Trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, cao toàn phần tỏa dương với liều 300 mg/kg/ngày, uống liên tục trong 5 ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm, tỷ lệ giảm so với chứng bệnh là 30,2%. Hơn nữa, cao toàn phần tỏa dương với liều 300 mg/kg thể hiện khả năng ức chế hoạt độ xanthin oxidase ở gan chuột nhắt trắng với phần trăm ức chế là 8,3%, gợi ý cho cơ chế tác dụng hạ acid uric của tỏa dương.
www.vanlongco.com Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 (Trang 51-54) NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA TỎA DƯƠNG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Nguyễn Thùy Dương1,*, Nguyễn Thị Hồng Anh2, Phan Thị Thu Hiền1, Đỗ Thị Hà2 Đại học Dược Hà Nội; 2Viện Dược liệu *Email: duongnt@hup.edu.vn (Nhận ngày 04 tháng 01 năm 2017 ) Tóm tắt Trên mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat, cao toàn phần tỏa dương với liều 300 mg/kg/ngày, uống liên tục ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết chuột nhắt trắng thực nghiệm, tỷ lệ giảm so với chứng bệnh 30,2% Hơn nữa, cao toàn phần toả dương với liều 300 mg/kg thể khả ức chế hoạt độ xanthin oxidase gan chuột nhắt trắng với phần trăm ức chế 8,3%, gợi ý cho chế tác dụng hạ acid uric tỏa dương Từ khóa: Hạ acid uric, Balanophora laxiflora, Tỏa dương, Ức chế xanthin oxidase Summary Hypouricemic Effects of Balanophora laxiflora Hemsl on Serum Uric Acid Level and Liver Xanthine Oxidase Activity in Potassium Oxonate-Pretreated Mice The effect of the extract of Balanophora laxiflora Hemsl on the serum uric acid level were investigated using hyperuricemic mice induced by potassium oxonate When administered per orally at doses of 300 mg/kg for days, the extract of Balanophora laxiflora reduced the serum uric acid level by 30,2% Furthermore, this extract at the abovementioned dose inhibited significantly mouse liver xanthine oxidase activity These results suggested that hypouricemic effects of Balanophora laxiflora may be achieved by the xanthine oxidase inhibition Keywords: Balanophora laxiflora, Hypouricemic, Xanthine oxidase Đặt vấn đề Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl., họ Dó đất (Balanophoraceae) dược liệu quý, từ lâu sử dụng y học cổ truyền để điều trị nhức mỏi chân tay, đau bụng, chữa ho, chảy máu tử cung trĩ, làm thuốc bổ cho người già, người ốm dậy, phụ nữ sau sinh [1] Gần đây, Ho S.T cộng đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết phân đoạn ethyl acetat chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn tỏa dương mô hình gây tăng acid uric kali oxonat Kết cho phân đoạn ethylacetat chất phân lập GHDGP CHDGP có tác dụng giảm acid uric huyết [2] Ở Việt Nam, nghiên cứu tác dụng sinh học tỏa dương tương đối hạn chế Vì vậy, để góp phần cung cấp thêm chứng khoa học cho việc sử dụng nấm tỏa dương, nghiên cứu thực nhằm đánh giá tác dụng hạ acid uric nấm tỏa dương thực nghiệm Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) thu hái tự nhiên Cao Bằng vào 12/2013 Mẫu nghiên cứu xác định tên khoa học TS Nguyễn Thế Cường TS Trần Huy Thái Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật- Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Sau thu hái, mẫu nghiên cứu rửa sạch, sấy khô đến khối lượng không đổi xay thơ Bột dược liệu chiết nóng lần ethanol 80%, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi áp suất giảm, cô cách thủy thu cao đặc (tỷ lệ khối lượng làm khô 21,98%, hiệu suất chiết cao 25,05%) 2.2 Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, cân nặng từ 18- 22 g, khỏe mạnh Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật nuôi ổn định với điều kiện phịng thí 51 www.vanlongco.com nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội ngày trước thực nghiên cứu, nuôi dưỡng thức ăn tiêu chuẩn Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự 2.3 Hóa chất Kali oxonat 97% (Sigma- Aldrich), xanthin 99-100% (Sigma- Aldrich), kit định lượng acid uric (Teco Diagnostics), hóa chất pha đệm tiêu chuẩn phân tích (Meck) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng cao toàn phần tỏa dương đến nồng độ acid uric huyết mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat: Áp dụng mô hình gây tăng acid uric cấp tiêm màng bụng kali oxonat chuột nhắt trắng [3], [4] Chuột chia ngẫu nhiên thành lô: lô chứng uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%, lô đối chiếu uống allopurinol 10 mg/kg lơ thử uống cao tồn phần tỏa dương mức liều 300 mg/kg – 600 mg/kg – 1200 mg/kg (thiết kế mức liều dựa liều dùng theo kinh nghiệm người) hàng ngày vịng ngày trước làm thí nghiệm Ngày thứ năm, chuột tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat pha CMC-Na 0,5% với liều 500 mg/kg trước uống thuốc lần cuối Sau uống thuốc giờ, lấy máu động vật đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút 10 phút để lấy huyết Nồng độ acid uric xác định thông qua việc đo mật độ quang sản phẩm phản ứng acid uric hóa chất thử bước sóng 520nm (bằng máy sinh hóa TC 3300 Plus- Teco Diagnostic) Xác định tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết lô thử so với lô chứng: I (%) = ´ 100 (Cc, Ct: nồng độ acid uric huyết lô chứng, lô thử) 2.4.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng cao toàn phần tỏa dương đến hoạt độ enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm: Áp dụng mơ hình đánh giá ảnh hưởng đến 52 hoạt độ enzym gan chuột thí nghiệm [4], [5] Chuột chia ngẫu nhiên thành ba lô: lô chứng uống dung môi pha thuốc, lô đối chiếu uống allopurinol 10 mg/kg lơ thử uống cao tồn phần tỏa dương mức liều 300 mg/kg hàng ngày vòng ngày trước làm thí nghiệm Kết thúc thực nghiệm, cân g gan, cắt thành mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể để lạnh có sẵn mL dung dịch đệm phosphat lạnh (pH = 7,5) Chiết enzym gan chuột điều kiện lạnh (nước đá tan) với tỷ lệ khối lượng gan : thể tích đệm phosphat lạnh (pH = 7,5) tương ứng 1:10 Phản ứng enzym thực ống nghiệm chứa 2,90 mL đệm phosphat (0,05M, pH 7,5), 2,50 mL dung dịch đệm chất gồm xanthin 0,12 mM, EDTA 0,192 mM, kali oxonat 2,2 mM sau chuyển sang đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning) để tiến hành đo quang bước sóng 290 nm hệ thống ELISA gồm máy ủ lắc khay (Awareness) máy đọc khay vi tinh thể (Biotek) Song song tiến hành với mẫu trắng: thay 2,5 mL dung dịch chất ống nghiệm 2,5 mL đệm phosphat pH 7,5 Các bước thí nghiệm khác làm tương tự ống nghiệm có phản ứng Ảnh hưởng cao toàn phần tỏa dương lên hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thực nghiệm đánh giá thông qua biến thiên mật độ quang ∆OD acid uric – sản phẩm tạo phản ứng chất xanthin với xanthin oxidase chiết từ gan chuột lô thử so với lô chứng Tỷ lệ giảm mật độ quang lô thử so với lơ chứng tính theo theo cơng thức: I (%) = , ∆ODc, ∆ODt: mật độ quang mẫu lô chứng, lô thử Phương pháp xử lý số liệu thống kê Nồng độ acid uric huyết biểu diễn dạng M ± SE (M: giá trị trung bình lơ, SE: sai số chuẩn) Giá trị ΔOD biểu diễn dạng M ± SD (M: giá trị ΔOD trung bình mẫu, SD: độ lệch chuẩn) So sánh lô Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 www.vanlongco.com phân tích one-way ANOVA, dùng hậu kiểm LSD để so sánh giá trị trung bình lơ thử so với lơ chứng Sự khác biệt lô coi có ý nghĩa thống kê p < 0,05 Kết nghiên cứu Kết đánh giá ảnh hưởng cao toàn phần tỏa dương đến nồng độ acid uric huyết mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat: Kết trình bày Bảng Bảng Ảnh hưởng cao toàn phần tỏa dương đến nồng độ acid uric huyết mơ hình gây tăng cấp acid uric kali oxonat Nồng độ acid uric huyết Tỷ lệ giảm acid uric so với (µmol/L) chứng (%) Lơ Liều (mg/kg) n Chứng - 137,17 ± 16,42 - Allopurinol 10 60,21 ± 12,39** 56,1 Tỏa dương 300 95,69 ± 13,78* 30,2 Tỏa dương 600 102,98 ± 8,67 24,9 Tỏa dương 1200 128,50 ± 15,27 6,3 * p < 0,05; ** p < 0,01 so sánh với lơ chứng Cao tồn phần tỏa dương với mức liều 300 mg/kg dùng đường uống chuột nhắt trắng làm giảm nồng độ acid uric huyết mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat, tỷ lệ giảm so với chứng 30,2% (p < 0,05) Hai mức liều 600 mg/kg 1200 mg/kg có xu hướng làm giảm nồng độ acid uric huyết khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với chứng (p > 0,05) Alopurinol 10 mg/kg có tác dụng hạ acid uric huyết thanh, tỷ lệ giảm so với lô chứng 56,1% (p < 0,01) Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vivo cao toàn phần tỏa dương: Kết trình bày Bảng Bảng Ảnh hưởng cao toàn phần tỏa dương đến xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm Độ hấp thụ quang (∆OD) Tỷ lệ giảm ∆OD so với acid uric chứng (%) 0,553 ± 0,010 - 10 0,429 ± 0,015** 22,4 Tỏa dương 300 0,507 ± 0,016* 8,3 Tỏa dương 600 0,560 ± 0,016 - Tỏa dương 1200 0,585± 0,017 - Lô Liều (mg/kg) n - Allopurinol Chứng * p < 0,05, ** p < 0,01 so sánh với lơ chứng Cao tồn phần tỏa dương liều 300 mg/kg có tác dụng làm giảm mật độ hấp thụ quang acid uric- sản phẩm phản ứng chất xanthin với xanthin oxidase chiết từ gan chuột, tỷ lệ giảm 8,3% so với lô chứng (p < 0,05) Hai mức liều 600 mg/kg 1200 mg/kg không làm thay đổi thông số (p > 0,05) Thuốc đối chiếu allopurinol liều 10 mg/kg có tác dụng làm giảm độ hấp thụ quang acid uric so với lô chứng, tỷ lệ giảm 22,4% (p < 0,01) Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 Bàn luận Theo kinh nghiệm, tỏa dương dùng làm thuốc bổ máu, phục hồi sức khỏe, kích thích ăn ngon miệng, chữa đau bụng, chữa nhức mỏi chân tay… [1] Công bố gần nhóm tác giả nước ngồi cho thấy tỏa dương có tiềm hạ acid uric thực nghiệm, nhiên tác giả đánh giá tác dụng phân đoạn chất phân lập từ tỏa dương [2] Vì vậy, mức liều rà soát tác dụng hạ acid uric cao toàn 53 www.vanlongco.com phần tỏa dương nghiên cứu thiết kế xuất phát từ khoảng liều theo kinh nghiệm hàng ngày người, có áp dụng phương pháp ngoại suy động vật hiệu suất chiết cao để ba mức liều thử nghiệm Kết cho thấy, mơ hình gây tăng cấp acid uric kali oxonat, cao toàn phần tỏa dương liều 300 mg/kg có khả làm giảm acid uric huyết 30,24% so với lô chứng bệnh hai mức liều cao tác dụng Mối tương quan liều đáp ứng thường tuân theo đường cong sigmoid, tác dụng đạt tối đa tăng liều khơng tăng thêm tác dụng Nhóm nghiên cứu hướng tới giả thuyết này, tỏa dương thể tác dụng hạ acid uric mức liều thấp so với tác dụng khác theo kinh nghiệm nên mức liều 300 mg/kg đạt hiệu lực tối đa ba mức liều thử Thí nghiệm thực nhằm tìm hiểu chế hạ acid uric, hướng tới khả ức chế xanthin oxidase- đích tác dụng thường tiếp cận nghiên cứu phát triển thuốc Cao toàn phần toả dương liều 300 mg/kg tiếp tục thể tác dụng ức chế xanthin oxidase gan chuột thực nghiệm Ho S.T cộng trước cơng bố cao chiết Balanophora laxiphora có tác dụng chống oxy hóa tốt, nữa, lồi Balanophora cịn chứa lượng lớn tanin thủy phân hợp chất phenolic [6], [7] Nhiều nghiên cứu số hợp chất phenolic có tác dụng ức chế mạnh xanthin oxidase cho tác dụng hạ acid uric hợp chất liên quan đến tác dụng chống oxy hóa khả ức chế xanthin oxidase [8], [9] Tuy nhiên, giả thuyết ban đầu, cần phải tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phân lập chất có hoạt tính từ nấm tỏa dương theo định hướng kết tác dụng sinh học khẳng định Kết luận Cao toàn phần tỏa dương liều 300 mg/kg/ngày, uống liên tục vịng ngày có tác dụng giảm rõ rệt nồng độ acid uric huyết chuột nhắt trắng thực nghiệm mơ hình gây tăng cấp kali oxonat thể khả ức chế xanthin oxidase gan chuột nhắt trắng so sánh với lô chứng Lời cảm ơn: Các tác giả trân trọng cảm ơn Quỹ phát triển khoa học cơng nghệ quốc gia NAFOSTED tài trợ kinh phí thực cơng trình (Đề tài mã số 106.99-2012.90) Tài liệu tham khảo Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, 555-556 Ho S T., Huang C C., Tung Y T., Wu J H (2012), The hypouricemic effect of Balanophora laxiflora extracts and derived phytochemicals in hyperuricemic mice, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 3, 1-7 Nguyễn Thùy Dương, Đào Thị Vui, Vũ Thị Trâm, Hoàng Thị Kim Huyền, Nguyễn Minh Khởi (2011), Triển khai mơ hình gây tăng acid uric máu cấp chuột thực nghiệm áp dụng nghiên cứu tác dụng hy thiêm thảo, Tạp chí Dược học, 417(51), 28 – 32 Kong L D., Yang C., Ge F., Wang H D., Guo Y S (2004), A Chinese herbal medicine Ermiao wan reduces serum uric acid level and inhibits liver xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase in mice, Journal of Ethnopharmacology, 93(2–3), 325-330 Nguyen Thuy Duong, Nguyen Thu Hang, Vu Thi Phuong Thao, Tran Thi Bich Ngoc (2014), Anti-hyperuricemic effects and inhibitory activity of liver xanthine oxidase by Apium graviolens seeds in potassium oxonate-pretreated mice, Journal of Medicinal Materials, 19(5), 303-306 Ho S T., Tung Y T., Cheng K C., Wu J H (2010), Screening, determination and quantification of major antioxidants from Balanophora laxiflora flowers, Food Chemistry, 122(3), 584588 Hosoya T., Nakata A., Zaima K., Latip J., Din L B., Muslim N., Morita H (2010), Papuabalanols A and B, new tannins from Balanophora papuana, Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 58(5), 738-741 Havlik J., Gonzalez de la Huebra R., Hejtmankova K., Fernandez J., Simonova J., Melich M., Rada V (2010), Xanthine oxidase inhibitory properties of Czech medicinal plants, Journal of Ethnopharmacology, 132(2), 461-465 Lespade L., Bercion S (2010), Theoretical study of the mechanism of inhibition of xanthine oxidase by flavonoids and gallic acid derivatives, Journal of Physical Chemistry B, 114(2), 921-928 54 Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1/2017 ... nhóm tác giả nước ngồi cho thấy tỏa dương có tiềm hạ acid uric thực nghiệm, nhiên tác giả đánh giá tác dụng phân đoạn chất phân lập từ tỏa dương [2] Vì vậy, mức liều rà sốt tác dụng hạ acid uric. .. sigmoid, tác dụng đạt tối đa tăng liều khơng tăng thêm tác dụng Nhóm nghiên cứu hướng tới giả thuyết này, tỏa dương thể tác dụng hạ acid uric mức liều thấp so với tác dụng khác theo kinh nghiệm. .. hợp chất phenolic [6], [7] Nhiều nghiên cứu số hợp chất phenolic có tác dụng ức chế mạnh xanthin oxidase cho tác dụng hạ acid uric hợp chất liên quan đến tác dụng chống oxy hóa khả ức chế xanthin