dụng chúng thực tế đồng ruộng đa dạng sinh học, nơng nghiệp bền vững, chương trình tái tạo rừng quản lý hệ sinh thái (Gianinazzi S, 1994) - Ứng dụng nông nghiệp: Nấm rễ, đặc biệt AM phổ biến đất tạo mối quan hệ cộng sinh với hầu hết thực vật cạn bao gồm trồng nông nghiệp, ngũ cốc, rau vườm ươm Có tới 80% loại trồng tự nhiên hình thành cộng đồng nấm rễ Do vậy, ứng dụng nấm rễ AM xu hướng phổ biến nông nghiệp (Brundrett MC, 2002) Nấm rễ thường xử lý cho hạt giống trước gieo trồng với nhiều loại nông nghiệp (lúa, lúa mỳ, ngô, khoai, đậu tương, cỏ linh lăng ) giúp tăng cường khả sinh trưởng, phát triển cây, tăng khả kháng sâu bệnh dẫn tới suất chất lượng trồng tăng lên (M.A.U Mridha, 2003) Ở nước Indonesia, Malaysia, Ấn Độ phổ biến đưa nấm rễ vào quy trình trồng tiêu, cao su, cà phê, cọ dầu, loại ăn lâm nghiệp từ vườn ươm trưởng thành - Ứng dụng tái tạo rừng quản lý hệ sinh thái: Nghiên cứu nấm rễ AM trở thành lĩnh vực quan trọng ngành khoa học môi trường đại, từ khía cạnh để ứng dụng 27 27 lâm nghiệp phục hồi hệ sinh thái có hoạt động khai thác bề mặt tạo khu vực lớn đất bị xáo trộn nhiều nơi giới có nhu cầu cấp thiết cần cải tạo lại đất tái tạo hệ thống trồng vùng đất bị suy thoái Phục hồi sinh thái trình hỗ trợ cải tạo hệ sinh thái bị xáo trộn, bị suy thoái phá hủy Vai trò việc sử dụng nấm rễ tái tạo thảm thực vật nhằm mục đích thiết lập hệ sinh thái bền vững nghiên cứu rộng rãi hiệu chúng chứng minh Tại Banglades, đất rừng thường đất nghèo photpho chất dinh dưỡng khác tồn P dạng linh động tương tự đất nhiệt đới khác Trong điều kiện vậy, công nghệ nấm rễ ứng dụng xử lý cho giai đoạn phát triển vườm ươm có tác dụng nâng cao phát triển tổng thể vườm ươm tăng trưởng sớm sau chuyển đất rừng (M.A.U Mridha, 2003) Việc quản lý nấm rễ AM việc tái tạo thảm thực vật tái tạo rừng ghi nhận thành công (Takhuya Marumoto and Zakuo Yamato, 2011), (Zaki Anwar Siddidui, 2008) Tại Nhật Bản, GS Marumoto cộng nghiên cứu thành cơng phủ sinh học chống xói mịn đất tái tạo thảm thực vât nhờ vai trò nấm rễ Vật liệu tái tạo thảm thực vật rừng, phục hồi cảnh quan nhiều vùng đất bị phá hủy Nhật Bản, điển phủ xanh sườn dốc Fhugendake thuộc quận Nagasaki, quận Hiroshima, tạo cảnh quan cho đường cao tốc quận Yamaguchi, cảnh quan cho khu vực sông quận Fukusima hay cho đập thủy điện quận Hirosima (Takhuya Marumoto and Zakuo Yamato, 2011) - Ứng dụng tái tạo thảm cỏ: Mục tiêu bảo trì bãi cỏ sân golf đảm bảo có giữ phát triển đồng cỏ với màu sắc tươi tránh nguồn bệnh ảnh hưởng tới sức khỏe người Để quản lý bãi cỏ cách chất lượng, cần có phương pháp phù hợp giải pháp sinh học quan tâm Sự cộng sinh nấm rễ giải vấn đề nhờ vai trò nấm rễ việc hấp thụ chuyển hóa chất dinh dưỡng cho cỏ, cải thiện khả hút nước cho cỏ nhờ phát triển hệ rễ giúp tăng cường chống chịu điều kiện khô hạn Dự thảo Mike Amarathus 27/09/2011 đưa công nghệ ứng dụng nấm rễ xử lý cho cỏ Bermuda để xây dựng bảo trì sân 28 28 golf Califonia Oregon (Mỹ) giúp cải thiện, tăng cường phát triển sức đề kháng cỏ sân golf, biện pháp quản lý sân golf để cải thiện tình trạng sân golf đất Nhờ bảo vệ cấu trúc đất, giảm thời gian chi phí cho cơng việc bảo trì, giảm lượng phân bón nước tưới sử dụng, đồng thời nâng cấp sân golf chống hạn hán Công nghệ xử lý nấm rễ áp dụng rộng rãi việc cải tạo nhiều bãi cỏ thành công nhiều nơi Real Club de Golfde Sotogrande, Club de Golf El Zaudin (Seville) La Cala Golf Tây Ban Nha hay bãi cỏ Vale Lobo Golf Bồ Đào Nha (Mycosym.com) 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm rễ vật liệu sinh học Việt Nam Trong năm gần đây, nhà khoa học Việt Nam bắt đầu quan tâm tiến hành nghiên cứu nấm rễ Mycorrhizae khả ứng dụng chúng sản xuất nông, lâm nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam tiến hành phân lập nấm nội cộng sinh đất vườn ươm cộng sinh với số loài gỗ địa đen, dái ngựa, dẻ cau lim xanh Kết phân lập bước đầu cho thấy loại khác mật độ bào tử nấm nội cộng sinh thành phần loài nấm cộng sinh tồn đất khác Cây chủ đóng vai trị định tồn phát triển loài nấm nội cộng sinh Mật độ nấm tập trung nhiều tầng đất mặt có độ sâu – 10 cm, xuống sâu mật độ giảm rõ rệt Kết khẳng định tiềm nấm nội cộng sinh đất lớn (Nguyễn Thị Hoàng Yến cs., 2005) Nghiên cứu Nguyễn Thị Minh (2005, 2007, 2014) tiến hành phân lập AM số thực vật đất phù sa sông Hồng đất bạc màu gồm loại họ đậu, họ hòa thảo, ăn quả, họ cúc thu giống nấm rễ có sức sống khả cộng sinh cao Các nghiên cứu khẳng định, cộng sinh nấm rễ chủ giúp cho có sức sống cao hơn, có khả chống chịu cao với điều kiện bất lợi môi trường sống, giúp tái tạo thành công thảm thực vật Phan Quốc Hưng cs (2010) sử dụng nấm rễ loại sinh vật kết hợp với thực vật để xử lý đất nông nghiệp bị ô nhiễm kim loại nặng khả chống chịu chuyển hoá khoáng chất cao nấm rễ đất giúp tăng cường khả hấp thụ cho lấy 29 29 Trần Thị Dạ Thảo (2007) nghiên cứu nấm rễ ngô Kết nghiên cứu cho thấy nấm rễ có khả lớn việc tiết kiệm nước tưới, tăng hấp thu dinh dưỡng tăng suất trồng Khi khơng có nấm mơi trường đất sinh trưởng yếu, chiều cao thấp, diện tích nhỏ, chậm lão hóa, có nấm sinh trưởng tốt hơn; Giữ lân mức 100 mg P2O5/1kg đất kết hợp với chủng nấm Glomus sp Điều có ý nghĩa việc giảm lượng phân bón cho trồng sản xuất Công ty Thời Đại Xanh Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm sinh học với thành phần chính: Nấm Mycorrhizae 250 – 300 bào tử/ 10g với công dụng giúp cho Mycorrhizae phát triển cộng sinh rễ thúc đẩy rễ tăng trưởng nhanh mạnh, hấp thu đầy đủ dinh dưỡng khoáng nước làm cho kháng lại bệnh rễ, chống chịu điều kiện bất lợi cho đất chua, mặn khơ hạn Có thể áp dụng cho tất loại trồng Bón trực tiếp vào rễ giai đoạn hay làm nguyên liệu phối hợp với phân hữu vi sinh khác Nguyễn Minh Châu Lê Quốc Huy (Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Viện khoa học Lâm nghiệp) tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang, thử nghiệm số dung dịch bảo quản chế phẩm đánh giá hiệu cộng sinh chế phẩm dạng viên nang với đen vườn ươm đồng ruộng Kết nghiên cứu cho thấy, chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang tạo với tỷ lệ đồng vật liệu kích cỡ viên (0,2 – 0,3), suất 1g sinh khối sợi nấm tinh khiết sản xuất 100g chế phẩm ECM viên nang kỹ thuật “tạo viên nang” dung dịch CaCl2 0,1M Chế phẩm nấm rễ ECM sản xuất dạng viên nang có nhiều ưu điểm dạng khác Sợi nấm bọc thể keo alginate nên có khả tránh công vi sinh vật khác (Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 2007) Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng nấm rễ cộng sinh chưa thực triển khai rộng rãi Việt Nam, đặc biệt nghiên cứu nhằm mục đích tái tạo thảm thực vật làm đẹp cho cảnh quan đô thị nhờ vật liệu sinh học sản xuất từ nấm rễ 2.6 VI KHUẨN NỐT SẦN RHIZOBIUM 2.6.1 Một vài đặc điểm Rhizobium Vi khuẩn Rhizobium có đất, xâm nhiễm vào rễ họ đậu tạo thành nốt sần nên gọi vi khuẩn nốt sần Vi khuẩn Rhizobium thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, có dạng hình que, kích thước 0,5 – 0,9 x 1,2 – µm Khi cịn non có 30 30 khả di động nhờ tiên mao, không sinh bào tử sinh sản cách phân bào Dựa vào tốc độ phát triển môi trường đặc nhân tạo, người chia vi khuẩn nốt sần thành hai nhóm chính: + Nhóm axit hóa mơi trường: Nhóm vi khuẩn q trình sinh trưởng phát triển sản sinh chất làm giảm pH mơi trường như: Shinorhizobium fredii… + Nhóm kiềm hóa mơi trường: Nhóm vi khuẩn q trình sinh trưởng phát triển sản sinh chất làm tăng pH môi trường như: Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium vigna… Vi khuẩn Rhizobium đồng hóa photpho, kali, canxi nguyên tố khác từ hợp chất vô hữu Trong vùng rễ họ đậu, gặp điều kiện thuận lợi vi khuẩn Rhizobium sinh sản nhanh Chúng tiết số hoạt chất làm mềm lớp biểu bì lơng hút, sau xâm nhập vào kẽ nốt lơng hút biểu bì tiếp tục phát triển tạo thành “sợi xâm nhiễm” Lông hút quăn lại, sợi xâm nhiễm ăn sâu vào vỏ rễ, kích thích vỏ rễ phát triển tạo lớp mơ phân sinh để từ hình thành vỏ nốt sần Bên nốt sần hình thành hệ thống mạch dẫn vận chuyển chất dinh dưỡng đến nốt sần đưa đạm từ trình cộng sinh cố định nitơ khí đến phận (Ngơ Thế Dân cs.) 2.6.2 Tình hình sản xuất sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần giới Việt Nam Ở Mỹ, năm 1895 lần người ta sản xuất nitragin – phân vi sinh từ vi khuẩn nốt sần để đưa vào ứng dụng nông nghiệp Số lượng phân vi khuẩn nốt sần sản xuất Mỹ năm xử lý cho 650 nghìn hạt giống họ đậu (Erdman, 1962) Năm 1968, 70% diện tích trồng đậu xử lý chế phẩm vi sinh vật cố định đạm Thái Lan nước sử dụng phân bón vi khuẩn nốt sần nhiều Đơng Nam Á Theo đó, số lượng chế phẩm vi khuẩn nốt sần sử dụng Thái Lan tăng từ 3,36 tấn/năm 1995 lên đến 203,28 tấn/ năm 1997 Ở Việt Nam, phân bón vi sinh cố định đạm nghiên cứu từ năm 1960 phải đến năm 1980 đem vào thử nghiệm cho đậu tương chế phẩm Vinaga, Rhidafo cho lạc trường đại học Cần Thơ Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam phối hợp với đại học Nông Nghiệp I Hà Nội, đại học Tổng hợp Hà Nội, sản xuất chế phẩm nitragin bón cho lạc, đậu tương 31 31 đem lại kết khả quan Đến năm 1987, quy trình sản xuất nitragin chất mang than bùn hồn thiện chương trình 52B-01-03 Tuy nhiên, thực tế việc sản xuất chế phẩm phân bón vi khuẩn nốt sần nhiều hạn chế như: chưa có nhà máy sản xuất chế phẩm với quy mô lớn để ứng dụng nông nghiệp đại trà… Chi Cỏ ba (danh pháp khoa học: trifolium) chi 300 loài thực vật họ đậu Chúng chủ yếu sinh sống khu vực ôn đới Bắc bán cầu, giống nhiều chi khác khu vực ôn đới, chúng sống khu vực miền núi thuộc miền nhiệt đới Các loại thân thảo sống năm lâu năm có ba chét (rất có hay chét) với kèm hợp sinh cuống cụm hoa có màu đỏ, tím, trắng (rất hoa màu vàng), hạt nhỏ che phủ đài hoa Cỏ ba (với danh pháp khoa học: Trifolium) thức ăn có giá trị, hàm lượng protein cao, phổ biến phong phú Ở dạng tươi, chúng khó tiêu hóa, ăn sau luộc 5-10 phút Hoa khơ hạt chế biến thành bột có giá trị dinh dưỡng trộn lẫn với thức ăn khác Hoa khơ sử dụng chè Cây đậu mèo (Mucuna prurient thuộc họ đậu Febaceae) có nguồn gốc nhiệt đới châu Phi châu Á Ở Việt Nam, đậu mèo địa phân bố tỉnh miền núi, đặc biệt từ Quảng Bình trở Cây có hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt protein, lipit, khoáng vitamin, có giá trị tương đương đậu tương Đa số giống đậu mèo đạt 40-50 quả/cây, 5-7 hạt/quả, 100-130 g/100 hạt, 400-500 g/cây có tiềm năng suất 2,0-3,0 tấn/ha điều kiện khô hạn Đặc biệt, kết nghiên cứu xác định giống có tiềm năng suất 3,36-5,0 tấn/ha Đây nguồn liệu quan trọng mục tiêu phát triển nguồn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi Việt Nam (Lê Khả Tường (2014) Tạp chí NN & PTNT Cỏ Đậu phụng, cỏ Lạc cảnh, cỏ Hoàng Lạc, Lạc dại.) 32 32 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm cỏ làm tiểu cảnh cho khuôn viên 3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Giống vi sinh vật: Nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular mycorrhizae vi khuẩn nốt sần Rhizobium - Thực vật: giống họ hòa thảo - Một số nguyên liệu dùng để làm nguyên liệu cho vật liệu sinh học: đất, than bùn, rơm rạ, phân rác 3.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Thời gian: từ tháng 01/2015 – tháng 11/2015 Địa điểm: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Cây cỏ: Cây lạc cảnh (Arachis pintoi) 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tuyển chọn giống Arbuscular mycorrhizae lựa chọn chủ để nhân giống dùng cho sản xuất - Tuyển chọn giống Rhizobium xác định điều kiện nhân sinh khối tối ưu - Xác định, lựa chọn xử lý chất để sản xuất vật liệu sinh học - Lựa chọn loại dinh dưỡng xác định tỷ lệ bổ sung vào vật liệu sinh học - Lựa chọn hạt giống để sản xuất vật liệu sinh học - Phối trộn vật liệu sinh học kiểm tra chất lượng vật liệu sinh học Các tiêu chất lượng (độ ẩm, pH, mật độ AM, hàm lượng dinh dưỡng chính) - Xây dựng quy trình sản xuất vật liệu sinh học gồm bước, trình tự chuẩn bị tỷ lệ phối trộn nguyên liệu tối ưu phù hợp với bước quy trình đảm bảo cho giống vi sinh vật hạt giống (hoặc con) sinh trưởng phát triển tốt đất nghèo dinh dưỡng - Đánh giá hiệu vật liệu sinh học thí nghiệm đồng ruộng 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 33 3.5.1 Phương pháp thu thập tài liệu thứ cấp Nghiên cứu tài liệu liên quan đến nguyên liệu công nghệ sản xuất vật liệu sinh học, giá thể, chất sử dụng từ kênh: - Báo, tạp chí khoa học; - Các website, thông tin từ internet; - Các ấn phầm nghiên cứu khoa học có liên quan; - Sách tư liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu 3.5.2 Phương pháp thu nhận bào tử từ vùng rễ trồng theo phương pháp sàng ướt cải tiến + Mẫu đất lấy vùng rễ độ sâu khoảng 15-20cm Cho mẫu đất hịa vào lít nước Khuấy đều, loại bỏ tàn dư thực vật, bóp nhỏ cục đất lớn Để lắng 20 giây đổ dung dịch qua sàng với kích cỡ lỗ từ xuống 1.000 µm, 500 µm, 200 µm, 100 µm, 50µm Q trình lặp lại lần Những thành phần lại sàng chuyển qua đĩa petri Dùng kính hiển vi soi để quan sát nhặt bào tử AM khỏi đĩa petri, bảo quản bào tử nước vô trùng 40C + Bào tử sau phân lập phân loại theo phương pháp hình thái học theo hệ thống Franke and Morton (1994); + Xác định hình dạng kích thước bào tử: Bảng so sánh Morton (1988); + Màu sắc bào tử xác định bảng màu chuẩn nhân tố CMYB (Cyan/Mageta/Yellow/Black) (theo INVAM); + Số lượng bào tử AM: Xác định phương pháp đo đếm trực tiếp (Brundett Mark cộng sự) 3.5.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn nốt sần Rhizobium Mẫu nghiên cứu lấy Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ họ đậu (lạc, đậu tương, điền thanh) họ hòa thảo (cỏ gừng, cỏ tranh, cỏ mần trầu) Đất vùng rễ lấy phạm vi 15-20 cm theo Phillip J.M Hayman D.S (1970) Với họ đậu, lấy nguyên rễ để thu nhận nốt sần Phân lập chủng giống vi khuẩn Rhizobium từ nốt sần họ đậu mơi trường chun tính (YMA) 34 34 3.5.4 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp giống Arbuscular mycorrhizae Đánh giá hoạt tính sinh học chủng giống AM theo phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp (tỷ lệ nảy mầm, phát triển hệ sợi trình sinh trưởng bào tử nấm rễ dung dịch chiết khả cộng sinh chủ) Dung dịch dinh dưỡng chiết theo tỷ lệ 1:10, phân vào ô hộp nuôi cấy plastic (2ml/ô) Bào tử Arbuscular mycorrhizae khử trùng bề mặt Chloramin T Streptomycin rửa nước vô trùng trước nuôi cấy dung dịch chiết (1 bào tử/ô, theo dõi 10 bào tử/giống) điều kiện tối 250C Sau 30 ngày nuôi cấy, xác định số lượng bào tử theo giai đoạn sinh trưởng khác nhau, phát triển hệ sợi nảy mầm bào tử nấm rễ (Nguyễn Thị Minh cs., 2005, 2014) Đặc tính đánh giá: - Theo dõi trình sinh trưởng bào tử theo cấp độ: + Giai đoạn ban đầu (Kiểu A): Chưa hình thành sợi + Giai đoạn (Kiểu B): Hình thành sợi ngắn + Giai đoạn phát triển (Kiểu C): Sợi nấm bắt đầu phân nhánh + Giai đoạn trưởng thành (Kiểu D): Sợi nấm phân nhiều nhánh, hình thành cấu trúc đặc trưng - Theo dõi tỷ lệ nảy mầm bào tử phát triển hệ sợi sau 30 ngày nuôi Tải FULL (74 trang): https://bit.ly/2U4NqFQ cấy theo mức phân hạng: Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net + Phát triển nhẹ (mức I): Bào tử phát triển vài sợi +Phát triển vừa phải (mức II): số lượng sợi nấm phát triển trung bình +Phát triển mạnh (mức III): sợi nấm sinh trưởng mạnh tới mức tối đa với nhiều cấu trúc đa dạng 3.5.5 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp giống Rhizobium Đánh giá hoạt tính sinh học chủng giống Rhizobium theo phương pháp nuôi cấy trực tiếp môi trường YMA điều kiện khác Giống Rhizobium phân loại dựa phản ứng đổi màu mơi trường YMA có chứa Bromothymol blue (20mg/l) khả axit hóa hay kiềm hóa mơi trường chủng giống Rhizobium sinh trưởng phát triển 35 35 (Saeki et al., 2005) Khả cộng sinh Rhizobium đánh giá thí nghiệm cát vô trùng bổ sung dinh dưỡng không nitơ đậu xanh với cây/chậu dịch vi khuẩn nhiễm vào hạt với 10ml dịch vi khuẩn/chậu Điều kiện nhân sinh khối tối ưu vi khuẩn Rhizobium xác định cách nuôi cấy trực tiếp mơi trường chun tính điều kiện khác nhau, xác định mật độ vi khuẩn hình thành 3.5.6 Đánh giá khả cộng sinh chủ lựa chọn chủ để nhân giống nấm rễ Khả cộng sinh chủng nấm rễ đánh giá thông qua việc xử lý AM chủ thí nghiệm chậu vại theo phương pháp Viencent (1976) Thí nghiệm bố trí với ba lần nhắc lại chậu đất vô trùng (100g) họ hòa thảo lựa chọn Hạt giống khử trùng dung dịch NaClO 10%, rửa nước cất cho nảy mầm giấy lọc ẩm đĩa petri vô trùng 25 0C Sau hạt nảy mầm rễ khoảng -3cm, đặt vào chậu đất vô trùng (3 cây/100g đất) Đất sàng qua rây 2mm khử trùng lần 80 0C nồi hấp trước sử dụng Bào tử AM nhiễm vào hệ rễ chủ với 10 bào tử/chậu Xác định tiêu sinh trưởng chủ thiết lập quan hệ cộng sinh nấm rễ sau 30 ngày xử lý nấm rễ 25 0C; 12h Tải FULL (74 trang): https://bit.ly/2U4NqFQ sáng/ngày Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net Các tiêu theo dõi gồm: chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng thân tươi, trọng lượng rễ tươi Tỷ lệ xâm nhiễm nấm rễ vào rễ chủ xác định theo phương pháp phóng đại ô giao McGonigle (1990) đếm số lượng bào tử tạo thành từ thí nghiệm chậu vại theo phương pháp sàng ướt cải tiến Rễ làm sạch, nhuộm Trypan blue sau đem soi kính hiển vi, tiêu đặt lam kính chia kích thước 1mm, đếm chiều dài rễ có cấu trúc AM tổng chiều dài rễ, sau tính phần trăm xâm nhiễm 3.5.7 Phương pháp phân tích tính chất (vật lý, hóa học, sinh học) chất Các tiêu (vi sinh vật, Cacbon hữu tổng số, Nitơ tổng số, Photpho tổng số, Kali tổng số, pHH20, độ ẩm) nguyên liệu lựa chọn làm chất 36 36 xác định phương pháp thơng dụng phịng thí nghiệm theo TCVN + Các tiêu vi sinh: xác định theo phương pháp pha lỗng Koch tính số lượng tế bào cách đếm số khuẩn lạc tạo thành ni cấy mơi trường chun tính bán rắn + Xác định Cacbon hữu tổng số: TCVN 6644:2000 – phương pháp Walkley & Black + Xác định Nitơ tổng số: TCVN 6498: 1999 – phương pháp Kjendahl + Xác định Photpho tổng số: TCVN 4052: 1985 – phương pháp so màu xanh Molipden + Xác định Kali tổng số TCVN 4053: 1985 – phương pháp quang kế lửa + Xác định pH: TCVN 4402: 1987 – đo pH + Xác định độ ẩm: TCVN 1867: 2001 – phương pháp sấy khô 3.5.8 Phương pháp xác định tỷ lệ nảy mầm hạt giống Hạt giống nảy mầm điều kiện vô trùng: lấy ngẫu nhiên loại hạt giống 100 hạt (lặp lại lần), khử trùng cồn etanol 95 phút, dung dịch NaHClO 5% phút (3 lần), rửa lại nhiều lần nước vô trùng, ngâm nước khoảng 600C Cuối cho nảy mầm giấy lọc ẩm đĩa petri vô trùng 250C, đặt tủ định ôn Tỷ lệ hạt nảy mầm = (số hạt nảy mầm/tổng số hạt đem gieo)× 100% Theo dõi nảy mầm hạt giống thời gian ngày với tiêu theo dõi thời gian nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm chiều dài rễ 3.5.9 Phương pháp đánh giá hiệu tái tạo thảm cỏ vật liệu sinh học - Thí nghiệm đồng ruộng đánh giá hiệu vật liệu sinh học với việc tái tạo thảm thực vật gồm công thức với lần lặp lại bố trí theo khối ngẫu nhiên, diện tích thí nghiệm 1m2 Trong đó: CT1 – Đối chứng (ĐC): gieo hạt bổ sung dinh dưỡng tương ứng có vật liệu sinh học CT2 – Vật liệu sinh học (VLSH): Gieo hạt bổ sung vật liệu sinh học (VLSH) 37 37 4218590 ... ? ?Nghiên cứu quy trình sản xuất vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm cỏ làm tiểu cảnh cho khuôn viên? ?? 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI • Xây dựng quy trình sản xuất vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm cỏ. .. thảm cỏ làm tiểu • cảnh cho khuôn viên Bước đầu đánh giá hiệu vật liệu sinh học tái tạo thảm cỏ làm tiểu cảnh 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - Vật liệu sinh học Vật liệu nghiên cứu -... phụng, cỏ Lạc cảnh, cỏ Hoàng Lạc, Lạc dại.) 32 32 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm cỏ làm tiểu cảnh cho khuôn viên 3.2 VẬT LIỆU