Bộ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRlỂiN NỊNG THƠN VIỆN CƠNG NGHỆ SAU THU HOẠCH >< 3ÁO CÁO Dầ TÀI KHCN 02 - 0Ố-04 Đềjnuc: Tuyển chọn Vi sinh vật phân giải ỉân có hoạt tính cao để sản xuất chế phẩm phân lân vi sinh CN.ĐỖ Ngọc Huyền CN.Nguyễn Mai Thanh KS.Phạm Văn Điền KS.Trầrt Văn Tiiàn PTS.Nguyẻỉt Kim Vĩu Hà nội 1998 BÁO CÁO ĐỂ TÀI x~ • TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CĨ HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI LÂN CAO ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN LÂN VI SINH I ĐẠT VÃN ĐỂ Trong nông nghiệp, bên cạnh việc khai thác nguồn lợi từ đất, người ta trọng đến việc cải tạo lại đất, ỉàm tăng đô màu cho đất Cùng với phát triển ngành khoa học, để phấn đấu cho nông nghiộp bền vững nhằm tạo mùa màng bội rhu, cung cấp đủ lương thực cho người đồng thời bảo vệ mơi trường sinh thái Có ngàv nhiều phương pháp tổng thể, ứng dụng tiến kỹ thuật nhiều chuyên ngẳnh áp dụng phần đáp ứng yêu cầu Phot ngun tố đóng vai trị quan trọng trình sinh trưởng phát triển trồng Nhưng đất phot thường tổn dạng muối phot phát khó tan mà trổng hấp thụ Xuất phát từ thực tế nước ta có trữ lượng quặng dồi dào, viộc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật có khả phân giải hợp chất phot khó tan để sản xuất phân bón vi sinh làm tăng cường đô mầu mỡ cho đất nàng cao suất, chất lượng trồng tỏ rõ nhữne ưu điểm : chi phí đầu tư thấp tận dụng nguồn lân sẵn có đất Hơn nữa, phân vi sinh cịn thay phần phân bón vơ cơ, điều có ý nghiă ỉớn sản xuất nông nghiệp Đề tài : ‘‘Tuyển chọn nghiên cứu số chủng vi sinh vật có khả chuyển hố phot phái để sản xuất phán lán vi sinh” nhằm góp phần thực yêu cầu II VẬT LIỆU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu Vạt liệu nghiên cứu Các mảu đất rẻ ngò, đậu tương, đậu đỗ đất trồng màu thu thập từ tỉnh : Hà tĩnh, Ninh bình, Hà nội, Hà tây - Các hố chất - Ca3(P04)2 hãng REACHIM (Liên xỏ) - Bột apatit 2* Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật phân giải lân Từ mẫu đất, rễ ngô, đậu tương, thu thập tỉnh : Hà tĩnh, Hà tây, Hà nội tiến hành cân 10 g đất, rẻ ngô cần phân lập pha lỗng với nước vơ trùng, độ pha lỗng thích hợp từ 10'3-10'6 Dùng Pipét vơ trùng lấy dịch mẫu nhỏ 0,05ml cho vào đĩa thạch chứa mỏi trường Pikovskava có chứa 1, 5% Ca3(P04)2 gạt trôn mặt thạch, để ủ ấm nhiệt độ 30°c 48 Xác định khả phân giải Ca3(P0 4)2 chủng vi sinh vật dựa hình thành vịng phân giải bao quanh khuẩn lạc Đổng thời quan sát đặc điếm hình thái khuân lạc máu sắc, hình dạng dùng phương pháp nhuộm kép, nhuộm bào tử quan sát tế bào Căn vào đặc điểm để ký hiệu chủng 2.2 Nghiên cứu số điều kiên ánh hưởng tới sinh trương phát triển vi sinh vật phân giải lân Đê cỏ thô sử dụng vi sinh vật phàn giải lân trèn dồng ruộng, x tiến hành nghiên cứu ánh hưởng độ mặn (ỉĩaCỈ) đổ ~ chua (pH), độ thơng khí chủng vi sinh vật - Nuôi cấy vi sinh vật ống nghiộm có nồng muối khác : 0%, 0,5%: 1%; 1,5%: 2%; 2,5% tiến hành nuôi cấy lắc máy lắc (200vòng/phút) sau 48 lấy xác định mật tế bào mơt lít dịch ni cấy - Ni cấy vi sinh vật bình tam giác có điều chỉnh độ pH khác : 4; 4,5; 5; 6; 6,5; ; 7,5; 8; 8,5 tiến hành ni cấy ỉắc máy lắc (200vịng/phút) sau 48 lấy xác định mật độ tế bào lít dịch ni cấy - Ni cấy vi sinh vật bình tam giác sau dùng đẽ nuôi cấy tĩnh (để vào tủ ấm) nuôi cấy lắc trơn máy lắc (200vịng/phút) sau 48giờ ni cấy lấy xác định mật đô tế bào ỉml dịch nuôi cấy 2.3 Nghiên cứu khả phân giải phot phat can xi, bôt quặng apatit vi sinh vật môi trường lỏng 2.3.1 Khẩ nâng phân giải phot phat can xi Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật ống nghiệm chứa 0,5% Ca3(P0 4)2 sau ngày, 10 ngày, 15 ngày, nuỏi cấy ỉấv xác định hàm lượng phot hoà tan phương pháp xanh Molipden (theo tiêu chuẩn ngành) máỵ so màu bước sóng 620nm Lượng P2O5 tan tính theo % so với tổng lượng P2O5 có Ca3(PƠ4)2 2.3.2 Khả phủn giải apatit vi sinh vật môi trường lỏng Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật ống nghiệm có chứa 1*0 apatit sau ngày, 10 ngày, 15 ngày nuôi cấy máy lắc (200vòng/phút) ỉ 46 xác định hàm lượng phot hoà tan phương pháp“ -xanh Molipden (theo tiêu chuẩn ngành) máy so màu bước sóng 620nm Lượng P 2O5 tan tính theo % so với tổng lượng P2O5 có apatit 2.4 Nghiên cứu ảnh hương vi sinh vật đến sinh trưởng phát triển ngô Bioseed 9670 Ngỏ Bioseed 9670 trồng chậu đất trùng không trùng, bón Ca3(PC>4)2 Mỗi hạt ngơ nhiễm 107 tế bào Trong q trình thí nghiêm ngơ tưới nước vồ trùng cho chậu đất trùng nước bình thường cho chậu đất khơng trùng Chăm sóc theo dõi sinh trương phát triển cảy theo tiêu chiều cao cây, lượng tươi, khô thân 2.5 2.5.1 Xây dựng quy trình sản xuất phân vi sinh vật phân giải lân Chát mang : Chất mang dùng than bùn có đủ dinh dưỡng cho vi sinh phát triển tồn tại, không gây độc vi sinh trồng môi trường sinh thái Chất mang xử lý đảm bảo tiêu kỹ thuật ắm, pH, pOo bao gói túi PE trùng phương pháp Tyndal 2.5.2 Sinh khối vi sinh vật Ống thạch nghiêng —> bình tam giác (dịch giống cấp một) lắc 48giờ bình iên men 5Iít ( ni cấy sục khí)—» Thu sinh khối * Khơng khí dưa vào 0,5lít khí/ỉ lít mơi trường!ỉ phút 2.5.3 Phản lân vi sinh chất mang trùng Chất mang -» Phối trôn + điểu chỉnh pH —>Đóng gói —> Thanh trùng Vi sinh vật PGL —> Nhân giống -» Dịch vi sinh _4 Chế phẩm «— Sinh trưởng -2.5.4 Trên nến chất mang không trùng Chất mang —» Phối trôn + điếu chỉnh pH -5 Vi sinh vật PGL —> Nhản giông —► Dịch vi sinh *u Chế phẩm «- Bao gói 21% Bảng Khả phân giải Ca3(P04)2 chủng vi khuẩn Chủng Lượng P2O5 hoà tan (%) 3.3.2 ngày 10 ngày 15 ngày N2 10,50 26.46 30,41 TTB 7,83 19,28 27.59 NG 9,27 28,52 30,20 HT 6,16 12,01 21,32 R 7.0 16,56 25,00 Khả phân giải apatit Bâng Khả phân giải quặng apatit cấc chủng vi khuẩn Chủng Lượng P2O5 hoà tan (%) ngày 10 ngày 11 15 ngày Nọ 1,64 10,81 11,30 TTB 0,89 6,35 NG 1,45 8,56 HT 0,33 5.27 6.84 R 0,71 6,04 7,55 7,18 X - 11,09 Khả phân giải bột quặng apatit chủng vi khuân trình bày bảng Sau 15 ngày nuôi cấy hiệu phân giải bột quặng thấp so với hiộu phân giải Ca3(P04)2 Chủng N2 cho hiệu phân giải lân lởn đạt 11,3% sau 15 ngày nuôi cấy Các chủng khác thấp đạt trôn 6% Do vi sinh vật sản sinh loại axit enzym không giống nên khả nãng phân giải ỉoại phot phát khơng hồn tồn giống (Kneey Legget 1988, Asea cộng 1988) A Ảnh hương vi khuẩn đến sinh ĩrướng VCI phát triển cày ngô Bioseed 9670 Bản ọ Ọ Ánh hưàng rùa vi khuẩn đến sinh trưởng phát triển ngô đất ĩhanh trùng TT Chiều cao củy (cm) Công Số trung thức bình bón 15 ngày Đối 30 ngày 15 30 ngày 30,24±0,50 30,39±1.41 ngà y Trong Trọng lương tươi lượng khô thàn lả thàn sau sau 30 30 ngày 2.0±0,12 0,28+0,05 chứng N, 30,46+2.75 31.29±2,15 2,63+0,17 0,35±0,08 TTb 30,26±3,42 30.50±6,76 6,5 2,19±0,57 0,29±0,0l NG 30,97+7,85 2,43±0,34 0,31 ±0,01 HT 3(X43±2/7 30,34±4,15 30,60±4,48 2.28±0,28 0,30±0,04 R 30,40±3,64 30,73±5,11 6,5 2,40+0,25 0.31±0,03 12 Kết bảng cho thấy hầu hết chủng vi khuẩn có ảnh hưởng tốt X đầu chưa biểu đến phát triển ngô lai Bioseed 9670 Tuy nhièn 15 rõ Khi nhiêm- vi sinh vật chiều cao lăng hơn, trọng lượng tươi, khô thân cao so với đối chứng Từ kết quẩ thí nghiệm trơn cho thấy chủng N có tác dụng tốt đồi với ngò Nhằm khẩng định ưu chủng No dã so sánh với chủng Bacilỉus polymyxa (Nga) chủng Baciỉỉus spp (Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt nam) c -v Báns ỈO Ảnh hương vi khuẩn đến sinh trướng vcì phút írỉển ngô trẽn đất ĩhanh ỉrùng TT CHIÉU CAO CÂY (CM) SỐ LÁ TRUNG TRỌNG LƯỢNG TRỌNG LƯỢNG CÔNG TƯƠI THÂN LÁ ÍCHƠ THÂN LÁ BỪIH SAU THỨC 15 NGÀY 30 NGÀY 15 30 NGÀY BÓN ĐC 30 NGÀY SAU 30 NGÀY TN (G/CÂY) TN (G/CÂY) 3,6±0.09 0,51±0,01 NGÀ Y 41.5 ±0,57 48,5 ±0.85 42JJ±L,74 50,6+1,87 4,17±0,25 0,72±0,03 KHƠNG Ọ PHÂN Đ/ C CĨ PHÂN BACILLU S 44,5 ±2,46 55,8±4,57 5,16±0,18 0,87 ±0,02 POLIMVX BACILLU S 45±4,15 56,8±5,I6 6,05±0,41 0,97±0,08 SPP N2 43,8±5,25 54^±5,78 4,9±0,74 0,78±0,05 Bấng ỉỉ Ảnh hưởng vi khuẩn đến sinh trưởng phát triển ngô đất thanh, ĩrùng TT CHIỀU CAO CÂY (CM) SỐ LÁ TRUNG TRỌNG LƯỢNG CƠNG BÌNH TƯƠI THÂN LÁ SAU THỨC 15 NGÀY 30 NGÀY 15 NẦV I "BĨN ĐC 44.33±0,68 50,26±1.35 KHỎNG 13 30 NGÀY 30 TN NGÀ (G/CẦY; Y 4,16±0,18 TRỌNG LƯỢNG KHÔ THÂN LÁ SAU 30 NGÀY TN 0,60±0.05 (G/CỦY) Đ/C CÓ 44,67±2,16 52.50+3,13 Ố,25±0,21 0,78±0,07 48,67±3,42 58.78±4,11 X 8,50±0,23 1,1410,02 50,02±3,18 59,65±4,85 9,75±0,48 1,34±0.02 48,45±4.12 58,34±4,15 PHÂN BACILLU - S POLYMYX BACILỈUS SPP N2 8,39±0,57 Ị 1.06+0.05 I Qua hai thí nghiệm đất trùng không trùng vi khuẩn phân giái lân rứiiẻm vào thê tác dụng tốt Cây phát triển tốt, xanh khoẻ Khi nhiễm chủng Nọ chiều cao, trọng lượng tươi, khơ thân ngị cho kết không rhua với nhiễm chủng Baciỉỉus polymvxa Dựa vào kết cảy trồng chúng tơi chọn chủng ví khuẩn có ảnh hưởng tót trổng làm thí nghiệm 3.5 Xây dựng quy trình sản xuất phân vi sinh vật phản giải lân Bản2 12 Động thái tế bào thời điểm từ đến 72 Số lượng tế bào/mi Thời gian lên N2 NG R 1.0.108 1,0.10* 1,0.10* 24 4,1.108 7,6.108 1.3.108 48 1,5.109 2.8.109 7,2.10“ 56 3,0.109 4,3.109 1.2.109 64 5,4.10y 84.109 2,5.109 72 3,0.109 4.0.109 1,0.109 men (giờ) Kết thực nghiêm cho thấy tất chủng Vì sinh vật có số lượng tế bào tăng dán đạt mức cao 64 nuôi cấy sục khí 14 Chủng NG cho mật độ tế bào cao đạt 8,1.10 9Tb/ml sau 64 nuố sục 7ngày 15 ngày 30 ngày 90 ngày N2 1,0.10“ 2.0.10’ 3,7.109 ¿9.10* 1,5.109 NG 1,0.108 3.8.10* 5,4.10* 2,1.10* 1,0.109 R 2,3.109 o* 1Ị ►© —* o X sau 64 khí Chủng R thấp mật độ tế bào đạt 2,5.10 9TB/mi Tên chủng Mật độ vi sinh vật tổng số/g 2,0.109 1,2.109 Bảnọ 14 Kết kiểm tra mật độ vi sinh vật íhan bùn khơng ĩhcinh trùng Tên chủng Mật đô vi sinh vật tổng số/g 7ngày 15 ngày 30 ngày 90 ngày N2 1,0.10“ 2,7.108 4,0.108 2,3.108 3,4.107 NG 1,0.10“ 4,3.108 5,2.10â 2,9.105 6,7.107 R 1,0.10* 1,2.108 2,4.10** 1,0.10s 3,5.107 Kết kiểm tra chất lượng chế phẩm phân vi sinh thời gian bảo quản cho thấy chủng Nọ NG có khả nảng tồn nển chất mang than bùn trùng Mật độ sau 90 ngày bảo quản đạt 109TB/g Mật độ vi sinh vật tăng nhanh thời gian đầu giảm manh thời gian sau Khả phát triển chủng vi sinh vật chất mang than bùn không trùng Mật độ TB sau 90 ngày thấp đạt l0 7TB/g không đạt tiêu chuẩn chất lượng phân vi sinh KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ -Từ chủng vi khuân có khả phân giải lân phân ỉập từ đất rể ngô, đậu tương, tuyển chọn chủng vi khuẩn (ký hiộu No, NG, R) có 15 phản giải lân cao Ba chủng có hoạt tính chun hố tính đường kính vòng X - chủng vi khuẩn Nọ, NG, R phát triển tốt nồng độ muối thấp 1,5%, phân giải từ 6-9mm độ pH rông từ 5-8 Đặc biệt pH 6,5-pH nuỏi cấy sục khí ba chủng đểu phát triển tốt * Cả chủng vi khuẩn No, NG, R có khả chun hố Ca 3(P04)2 đạt từ 2130% bột quặng apatit từ 7-11% sau 15 ngày nuôi cấy - chủng vi khuẩn N2, NG, R làm tăng chiều cao cây, trọng lượng thân ngô lai bioseed 9670 - Đã xây dựng quy trình sản xuất thử chế phẩm phân lân vi sinh chất mang than bùn trùng cho kết qủa tốt Sau tháng bảo quản mật độ tế bào chủng đạt 109TB/g đạt tiêu chuẩn chất lượng phân vi sinh Sau hai năm nghiên cứu thu kết bước đầu Đề nghị Ban chủ nhiộm chương trinh KHCN-02-06 tạo điéu kiện cho phép sản xuất thử nghiệm ứng dụng chế phẩm sản xuất nông nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Văn Toản Vì sinh vật phân giải ỉân ảnh hưởng cua chúng tới phát triển ngơ lúa Tạp chí khoa học công nghệ quản lý kinh tế nông nghiệp CNTP, số 5, 1994 Phạm Văn Toản, Nguyễn Kim Vũ, Phạm Bích Hiên Báo cáo tóm tắt hội nghị khoa học toàn quốc cồng nghệ sinh học hoá sinh phục vụ sản xuất đời sống Trần cẩm Vân, Bùi Ngọc Dung Khả phân huỷ photphát vô số chủng, loại vi khuẩn phân lập từ đất Thông báo khoa học trường đại học , 1994 16 Ases P.E.A., Kucey R.M.N., Stewart J.W.B (1988) Inorganic phosphate X solubilization by two pennicilium species in solution culture soil Soil biol Biochem 20,4,459-464 Gundars Rac WXB Sinhs M.K (1963) Phosphate dissolving organisms in the soil and the rhizosphere Indian Agric Science A.C Gaur Phosphate solubilizing micro-organisms Division of microbiology Indian Agricultural research 17 ...TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CĨ HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI LÂN CAO ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN LÂN VI SINH I ĐẠT VÃN ĐỂ Trong nông nghiệp, bên cạnh vi? ??c khai thác nguồn lợi từ đất, người ta trọng đến vi? ??c cải... sẵn có đất Hơn nữa, phân vi sinh cịn thay phần phân bón vơ cơ, điều có ý nghiă ỉớn sản xuất nông nghiệp Đề tài : ‘? ?Tuyển chọn nghiên cứu số chủng vi sinh vật có khả chuyển hố phot phái để sản xuất. .. pH -5 Vi sinh vật PGL —> Nhản giông —► Dịch vi sinh *u Chế phẩm «- Bao gói