Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) là một loài nấm dược liệu quan trọng, từ lâu đã được sử dụng để điều trị nhiều bệnh và bồi bổ sức khỏe. Tuy nhiên, ở Việt Nam còn có ít công bố về nuôi cấy nấm C. militaris. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng, phát triển của chủng nấm C. militaris NBRC 100741 trên giá thể nhân tạo.
www.vanlongco.com Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 (Trang 55 -60) NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DINH DƯỠNG LÊN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG NẤM CORDYCEPS MILITARIS NBRC 100741 Phạm Văn Nhã1,*, Đỗ Hải Lan1, Phạm Thị Lan1, Nguyễn Thị Hồng Hạnh1, Bạc Thị Thu1, Bùi Thanh Tùng2 Khoa Sinh-Hóa, Đại học Tây Bắc; 2Khoa Y Dược, Đại Học Quốc gia Hà Nội *Email: phamvannhadhtb@gmail.com (Nhận ngày 12 tháng 10 năm 2016) Tóm tắt Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) loài nấm dược liệu quan trọng, từ lâu sử dụng để điều trị nhiều bệnh bồi bổ sức khỏe Tuy nhiên, Việt Nam cịn có cơng bố nuôi cấy nấm C militaris Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng đến trình sinh trưởng, phát triển chủng nấm C militaris NBRC 100741 giá thể nhân tạo Kết nghiên cứu cho thấy hệ sợi nấm sinh trưởng phát triển tốt môi trường PDA cải tiến chứa dịch chiết khoai tây (200 g/L)+ dextrose (20 g/L) + thạch (7 g/L) + pepton (2,5 g/L) + cao nấm men (2,5 g/L) Sau ngày nuôi cấy 250C, hệ sợi nấm cấy chuyển sang bình ni trồng 500 mL chứa gạo tám lứt (25 g), bột nhộng (20 g) vô trùng để tạo thể Từ khóa: Nhộng trùng thảo, Cordyceps militaris, Mơi trường ni cấy, Dinh dưỡng Summary Effects of Nutrition on Growth and Development of Cordyceps militaris NBRC 100741 Strain Cordyceps militaris is a highly valued medicinal fungus, used in traditional medicine to treat many diseases and improve health But in Vietnam, there is not much article referred to the effective culture protocol for Cordyceps militaris This study evaluated the effects of various nutritional components on growth and development of C militaris NBRC 100741 strain The results showed that suitable culture medium for the growth and development of the mycelia of C militaris NBRC 100741 containing potato extract (200g/L) + dextrose (20g/L) + agar (7g/L) + pepton (2.5g/L) + yeast extract (2.5g/L ) Cultures were maintained at a temperature of 250C After days of culture, they were transferred to culture bottles 500 mL containing autoclaved rice (25 g) and silkworm pupa powder (20 g) for cordyceps mushroom Keywords: Cordyceps militaris, Culture medium, Nutrition Đặt vấn đề Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) loài nấm dược liệu quan trọng, từ lâu sử dụng để điều trị nhiều bệnh bồi bổ sức khỏe [1] Theo y học cổ truyền, nấm nhộng trùng thảo có tác dụng điều hịa chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính thiểu sinh dục Ngồi ra, cịn dùng điều trị số bệnh rối loạn miễn dịch hỗ trợ điều trị ung thư [2] Với nhiều giá trị dược lý quan trọng nên việc nuôi trồng nhộng trùng thảo cần thiết Tuy nhiên, đến Việt Nam chưa có nhiều cơng bố ni cấy nấm nhộng trùng thảo cách hiệu Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 Nấm khơng có quan tiêu hóa quan quang hợp mà hấp thụ dinh dưỡng qua màng tế bào Nguồn carbon nấm loại hydrat carbon, dẫn xuất rượu acid hữu cơ; nhiều hợp chất bền độc với sinh vật khác lại nấm sử dụng alcaloid, phenol, nhiều loại kí sinh độc nấm phân giải Nấm sử dụng nitơ hữu vơ Ngồi ra, nguyên tố khoáng đa lượng (S, P, K, Ca, Mg, Fe…) vi lượng (Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni) cần cho trình sinh trưởng phát triển nấm [3],[4] Ngoài yếu tố dinh dưỡng, nhân tố môi trường nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng phát triển nấm Để đảm bảo sinh trưởng phát triển 55 www.vanlongco.com tốt, nấm phải cung cấp đầy đủ cân đối thành phần dinh dưỡng Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu để xác định điều kiện dinh dưỡng thích hợp cho chủng nấm Cordycep militaris NBRC 100741 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Chủng nấm C militaris NBRC 100741 mua từ Nhật Bản 2.2 Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị môi trường nuôi cấy PDA [5]: Lấy 200g khoai tây, gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát nhỏ, cho vào 1000ml nước, đun sôi 15 phút, lọc lấy dịch chiết Bổ sung đường dextrose (20 g), thạch (7g), điều chỉnh pH môi trường đến 7,0 đun sôi đến tan thạch Định mức mơi trường đến lít bổ sung nước cất Rót 10 ml mơi trường vào ống nghiệm, nút miệng ống không thấm nước, chụp giấy báo kín nút Khử trùng mơi trường nhiệt độ 121oC 15 phút, sau để nghiêng mặt phẳng nguội Phương pháp nhân giống bảo quản giống nấm: Chủng nấm nhân trì mơi trường ni cấy PDA Dùng que cấy vô trùng, tách phần hệ sợi nấm C militaris, cấy chấm điểm lên môi trường PDA chuẩn bị ống nghiệm Đặt ống nghiệm có chứa giống nấm điều kiện tối, nhiệt độ 25oC Sau ngày ni cấy, hệ sợi lan kín bề mặt môi trường Các ống nghiệm chứa chủng nấm bảo quản 4oC tủ lạnh Cấy truyền định kỳ - tháng lần Khi làm thí nghiệm, nấm cấy từ ống giống sang môi trường nghiên cứu môi trường tạo thể Đánh giá khả sử dụng đường C militaris NBRC 100741 Dextrose môi trường PDA thay loại đường: Fructose, galactose, saccharose (20g/L loại) Tiến hành thí nghiệm đĩa Petri, đường kính đĩa 10cm, thể tích mơi trường đĩa 20mL Tốc độ sinh trưởng phát triển nấm đánh giá thơng qua đường kính đặc điểm khuẩn lạc đĩa thạch Thí nghiệm lặp lại lần Các 56 đĩa nuôi cấy 25oC Đánh giá ảnh hưởng độ cứng môi trường Môi trường PDA lỏng (không chứa thạch) bổ sung 5, 10 g/L thạch để tạo độ cứng Tiến hành thí nghiệm đĩa Petri, đường kính đĩa 10cm, thể tích mơi trường đĩa 20mL Tốc độ sinh trưởng đánh giá dựa đường kính độ dày khuẩn lạc theo thời gian Thí nghiệm lặp lại lần Ni cấy trì nhiệt độ 25oC Đánh giá ảnh hưởng hàm lượng pepton Môi trường PDA(-) (chỉ chứa g/L thạch) sử dụng để đánh giá ảnh hưởng hàm lượng pepton tới sinh trưởng phát triển C militaris Tiến hành thí nghiệm đĩa Petri, đường kính đĩa 10cm, thể tích mơi trường đĩa 20mL Tốc độ sinh trưởng phát triển nấm đánh giá dựa đường kính độ dày khuẩn lạc theo thời gian Thí nghiệm lặp lại lần Nấm trì 25oC Đánh giá ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men Môi trường PDA(-) sử dụng để đánh giá ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men tới sinh trưởng phát triển nấm C militaris Tiến hành thí nghiệm đĩa Petri, đường kính đĩa 10cm, thể tích mơi trường đĩa 20mL Tốc độ sinh trưởng đánh giá dựa đường kính độ dày khuẩn lạc theo thời gian Thí nghiệm lặp lại lần Các đĩa nuôi cấy 25oC Đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn cao nấm men pepton Môi trường PDA(-) sử dụng để đánh giá ảnh hưởng hàm lượng pepton + cao nấm men tới sinh trưởng phát triển nấm C militaris Tốc độ sinh trưởng phát triển nấm đánh giá dựa đường kính độ dày khuẩn lạc theo thời gian Thí nghiệm lặp lại lần Nấm nuôi cấy 25oC Đánh giá ảnh hưởng chất tự nhiên đến nuôi trồng tạo thể Các chất gạo tám lứt, gạo nếp cẩm, bột ngô bột đậu tương sử dụng để nghiên cứu ảnh Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 www.vanlongco.com hưởng đến khả sinh trưởng phát triển nấm C militaris NBRC 100741 Các chất dùng riêng biệt không phối trộn với môi trường PDA, bổ sung 20g bột nhộng Các cơng thức thí nghiệm: Cơng thức 1: Gạo tám lứt (25g) + bột nhộng (20g) + H2O (75mL); Công thức 2: Bột ngô (25g) + bột nhộng (20g) + H2O (75mL); Công thức 3: Bột đậu tương (25g) + bột nhộng (20g) + H2O (75mL); Công thức 4: Gạo nếp cẩm (25g) + bột nhộng (20g) + H2O (75mL); Gạo tám lứt gạo nếp cẩm dùng dạng nguyên hạt, dạng bột Nấm nuôi lọ thủy tinh hình trụ 500mL (12 x 8cm) để tạo thể Các giá thể nuôi cấy tự nhiên chế biến sau: 25 g chất (một loại: Gạo lứt, bột ngô, bột đậu tương, gạo nếp cẩm) 20 g bột nhộng cho vào lọ thủy tinh 500mL, bổ sung 75mL nước cất, đậy nắp nilon chịu nhiệt, quấn chặt dây chun nhỏ, khử trùng nhiệt độ 121oC, 1atm 15 phút Sau để nguội nhiệt độ phòng, sẵn sàng cho việc cấy giống nấm Kết bàn luận Khả sử dụng đường C militaris NBRC 100741 Kết nghiên cứu thay dextrose loại đường khác (20 g/L loại) môi trường PDA theo dõi thời điểm ngày ngày, 25oC thể Bảng Bảng Ảnh hưởng loại đường đến sinh trưởng nấm Loại đường (20g/L) Đường kính khuẩn lạc sau ngày (cm) Đường kính khuẩn lạc sau ngày (cm) Dextrose Fructose 3,1 ± 0,34 2,8 ± 0,52 7,2 ± 0,23 7,0 ± 0,16 Galactose Saccharose 3,0 ± 0,21 2,4 ± 0,38 7,0 ± 0,09 5,5 ± 0,41 Kết nghiên cứu cho thấy, loại đường cho phép C militaris NBRC 100741 sinh trưởng phát triển Tuy nhiên, loại đường đơn dextrose, fructose galactose có hiệu phù hợp so với đường đôi saccharose Kết phù hợp với nghiên cứu chủng C militaris khác nước nước [6-9] Mặc dù loại đường dextrose, fructose galactose khơng có khác có ý nghĩa thống kê đường kính khuẩn lạc sau ngày ngày nuôi cấy, loại đường dextrose có giá rẻ nên tiết kiệm nuôi cấy quy mô lớn Với kết này, lựa chọn đường dextrose cho thí nghiệm Ảnh hưởng độ cứng môi trường Độ cứng chất để nuôi nấm C militaris NBRC 100741 điều chỉnh nồng độ thạch khác Kết nghiên cứu thể Bảng Bảng Ảnh hưởng độ cứng môi trường tới khả sinh trưởng phát triển nấm C militaris NBRC 100741 Nồng độ thạch (g/l) Đường kính khuẩn lạc sau ngày (cm) 7,3 ± 0,26 Trạng thái khuẩn lạc sau 10 ngày ni cấy Phủ kín đĩa, hệ sợi thưa 7,3 ± 0,47 Phủ kín đĩa, hệ sợi dày, bơng 10 7,1 ± 0,15 Chớm phủ kín đĩa, hệ sợi thưa Kết Bảng cho thấy khoảng từ đến 10g/L, thạch không ảnh hưởng nhiều tới tốc Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 Trạng thái khuẩn lạc sau 15 ngày nuôi cấy Phủ kín đĩa, hệ sợi dày Phủ kín đĩa, hệ sợi dày, bơng, bắt đầu có giọt dịch vàng nhỏ bề mặt Phủ kín đĩa, hệ sợi có mật độ dày hơn, dẹt bề mặt độ sinh trưởng phát triển hệ sợi ngày đầu có ảnh hưởng tới phân nhánh 57 www.vanlongco.com vào ngày Cụ thể, đến ngày thứ 10, nấm phủ kín đĩa thạch tất nồng độ mật độ dày hệ sợi quan sát thấy môi trường có bổ sung g/L thạch Ở mơi trường này, vào ngày thứ 15 sau cấy, nấm bắt đầu chuyển màu sang vàng nhạt số điểm có vài giọt dịch màu vàng lấm bề mặt Như vậy, nồng độ thạch phù hợp cho sinh trưởng chủng NBRC 100741 g/L Nồng độ sử dụng cho nghiên cứu (được ký hiệu PDA(-)) Ảnh hưởng hàm lượng pepton Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ pepton môi trường PDA(-) thể Bảng Bảng Ảnh hưởng nồng độ pepton tới sinh trưởng phát triển nấm C militaris NBRC 100741 Môi trường Thạch Pepton (g/L) (g/L) Đặc điểm sinh trưởng phát triển nấm Hệ sợi nấm phát triển tốt Sau 24 nhìn rõ lan tỏa PDA (-) khuẩn lạc Đến ngày thứ 5, sợi nấm phủ kín bề mặt thạch, độ dày lớp sợi nấm đo mm PDA (-) 10 Bảng cho thấy, bổ sung - 10 g/L pepton vào môi trường PDA(-) làm thay đổi tốc độ sinh trưởng phát triển sợi nấm nồng độ pepton g/L đủ cho giai đoạn sinh trưởng phát triển Nồng độ pepton cao hơn, 10 g/L, bắt đầu có ảnh hưởng Hệ sợi nấm phát triển tốt Đến ngày thứ 5, hệ sợi nấm không phủ kín bề mặt mà cụm lại, bơng cao lên không tốt tới sinh trưởng phát triển sợi nấm Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men môi trường PDA(-) thể Bảng Bảng Ảnh hưởng cao nấm men tới sinh trưởng phát triển nấm C militaris NBRC 100741 Môi trường Thạch (g/L) Cao nấm men (g/L) PDA(-) PDA(-) 10 Kết nghiên cứu cho thấy, bổ sung – 10 g/L cao nấm men vào môi trường PDA(-) không ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển sợi nấm Như vậy, kết luận nồng độ g/L cao nấm men đủ cho giai đoạn sinh trưởng phát triển Khác với pepton, nồng độ cao cao nấm men (10 g/L) khơng có tác dụng ức chế tới sinh trưởng phát triển nấm Đặc điểm sinh trưởng phát triển Hệ sợi sinh trưởng tốt, đến ngày thứ phủ kín bề mặt thạch, độ dày lớp sợi nấm 3mm Hệ sợi sinh trưởng tốt, đến ngày thứ phủ kín bề mặt thạch, độ dày lớp sợi nấm 3mm Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn cao nấm men pepton Để lựa chọn tốt nguồn ni-tơ cho sinh trưởng phát triển chủng nấm nghiên cứu, tiến hành phối trộn pepton cao nấm men với tỷ lệ khác vào môi trường PDA (-) Kết nghiên cứu thể Bảng Bảng Ảnh hưởng pepton cao nấm men tới sinh trưởng phát triển nấm C militaris NBRC 100741 Môi trường Thạch (g/L) YE*+Pepton (g/L) PDA(-) 2,5 + 2,5 PDA(-) 5+5 Đặc điểm sinh trưởng phát triển Hệ sợi nấm sinh trưởng tốt, đến ngày thứ phủ kín bề mặt thạch, độ dày lớp sợi nấm mm Hệ sợi nấm sinh trưởng tốt, đến ngày thứ phủ kín bề mặt thạch, độ dày lớp sợi nấm mm *YE: Cao nấm men (yeast extract) 58 Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 www.vanlongco.com Như vậy, qua lần thí nghiệm ảnh hưởng chất đơn lẻ phối trộn, lựa chọn môi trường phù hợp cho sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm C militaris, mơi trường chứa dịch chiết khoai tây (200g/L) + dextrose (20g/L) + thạch (7 g/L) + pepton (2,5 g/L) + cao nấm men (2,5 g/L) Ảnh hưởng chất tự nhiên Với mục tiêu tạo thể chất tự nhiên, thân thiện với môi trường, dựa nghiên cứu trước đây, loại chất lựa chọn cho việc thử nghiệm nuôi cấy chủng C militaris NBRC 100741 Giá thể nuôi cấy (25g) bổ sung 20g bột nhộng để làm nguồn nitơ hữu cho nấm Kết nghiên cứu thể Bảng Bảng Khả sinh trưởng hình thành thể nấm C militaris NBRC 100741 chất tự nhiên Cơ chất (25 g)+ 20g bột nhộng Nước (mL) Sau ngày Sau 10 ngày Sau 60 ngày Gạo tám lứt 75 Hệ sợi phủ kín bề mặt giá thể Sau chuyển sáng, hệ sợi chuyển từ trắng sang vàng cam Hình thành thể Bột ngơ 75 Hệ sợi phủ kín bề mặt giá thể Sau chuyển sáng, hệ sợi chuyển từ trắng sang vàng cam Khơng hình thành thể Bột đậu tương 75 Hệ sợi sinh trưởng yếu, chưa phủ kín bề mặt giá thể Gạo nếp cẩm 75 Hệ sợi phủ kín bề mặt giá thể Kết nghiên cứu cho thấy, nuôi trồng tạo thể loại chất: Gạo lứt, bột ngô, bột đậu tương gạo nếp cẩm, nấm C militaris NBRC 100741 sinh trưởng tốt chất gạo lứt, bột ngô gạo nếp cẩm, sinh trưởng chất bột đậu tương Nấm hình Hệ sợi sinh trưởng yếu, phủ kín 3/4 bề mặt giá thể Sau chuyển sáng, hệ sợi chuyển từ màu trắng sang vàng cam Sau chuyển sáng, hệ sợi chuyển từ trắng sang vàng cam Khơng hình thành thể Khơng hình thành thể thành thể chất gạo tám lứt (Hình 1), chất cịn lại khơng có độ thống khí bên giá thể gạo tám lứt nên hệ sợi sinh trưởng bề mặt, khơng cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho q trình phát triển khơng hình thành thể Hình Thể nấm C militaris NBRC 100741 chất gạo tám lứt Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 59 www.vanlongco.com Kết luận Kết nghiên cứu lựa chọn môi trường phù hợp cho sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm C militaris, mơi trường PDA cải tiến chứa dịch chiết khoai tây (200 g/l) + dextrose (20g/L) + thạch (7 g/L) + pepton (2,5 g/L) + cao nấm men (2,5 g/L); điều kiện nuôi cấy 25oC Sau ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm cấy chuyển sang bình ni cấy 500 ml chứa mơi trường gồm gạo tám lứt (25 g), bột nhộng (20 g) 75 ml nước khử trùng để tạo thể Tài liệu tham khảo Shrestha B, Zhang W, Zhang Y, Liu X (2012), The medicinal fungus Cordyceps militaris: research and development, Mycological progress, 11(3), 599-614 Zhou X, Gong Z, Su Y, Lin J, Tang K (2009), Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 61(3), 279-291 Ainsworth GC, Sussman AS (2013), The Fungal Population: An Advanced Treatise Elsevier publishing house Chen R, Ichida M (2002), Infection of the silkworm, Bombyx mori, with Cordyceps militaris, Journal of Insect Biotechnology and Sericology, 71(1), 61-63 Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành Vi sinh vật học, NXB Đại học Sư phạm, 71-72 Phạm Quang Thu (2009), Điều tra phát nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn, Bộ Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, 4, 91-94 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà (2010), Nghiên cứu xây dựng quy trình ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L : Fr.) Link có giá trị dược liệu thương mại cao, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Tuli HS, Sharma AK, Sandhu SS (2014), Optimization of fermentation conditions for cordycepin production using Cordyceps militaris 3936, Journal of Biological and Chemical Sciences, 1, 35-47 Wen TC, Li GR, Kang JCC, Kang C, Hyde KD (2014), Optimization of solid-state fermentation for fruiting body growth and cordycepin production by Cordyceps militaris, Chiang Mai Journal of Science, 41(4), 858-872 Đính Do sơ xuất tác giả, Tịa soạn xin đính sau: Bài báo “Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch cao xương cá sấu hoa cà” đăng Tạp chí Dược liệu, tập 20, số 2/2015 (trang 121 – 126), thành viên nhóm tác giả báo ghi gồm “Trần Thị Minh Tâm, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh Đức” xin sửa thành: “Nguyễn Thị Thanh Lai, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh Đức” BBT Tạp chí Dược liệu 60 Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 ... hiệu PDA(-)) Ảnh hưởng hàm lượng pepton Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ pepton môi trường PDA(-) thể Bảng Bảng Ảnh hưởng nồng độ pepton tới sinh trưởng phát triển nấm C militaris NBRC 100741 Môi... thứ 5, hệ sợi nấm khơng phủ kín bề mặt mà cụm lại, bơng cao lên không tốt tới sinh trưởng phát triển sợi nấm Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men môi trường... Bảng Ảnh hưởng cao nấm men tới sinh trưởng phát triển nấm C militaris NBRC 100741 Môi trường Thạch (g/L) Cao nấm men (g/L) PDA(-) PDA(-) 10 Kết nghiên cứu cho thấy, bổ sung – 10 g/L cao nấm men