ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHÁNG VI SINH VẬT CỦA SẢN PHẨM MỸ PHẨM

TCVN T I ÊU C H U ẨN Q U Ố C G I A Dự thảo VN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHÁNG VI SINH VẬT TC CỦA SẢN PHẨM MỸ PHẨM Cosmetics - Microbiology - Evaluation of the antimicrobial protection D Ự TH ẢO of a cosmetic product THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – TCVN …01 Lời nói đầu TCVN 01 xây dựng sở ISO 11930:2019 Cosmetics – Microbiology – Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product TCVN …01… Viện Kiểm nghiệm Thuốc Tp Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng D Ự TH ẢO TC VN cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Mỹ phẩm – Vi sinh vật - Đánh giá hiệu kháng vi sinh vật mỹ phẩm Cosmetics - Microbiology - Evaluation of the antimicrobial Phạm vi áp dụng TC VN protection of a cosmetic product Tiêu chuẩn cung cấp quy trình để giải thích liệu thu phép thử đánh giá hiệu TH ẢO bảo quản đánh giá rủi ro vi sinh, hai đánh giá tổng quát khả kháng vi sinh vật sản phẩm mỹ phẩm Văn bao gồm: - Phép thử kiểm tra hiệu bảo quản - Quy trình đánh giá hiệu kháng lại vi sinh vật mỹ phẩm khơng đánh giá có mức độ rủi ro thấp, dựa đánh giá rủi ro mô tả TCVN … (xem ISO 29621) Ự Thử nghiệm phương pháp tham khảo sử dụng để đánh giá hiệu bảo quản D công thức mẫu mỹ phẩm áp dụng cho sản phẩm mỹ phẩm thị trường Thử nghiệm không bắt buộc mỹ phẩm mà nguy vi sinh xác định thấp (xem Phụ lục A TCVN … (xem ISO 29621)) Thử nghiệm chủ yếu thiết kế cho sản phẩm mỹ phẩm tan nước sản phẩm trộn lẫn với nước thay đổi để kiểm tra sản phẩm nước pha nội Chú thích: Phép thử sử dụng hướng dẫn để phát triển phương pháp tiêu chuẩn sở suốt chu kỳ phát triển sản phẩm mỹ phẩm Trong trường hợp này, phép thử sửa đổi mở rộng, hai, ví dụ để xem xét liệu trước biến khác (chủng vi khuẩn, môi trường, thời gian ủ, vv…) Tiêu chí áp dụng phù hợp với mục tiêu cụ thể.Trong trình phát triển sản phẩm mỹ phẩm, phương pháp khác sử dụng thích hợp để xác định hiệu bảo quản công thức TCVN 01 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này.Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) ISO 16212:2017, Cosmetics - Microbiology - Enumeration of yeast and mould ISO 18415:2017, Cosmetics - Microbiology - Detection of specified and non-specified microrganisms ISO 21148:2017, Cosmetics - Microbiology - General instructions for microbiological examination ISO 21149:2017, Cosmetics - Microbiology - Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria VN ISO 22716:2017, Cosmetics - Good Manufacturing Practices (GMP) - Guidelines on Good Manufacturing Practices of microbiologically low-risk products Thuật ngữ định nghĩa TH ẢO TC ISO 29621:2017,Cosmetics – Microbiology - Guidelines for the risk assessment and identification Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau Thuật ngữ ISO IEC sử dụng cách chuẩn hóa theo địa sau: ISO: http://www.iso.org/obp/ - IEC: http://www.electropedia.org 3.1 Ự - Công thức mỹ phẩm D Là tạo thành sản phẩm từ vật liệu thô với thành phần có số lượng chất lượng xác định 3.2 Sản phẩm mỹ phẩm Thành phẩm mỹ phẩm qua tất khâu sản xuất, bao gồm bao bì đóng gói cuối để vận chuyển 3.3 Khả kháng vi sinh vật mỹ phẩm Khả mỹ phẩm kháng lại tạp nhiễm vi sinh vật gây nguy cho người sử dụng Chú thích: Khả kháng vi sinh vật tổng thể bao gồm chất bảo quản có cơng thức, quy trình sản xuất cụ thể bao bì bảo vệ TCVN 01 3.4 Sự bảo quản công thức mỹ phẩm Các phương thức sử dụng để tránh gia tăng vi sinh vật cơng thức mỹ phẩm Ví dụ: chất bảo quản, hợp chất đa chức năng, nguyên liệu gốc đối kháng, pH khắc nghiệt, hoạt độ nước thấp … 3.5 Phương pháp tham khảo Phương pháp áp dụng bên liên quan để đánh giá sản phẩm thị trường trường hợp tranh chấp 3.6 Phương pháp phát triển Tiêu chuẩn sở Phương pháp sử dụng giai đoạn phát triển sản phẩm trước sản phẩm Người dùng TC 3.7 VN đưa thị trường Người sử dụng cuối sản phẩm mỹ phẩm Nguyên tắc TH ẢO Việc đánh giá khả ức chế vi sinh vật sản phẩm mỹ phẩm kết hợp yếu tố sau (xem Phụ lục A): a) Các đặc điểm công thức (xem ISO 29621) kết phép thử hiệu chất bảo quản (nếu thực hiện), hai Kiểm tra hiệu chất bảo quản mô tả mục Ự 5.5 b) Nếu cần thiết đặc tính sản phẩm kết hợp với điều kiện sản xuất (xem ISO 22716 D ISO 29621), vật liệu đóng gói, khuyến cáo sử dụng sản phẩm (xem ISO 29621) xem xét Tiêu chuẩn mô tả quy trình để giải thích liệu thu việc thực phép thử đánh giá hiệu chất bảo quản (nếu phù hợp) đánh giá rủi ro vi sinh 5.1 Đánh giá hiệu ức chế vi sinh vật chất bảo quản Qui định chung Việc đánh giá hiệu ức chế vi sinh vật chất bảo quản công thức mỹ phẩm dựa việc thêm chủng chuẩn (xem mục 5.3) vào công thức Số lượng vi sinh vật sống lại được theo dõi với khoảng thời gian xác định suốt 28 ngày Đối với thời điểm chủng vi sinh, giá trị giảm log tính so sánh với giá trị nhỏ tiêu chí đánh giá A B (xem Phụ lục B) Khi sử dụng phương pháp tham chiếu, phải tuân thủ bước quy trình để tránh thay đổi kết Các phương pháp phát triển khác sử dụng để xác định hiệu ức chế vi sinh vật chất bảo quản cơng thức TCVN 01 suốt q trình phát triển sản phẩm (xem mục 1.2) Trước tiến hành thử nghiệm, đặc tính vi sinh vật sản phẩm xác định theo ISO 21149 ISO 16212, với ISO 18416:2015 – Phát Candida albicans để đảm bảo vi sinh vật diện mẫu thử không gây ảnh hưởng đến độ phục hồi chủng thử nghiệm 5.2 5.2.1 Vật liệu, thiết bị, thuốc thử môi trường nuôi cấy Quy định chung Khi sử dụng nước làm dung mơi pha lỗng, pha chất trung hồ hay mơi trường ni cấy cần sử dụng nước cất nước tinh khiết tuân theo tiêu chuẩn nêu ISO 21148:2017; mục 8.2 5.2.2 Vật liệu Sử dụng thiết bị thơng thường phịng thí nghiệm phịng vi sinh (xem ISO 21148) và: VN 5.2.2.1 Bi thủy tinh, 5.2.2.2 Lọc thủy tinh xốp, Đường kính lỗ xốp loại (40 pm to 100 pm) TC Đường kính khoảng mm - mm Với thể tích thích hợp 5.2.2.4 Máy li tâm TH ẢO 5.2.2.3 Bình thủy tinh tiệt trùng có nắp Có khả li tâm với lực li tâm khoảng 2000g Dung dịch pha loãng Ự 5.2.3 D 5.2.3.1 Qui định chung Ngoại trừ yêu cầu khác, tất thuốc thử pha chế nhiệt độ phịng trước sử dụng Khi có thể, mơi trường thuốc thử pha sẵn sử dụng 5.2.3.2 Dung dịch pha loãng cho vi khuẩn Candida albicans 5.2.3.2.1 Thành phần Natri clorid Nước 8,5 g 1000 mL 5.2.3.2.2 Chuẩn bị Hòa tan natri clorid vào nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút TCVN 01 5.2.3.2.3 Thành phần Tryptone, từ casein thủy phân pancreatin 1,0 g Natri clorid 8,5 g Nước 1000 mL 5.2.3.2.4 Chuẩn bị Hòa tan thành phần vào nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH môi trường phải đạt khoảng 7,0  0,2 đo nhiệt độ phòng 5.2.3.3 Dung dịch để chuẩn bị cho hỗn dịch bào tử A brasiliensis: dung dịch polysorbat Chuẩn bị dung dịch polysorbat 80 (nồng độ 0,5 g/L ) Hòa tan nhiệt độ đến dung dịch tan 5.2.4 VN hồn tồn Phân phối vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Dung dịch trung hòa TC 5.2.4.1 Qui định chung Sự phù hợp hiệu chất trung hòa phải chứng minh chủng công thức thử nghiệm mô tả mục 5.5 TH ẢO Các chất trung hòa thường sử dụng nêu mục 5.2.4 Các ví dụ chất trung hịa thích hợp khác đưa Phụ lục C 5.2.4.2 Môi trường lỏng Eugon LT 100 5.2.4.2.1 Qui định chung Ự Môi trường chứa thành phần trung hồ chất ức chế có mẫu (lecithin polysorbat 80) chất phân tán octoxynol (Triton X100®) Có thể chuẩn bị mơ tả mục D 5.2.4.2.2, theo hướng dẫn nhà sản xuất mơi trường khơ hồn chỉnh Mơi trường pha sẵn sử dụng 5.2.4.2.2 Thành phần Casein thủy phân pancreatin 15 g Bột đậu nành thủy phân papain 5g Natri clorid 4g L-cystin 0,7 g Natri sulphit 0,2 g Glucose 5,5 g Lecithin từ trứng 1g TCVN 01 Polysorbat 80 5g Octoxynol 1g Nước 1000 mL 5.2.4.2.3 Chuẩn bị Hòa tan polysorbat 80, octoxynol lecithin từ trứng nước sơi tan hồn tồn vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp, trộn chất lỏng cịn nóng để hịa tan lại chất lắng Sau hấp để nguội, pH môi trường phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng 5.2.5 Mơi trường ni cấy VN 5.2.5.1 Qui định chung Môi trường nuôi cấy chuẩn bị mục 5.2.5.2, 5.2.5.3 5.2.5.4 từ mơi TC trường khơ hồn chỉnh theo hướng dẫn nhà sản xuất Các môi trường pha sẵn sử dụng thành phần / hiệu suất sinh trưởng chúng so sánh với 5.2.5.2 TH ẢO công thức môi trường mục 5.2.5.2.1, 5.2.5.3.1, 5.2.5.4.1 Môi trường nuôi cấy cho vi khuẩn: Môi trường thạch Tryptic đậu nành (TSA) môi trường thạch đậu nành casein thủy phân 5.2.5.2.1 Thành phần Casein thủy phân pancreatin 15 g 5g Natri clorid 5g D Thạch Ự Bột đậu nành thủy phân papain Nước 15 g 1000 mL 5.2.5.2.2 Chuẩn bị Hoà tan thành phần môi trường khô nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp, trộn chất lỏng cịn nóng để hịa tan lại chất lắng Sau hấp để nguội, pH môi trường phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng TCVN 01 5.2.5.3 Mơi trường nuôi cấy cho C albicans: Môi trường thạch Sabouraud dextrose (SDA) 5.2.5.3.1 Thành phần Dextrose 40,0 g Mô động vật thủy phân peptic 5,0 g Casein thủy phân pancreatin 5,0 g Thạch 15,0 g Nước 1000 mL 5.2.5.3.2 Chuẩn bị Hồ tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách vừa khuấy VN vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích phù hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH môi trường phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng TC 5.2.5.4 Mơi trường nuôi cấy cho A brasiliensis: thạch khoai tây - dextrose (PDA) 5.2.5.4.1 Thành phần TH ẢO Nước chiết khoai tây Dextrose Thạch (xem 5.2.5.4.2, thích 1) 5.2.5.4.2 Chuẩn bị 20,0 g 20,0 g 1000 mL Ự Nước 200,0 g D Hồ tan thành phần mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH môi trường phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Chú thích: Các loại mơi trường dạng hồn chỉnh khơ thương mại có chứa 20 g/L thạch bổ sung thêm thạch đến nồng độ cuối 20 g/L cần 5.3 Chủng vi sinh vật Thử nghiệm tiến hành sử dụng chủng vi sinh vật sau như: - Pseudomonas aeruginosa ATCC(1) 9027TM3 (chủng tương đương: CIP(2)82.118TM4 NCIMB® 8626 NBRC(4) 13275TM6 KCTC(5) 2513TM7 chủng quốc gia khác tương đương); TCVN 01 Staphylococcus aureus ATCC(1) 6538TM (chủng tương đương: CIP(2) 4.83TM - NCIMB(3) 9518TM NBRC(4) 13276TM KCTC(5) 3881TM NCTC(6) 10788TM8 chủng quốc gia khác tương đương); Escherichia coli ATCC(1) 8739TM (chủng tương đương: CIP(2) 53.126TM NCIMB(3) 8545TM - NBRC(4) 3972TM KCTC(5) 2571TM NCTC(6) 12923TM chủng quốc gia khác tương đương); Candida albicans ATCC(1) 10231TM (chủng tương đương: IP(7) 48.72TM9 NCPF(8) 3179TM10 - NBRC(4) 1594TM KCTC(5) 7965TM chủng quốc gia khác tương đương); Aspergillus brasiliensis (tên khác A niger ) ATCC® 16404TM (chủng tương đương: IP(7) 1431 - lMI(9) 14900TM11 NBRC(4) 9455TM KCTC(5) 6196TM chủng quốc gia VN khác tương đương) Các chủng cần hồn ngun theo quy trình đưa nhà cung cấp chủng -ATCC®: American Type Culture Collection (2) CIP®: Collection de I’lnstitut Pasteur (3) NCIMB® National Collection of Industrial Marine Bacteria (4) NBRC®: NITE Biological Resource Center, JP TH ẢO (1) KCTC®: Korean Collection Type Cultures NCTC®: National Collection of Type Cultures (7) IP: Institut Pasteur (8) NCPF®: National Collection of Pathogenic Fungi (9) IMI: International Mycological Institute, UK Chuẩn bị đếm chủng vi sinh vật D 5.4.1 Ự (5) (6) 5.4 TC Các chủng lưu giữ phịng thí nghiệm theo (EN 12353) Qui định chung Để thực phép thử, sử dụng chủng lưu trữ phịng thí nghiệm (xem mục 5.3) để thu chủng gốc chủng làm việc Chủng gốc chủng đồng thu cách cấy chuyền chủng lưu trữ vào ống thạch nghiêng đĩa (ống rỗng ống có chứa hạt) Sau ủ, chủng gốc giữ khoảng từ °C đến °C hai tháng sử dụng để tạo chủng làm việc Chủng làm việc, chuẩn bị trước thực phép thử, sử dụng để thu chủng dạng hỗn dịch chuẩn Chủng gốc chủng làm việc (xem mục 5.4.2 5.4.3) phải chuẩn bị điều kiện sinh trưởng giống (môi trường, điều kiện nuôi cấy) TCVN 01 5.5.2.7 Ủ (32,5 ± 2,5) °C 48 h đến 72 h vi khuẩn hiếu khí C.albicans ủ (22,5 ± 2,5) °C ngày đến ngày A brasiliensis 5.5.3 - Cơng thức tính Tính số lượng vi sinh vật có ống hỗn dịch chủng ban đầu: Nv (CFU/mL) N số khuẩn lạc trung bình đếm hai lần, với mL dung dịch đĩa Nv khoảng 100 CFU/mL - Tính số lượng vi sinh vật có ống mẫu thử (mẫu trộn với chất trung hịa): Nvf (CFU/mL) - Tính số lượng vi sinh vật có ống chứng dương (dung dịch pha lỗng trộn với chất trung hịa, khơng có mẫu thử: Nvn VN Nvf Nvn số khuẩn lạc trung bình đếm đĩa khác mL dung dịch mẫu thử dung dịch chứng dương Giải thích kết kết luận hiệu chất trung hòa TC 5.5.4 Hiệu chất trung hòa chứng minh Nvf ≥ 0,5 Nvn Nvf gần Nv TH ẢO Nếu Nvf khơng gần Nv, chất trung hịa coi có hại vi sinh vật Sai số phương pháp đếm đĩa thạch phải tính đến Hai lần đếm thường coi khác khác biệt chúng vượt 50 % Cần lưu ý điều kiện kiểm tra hiệu chất trung hịa (chất trung hồ, thể tích,…) đặc biệt độ pha loãng mẫu (1/10, 1/100 pha lỗng khác) mà điều kiện hiệu trung Ự hịa chứng minh D Nếu kết khơng thỏa mãn yêu cầu, cần phải: - Thay đổi chất trung hịa (xem Phụ lục C) pha lỗng mẫu nhiều hơn; - Nếu thực phương pháp màng lọc Nếu kết không đáp ứng với u cầu, có khả mẫu thử khơng tạp nhiễm với chủng thử nghiệm có liên quan Trong trường hợp này, cần phải có báo cáo thử nghiệm (xem mục 5.7 5.8 f) 5.6 5.6.1 Xác định hiệu bảo quản mẫu Tiến hành Tiến hành thử nghiệm riêng cho chủng 12 TCVN 01 5.6.1.1 Mở bao bì ước lượng mẫu thử Đối với chủng, cân / hút 20 g 20 mL chế phẩm thử vào bình chứa vơ khuẩn (xem mục 5.2.2.3) 5.6.1.2 Ni cấy vi sinh thử nghiệm Thêm vào bình chứa 0,2 mL chủng chuẩn (xem mục 5.4.2 5.4.3) để có nồng độ chủng cuối bình mẫu thử từ x 105 CFU/mL đến x 106 CFU/mL g cho vi khuẩn từ x 104 CFU/mL đến x 105 CFU/mL g C albicans A brasiliensis Trộn để đảm bảo phân bố đồng chủng Nồng độ chủng ban đầu cấy vào ống mẫu thử có chứa mẫu cấy, N0, tính cách sử dụng kết đếm dung dịch chủng chuẩn, N (xem mục 5.6.3.2.b) VN 5.6.1.3 Nuôi cấy mẫu thử thêm chủng Lưu trữ bình chứa chứa mẫu thêm chủng nhiệt độ (22,5 ± 2, 5) °C TC 5.6.1.4 Lấy mẫu đếm mẫu a) Tại thời điểm lấy mẫu quy định, ngày (T7), 14 ngày (T14) 28 ngày (T28), theo chủng thử nghiệm (xem Phụ lục B), lấy g mẫu cấy chủng pha loãng đến nồng độ mà TH ẢO hiệu chất trung hoà chứng minh (xem mục 5.5) Đảm bảo hệ số pha lỗng xác sử dụng để tính giá trị Nx b) Bắt đầu từ độ pha loãng mà hiệu chất trung hịa chứng minh, pha loãng gấp 10 lần dụng dịch pha loãng (xem mục 5.2.3) Quá trình đếm vi sinh vật tiến hành lặp lại lần mơi trường thích hợp (TSA cho vi Ự khuẩn, PDA cho C albicans SDA cho A brasiliensis) cho tất độ pha loãng vào thời D điểm T7 Vào thời điểm T14 T28, số lần pha lỗng hạ xuống dựa theo thu thời điểm T7 c) Cho mL dung dịch vào đĩa pertri có đường kính 85 mm - 100 mm, thêm 15 mL - 25 mL mơi trường thạch làm nóng chảy (xem mục 5.4.2) giữ bể ổn nhiệt không 48 °C Nếu sử dụng đĩa petri lớn sử dụng lượng thạch tăng thêm cho phù hợp Trộn cẩn thận dung dịch với môi trường cách xoay nghiêng đĩa petri đủ để phân tán hỗn dịch chủng Để đĩa pertri bề mặt phẳng nhiệt độ phịng đến hỗn hợp đơng lại thành thể rắn Các phương pháp đếm khác sử dụng (phương pháp trải màng lọc) tuân theo thông số đưa Nên sử dụng mL dung dịch để đếm nhằm tăng cường độ xác phép đếm 13 TCVN 01 d) Ủ 32,5 °C ± 2,5 °C 48 h đến 72 h vi khuẩn C albicans 22,5 °C ± 2,5 °C D Ự TH ẢO TC VN từ ngày đến ngày A brasiliensis 14 TCVN 01 5.6.2 Đếm khuẩn lạc Sau ủ, tiến hành đếm khuẩn lạc đĩa petri Đối với tất phép đếm (xem mục 5.4.2.5, 5.4.3.5, 5.6.1.4 c) số lượng khuẩn lạc đĩa phải từ 30 – 300 khuẩn lạc cho vi khuẩn hiếu khí từ 15 - 150 khuẩn lạc A brasiliensis Nên đánh dấu lại trường hợp vượt giới hạn vừa nêu đếm vi sinh sống lại thực mục 5.6.1.4 Khi xuất kết nhỏ 30 khuẩn lạc vi khuẩn nhỏ 15 khuẩn lạc A brasiliensis độ pha lỗng mà trung hồ Xác nhận ghi lại số lượng khuẩn lạc đĩa petri biểu thị kết việc nhân với hệ số pha lỗng Nếu khơng phát khuẩn lạc độ pha loãng xác định hiệu chất trung hồ kết VN ghi < nhân với hệ số pha loãng Xác định số lượng vi sinh vật có mẫu thời điểm t0 (N0 = N/100) theo mục 5.6.3.2 5.6.3 TC số vi khuẩn sống lại thời điểm lấy mẫu Nx theo mục 5.6.3.3 Tính tốn 5.6.3.1 Quy định chung TH ẢO Cần kiểm tra hiệu ức chế vi sinh vật chất bảo quản xác nhận (xem mục 5.5.4) số liệu thực nghiệm tuân theo nguyên tắc nêu mục 5.6.2 5.6.3.2 Xác định số lượng chủng vi sinh ban đầu N N0 Tính số lượng vi sinh vật hỗn dịch chủng chuẩn (xem mục 5.4.2 5.4.3) dạng khuẩn lạc N = C / (V*d) D Ự mililit, sử dụng công thức (1): Với: C số khuẩn lạc trung bình tính đĩa V thể tích chủng thêm vào đĩa petri (1 mL theo mục 5.4.2 5.4.3) D hệ số pha loãng dung dịch đếm N phải từ x 107 CFU/mL đến x 108 CFU/mL cho vi khuẩn từ x 106 CFU/mL đến x 107 CFU/mL C albicans A brasiliensis Xác định N0 số lượng vi sinh vật thêm vào thời gian t0 sử dụng công thức (2): N = N0 / 100 15 TCVN 01 N0 từ x 105 CFU/mL đến x 106 CFU/mL g cho vi khuẩn từ x 104 CFU/mL đến x 105 CFU/mL g cho C albicans A brasiliensis 5.6.3.3 Đếm số lượng vi sinh thời điểm lấy mẫu, Nx Tính Nx số lượng vi sinh sống lại mẫu tạp nhiễm chủng thử nghiệm theo đơn vị khuẩn lạc mL gam điểm thời gian (T7, T14 hay T28) sử dụng công thức số 3: Nx = C/(V x d) Với số khuẩn lạc trung bình tính đĩa;(xem 5.6.2) V thể tích chủng thêm vào đĩa petri (1 mL theo mục 5.6.1.4 a) D hệ số pha loãng dung dịch đếm 5.6.3.4 Sự giảm phép đếm vi sinh VN C TC Tính giá trị giảm Rx, biểu thị qua đơn vị log, thu thời điểm mẫu sử dụng công thức (4): TH ẢO Rx = lg N0 - lg Nx Với N0 số lượng vi sinh thời điểm t0 (xem mục 5.6.3.2 b) N số lượng vi sinh thời điểm tx (xem mục 5.6.3.3) D vi sinh Ự Có thể có trường hợp khơng có giảm số lượng vi sinh, chí có trường hợp tăng số lượng 5.7 Biện luận kết kết luận 5.7.1 Chỉ tiêu chấp nhận Giá trị giảm log Rx (xem mục 5.6.3.4) so sánh với giá trị nhỏ yêu cầu cho tiêu chuẩn đánh giá A hay B nêu mục Phụ lục B Tiêu chuẩn chấp nhận diễn tả hiệu kháng vi sinh vật công thức mỹ phẫm sau: - Tiêu chuẩn A: Công thức mỹ phẩm bảo quản kháng lại sinh trưởng vi sinh vật xem yếu tố nguy cho người sử dụng yếu tố bổ sung xem xét (xem mục 6.2 a) 16 TCVN 01 - Tiêu chuẩn B: theo mức độ kháng vi sinh vật chấp nhận phân tích rủi ro chứng minh tồn yếu tố kiểm soát không liên quan đến công thức cho thấy rủi ro vi sinh chấp nhận sản phẩm mỹ phẩm.(xem 6.2 b) Tiêu chuẩn chấp nhận diễn tả giá trị giảm log nhỏ hay “NI” u cầu khơng có gia tăng số lượng vi sinh vật Sai số phương pháp vi sinh sử dụng để xác định giá trị Rx giá trị xem xét so sánh giá trị Rx thu tiêu chí A B Trong tiêu chuẩn này, độ lệch khoảng 0,5 log so với giá trị tiêu chuẩn coi chấp nhận 5.7.2 Trường hợp tổng quát (hiệu chất trung hòa chứng minh với tất chủng vi sinh) VN Đối với chủng vi sinh so sánh giá trị Rx với giá trị tiêu chuẩn A hay B (Phụ lục B mục 5.7) a) Nếu tất giá trị giảm phù hợp với tiêu chí A, cơng thức đáp ứng u cầu A TC phép thử hiệu chất bảo quản phù hợp với mục 6.2 a đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn Nếu tất giá trị giảm phù hợp với tiêu chí B công thức đáp ứng yêu cầu B TH ẢO b) kiểm tra hiệu chất bảo quản Cần phải bổ sung thêm chứng để sản phẩm đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn (xem 6.2 b) c) Nếu nhiều giá trị giảm khơng phù hợp với tiêu chí A B, cơng thức khơng đáp ứng u cầu kiểm tra hiệu chất bảo quản Tình trạng sản phẩm 5.7.3 Ự đánh giá theo đánh giá rủi ro vi sinh học (xem mục 6.2 c) Trường hợp công thức mà hiệu chất trung hịa khơng chứng minh D cho số chủng Nếu hiệu chất trung hịa khơng chứng minh số chủng có thêm phép thử bổ sung (xem mục 5.5.4), cơng thức coi khơng dễ bị nhiễm dòng vi khuẩn Lưu ý kết "không dễ bị nhiễm" Kết coi tương đương với Rx đưa giá trị tiêu chuẩn độ giảm log Phụ lục B Giải thích kết cho chủng mà hiệu chất trung hòa chứng minh so sánh giá trị Rx với giá trị tiêu chuẩn A B (xem Phụ lục B mục 5.7) Nếu tất giá trị giảm phù hợp với tiêu chí A (hoặc B), cơng thức thỏa mãn phép ngoại suy yêu cầu A (hoặc B) việc kiểm tra hiệu chất bảo quản Nếu nhiều giá trị giảm không tuân theo tiêu chí A (hoặc B), cơng thức khơng đáp ứng yêu cầu kiểm tra hiệu chất bảo quản 17 TCVN 01 5.8 Báo cáo kết phép thử Báo cáo kết phép thử bao gồm thông tin sau: a) Tài liệu tham khảo tiêu chuẩn quốc tế ví dụ ISO 11930; b) Tên phịng thí nghiệm tiến hành phép thử; c) Thông tin sản phẩm mỹ phẩm: 1) Tên sản phẩm; 2) Số lô ngày sản xuất lô; 3) Tên tổ chức chịu trách nhiệm tiếp thị sản phẩm tên nhà sản Ngày nhận phịng thí nghiệm; 5) Điều kiện lưu trữ phịng thí nghiệm d) Phương pháp đếm sử dụng; e) Các điều kiện thử nghiệm; TC 4) VN xuất, biết; Thời gian phân tích; 2) Điều kiện ủ mẫu thêm chủng; 3) Thành phần chất trung hòa; 4) Nhiệt độ ủ đĩa Petri; 5) Môi trường sử dụng; 6) Chủng kiểm tra (chủng gốc điều kiện lưu trữ); 7) Các cách thức gây nhiễm mẫu với vi sinh thử nghiệm (khối lượng / thể tích Ự TH ẢO 1) f) D sản phẩm, thể tích hỗn dịch chuẩn) Kết phép thử: 1) Số lượng ban đầu vi sinh, N N0 (xem mục 5.6.3.2 a mục 5.6.3.2 b); 2) Các kết chứng minh hiệu chất trung hòa chủng thử nồng độ mẫu mà hiệu trung hòa chứng minh (trong trường hợp số chủng, cho biết kết thử nghiệm thu thử nghiệm thực để đạt trung hòa); 3) Những kết thử nghiệm (kết đếm, kết tính giá trị giảm log cho chủng thử thời điểm thử nghiệm; g) Kết luận 18 TCVN 01 6.1 Đánh giá tổng thể cho hiệu kháng vi sinh vật sản phẩm mỹ phẩm Nguyên tắc Việc kháng vi khuẩn dựa kết hợp đặc điểm công thức, điều kiện sản xuất bao bì cuối Đánh giá tổng thể có tính đến việc đánh giá rủi ro vi sinh với kết kiểm tra hiệu bảo quản, thích hợp, nêu sơ đồ định (xem Phụ lục A) Nhà sản xuất có trách nhiệm cung cấp thông tin để chứng minh an toàn chứng minh cách thỏa đáng mức độ rủi ro chấp nhận 6.2 Trường hợp - Phép thử hiệu bảo quản thực công thức a) Nếu công thức đáp ứng tiêu chí A, rủi ro vi sinh coi chấp nhận (sản phẩm mỹ phẩm bảo vệ kháng lại tăng sinh vi sinh vật gây nguy hiểm cho VN người sử dụng) sản phẩm mỹ phẩm coi đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn mà khơng cần có lý bổ sung b) Nếu cơng thức đáp ứng tiêu chí B, phân tích rủi ro vi sinh phải chứng minh có yếu tố TC kiểm sốt khơng liên quan đến cơng thức; ví dụ, bao bì đóng gói dạng bơm có mức độ bảo vệ cao so với bình (xem Phụ lục D) Đây dạng đóng gói bảo vệ để giảm nguy Do đó, phân tích rủi ro chứng minh có yếu tố kiểm soát, sản phẩm mỹ phẩm TH ẢO coi đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn sở tiêu chí B với đặc điểm bổ sung cho thấy rủi ro vi sinh chấp nhận c) Nếu công thức không đáp ứng tiêu chí A B, tình trạng sản phẩm đánh giá theo đánh giá rủi ro vi sinh Ví dụ, sản phẩm đơn liều coi có nguy vi sinh chấp nhận được, công thức không đáp ứng yêu cầu tiêu chí A D xuất xưởng Ự B, với điều kiện chất lượng vi sinh sản phẩm hoàn thiện đảm bảo thời điểm Lưu ý: Các liệu khác liệu khách hàng sử dụng sản phẩm sử dụng để chứng minh rủi ro vi sinh sản phẩm Do đó, phân tích rủi ro cho thấy tồn yếu tố kiểm sốt tăng cường (giảm rủi ro) sản phẩm mỹ phẩm coi đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn d) Nếu sản phẩm mỹ phẩm khơng đáp ứng với với tình trường hợp vừa nêu khơng thõa mãn với yêu cầu tiêu chuẩn 6.3 Trường hợp - Phép thử hiệu bảo quản không thực công thức Theo tiêu chuẩn ISO 29621, tổ chức chịu trách nhiệm sản xuất / tiếp thị sản phẩm mỹ phẩm phải xác định đặc điểm công thức thành phẩm mỹ phẩm yếu tố kiểm soát nhằm đảm bảo nguy vi sinh thấp 19 TCVN 01 Những đặc điểm, với tài liệu hỗ trợ nhằm chứng tỏ nguy vi sinh chấp nhận được, phải báo cáo Do kết phân tích rủi ro vi sinh công thức hay thành phẩm xem có nguy thấp sản phẩm mỹ phẩm coi đáp ứng yêu cầu Tiêu chuẩn sở đánh giá rủi ro vi sinh, miễn quy trình sản xuất sản phẩm tuân thủ thực hành sản xuất tốt Nếu kết đánh giá rủi ro vi sinh cho thấy cơng thức thành phẩm có mức độ rủi ro khơng chấp chận sản phẩm khơng đáp ứng với yêu cầu tiêu chuẩn Việc giảm rủi ro phải thực hiện, nhằm đảm bảo sản phẩm tuân thủ theo yêu D Ự TH ẢO TC VN cầu 20 TCVN 01 PHỤ LỤC A (Tham khảo) Sơ đồ định Sản phẩm mỹ phẩm Bản chất cơng thức có khả kháng khuẩn (xem ISO 29621) VN CĨ TC KHƠNG / KHƠNG XÁC ĐỊNH Điều kiện sản xuất, loại bao bì hay cách thức sử dụng đặc biệt? TH ẢO CÓ (xem ISO 29621) KHÔNG/ KHÔNG XÁC ĐỊNH D Ự Tiến hành thử nghiệm cơng thức Profile A CĨ Khơng phải Profile A,B Profile B Thêm yếu tố kiểm soát Những yếu tố tăng cường cho kiểm sốt KHƠNG (xem ISO 29621) KHƠNG CĨ (xem ISO 29621) Nguy vi sinh vật kiểm soát (Xem Mục 6) Nguy vi sinh vật khơng kiểm sốt (Xem Mục 6) 21 TCVN 01 PHỤ LỤC B (Tham khảo) Tiêu chuẩn chấp nhận cho việc đánh giá hiệu lực chất bảo quản Bảng B.1 – Đánh giá hiệu kháng khuẩn Yêu cầu giá trị giảm log (𝑹𝒙 = 𝐥𝐨𝐠 𝑵𝒐 − 𝐥𝐨𝐠 𝑵𝒙) yêu cầua Vi sinh vật Vi khuẩn C.albicans A brasiliensis Thời điểm lấy mẫu thử T7 T14 T28 T7 T14 ≥ NI ≥1 ≥ NI T28 T14 T28 ≥ NI ≥ 0c ≥1 ≥ NI ≥0 ≥ NI Tiêu chuẩn B ≥3 Không thực ≥ NIb ≥3 ≥ NI Không TC Tiêu chuẩn A VN nghiệm thực ≥1 Trong thử nghiệm này, dãy giá trị chênh lệch 0,5 log chấp nhận b NI: không tăng số lượng từ thời điểm tiếp xúc mẫu Ự lg N0 = lg Nx (không tăng từ đếm ban đầu) D cR = x TH ẢO a 22 TCVN 01 PHỤ LỤC C (Cung cấp thông tin) Ví dụ chất trung hịa chất kháng khuẩn dung dịch rửa Bảng C.1 - Các chất trung hòa tương ứng với hoạt tính kháng khuẩn chất bảo quản dung dịch rửa / lọc Các hợp chất phenol: - Các paraben, Lecithin, Polysorbat 80, phenoxyethanol, Các hợp chất amoni bậc bốn Các chất hoạt động bề mặt cation Lecithin, saponin, polysorbat 80, natri dodecyl sulphat Ethylen oxid ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) Các andehit Các chất giải phóng formaldehyd Glycin, histidin (dùng cho phương pháp màng lọc) Polysorbat 80, 30 g/L + lecithin, g/L Ethylen oxid ngưng tụ cồn béo, g/L + lecithin, 20 g/L + polysorbate 80, g/L Môi trường lỏng trung hòa D/E a Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; trypton, g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L Polysorbat 80, 30 g/L + natri dodecyl sulphat, g/L + lecithin, g/L Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; trypton, g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L TH ẢO TC Các anilin Ethylen oxid ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) Chất hoạt động bề mặt khơng ion - Phenylethanol, v.v… Ví dụ thành phần chất trung hịa thích hợp dung dịch rửa Hợp chất hóa học trung hịa hoạt tính kháng khuẩn chất bảo quản VN Chất bảo quản Lecithin, g/L + polysorbat 80, 30 g/L + Lhistidin, g/L Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + Lhistidin, g/L + L-cystein, g/L Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Dung dịch rửa: polysorbat 80, g/L + L-histidin, 0,5 g/L Natri thiosulfat, g/L Dung dịch rửa: Natri thiosulfat, g/L Lecithin, saponin D Các isothiazolinon, imidazol Natri thiosulfat Ự Các hợp chất oxy hóa Các amin, sulfat, mercaptan, natri bisulfit, natri thioglycolat Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Dung dịch rửa: trypton, g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L Các biguanide Lecithin, saponin, polysorbat 80 Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Dung dịch rửa: trypton g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L Các muối kim loại (Cu, Zn, Hg) Các muối thủy ngân hữu Natri bisulfat, L-cystein Natri thioglycolat, 0,5 g/L hay g/L L-cystein, 0,8 g/L hay 1,5 g/L Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Dung dịch rửa: Natri thioglycolat, 0,5 g/L a b Các hợp thioglycolic chất sulfhydryl, axít Mơi trường lỏng trung hịa D/E (Mơi trường lỏng trung hịa Dey/Engley) – xem Phụ lục B Mơi trường lỏng casein thủy phân từ đậu tương bổ sung lecithin polysorbat 23 TCVN 01 PHỤ LỤC D (cung cấp thơng tin) Đặc tính đóng gói Cần cân nhắc đến đặc tính bao bì Thiết kế bao bì đóng vai trị quan trọng kế hoạch đánh giá rủi ro việc xác định khả kháng lại vi sinh vật sản phẩm mỹ phẩm Đặc tính bao bì, việc sử dụng loại bao bì dùng lại, ảnh hưởng đến việc lựa chọn hệ thống bảo quản Khả nhiễm bẩn vi sinh người dùng tăng lên bao bì có miệng rộng phải chịu tiếp xúc trực tiếp người dùng Tương tự vậy, nguy VN nhiễm vi sinh người dùng giảm bao bì dạng đơn liều, ống nhỏ mắt chiều ngăn ngừa việc tiếp xúc trực tiếp sản phẩm với người dùng Kích thước bao bì so với số lượng sử dụng cho lần dùng nên xem xét việc sử dụng bao bì lớn TC có chứa nhiều sản phẩm kéo dài thời gian sử dụng khoảng thời gian dài làm tăng khả lây nhiễm Sự có mặt vật dụng bổ sung bàn chải, miếng đệm TH ẢO miếng phấn ảnh hưởng đến khả kháng vi sinh Các yếu tố sau nằm số yếu tố xem xét đánh giá rủi ro sản phẩm liên quan đến bao bì: Dạng đóng gói đơn liều hay đa liều;  Kích cỡ đóng gói;  Cách thức bào chế sản phẩm;  Thời gian sử dụng ước đoán;  Khả bao bì cho phép tiếp xúc trực tiếp với người sử dụng hay khơng;  Khả bao bì có bị áp lực hay không D Ự  24 TCVN 01 Tài liệu tham khảo [1] ISO 22716 Cosmetics — Good Manufacturing Practices (GMP) — Guidelines on Good Manufacturing Practices [2] ISO/IEC Guide 51, Safety aspects — Guidelines for their inclusion in standards [3] EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal, mycobactericidal, sporicidal and fungicidal activity [4] IBRAHIM Y.K.E., GEISS H.K., SONNAG H.-G„Alternatives to the traditional preservatives, SoFW, 118, June 1192 [5] LUCK E., JAGER M., Antimicrobial food additives; characteristics, uses, effects, Springer Application of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceuticals Products, TC [6] VN (ed), 1995, pp 122-124 USPC, Inc., 30(5), 2006, in-process revision: CTFA Microbiology guidelines 2007 [8] RUSSELL N.J., GOULD G.W., Food preservatives, Blackie and Son Ltd., 1991, pp 16-17 [9] DENYERS S., BAIRD R., Guide to microbiological control in pharmaceuticals, 1990, pp 16-17 and p 285 RAHMAN M.S., Handbook of food preservation, Marcel Dekker, Inc., 1999, pp 95-172 and Ự [10] D p 386 [11] TH ẢO [7] MEIER M., FISHER F.X., KELLER M., HALFMANN H.-J., Influence of alternative propellants on microbial viability in comparison to chlorofluorocarbons, Pharm Ind., 58, pp 78-82, 1996 [12] DECLERCK J., CAIRE-MAURISIER R, GENOT P., LEVACHER E., MICHAUT A., SCHEIBER G., TARDIVET S., Les gaz propulseurs: les HFC (hydrofluorocarbones) alternatives aux CFC (chlorofluorocarbones) pour les preparations pharmaceutiques pressurisees, SFSTP Pharmapratiques, 16(1), January/February 2006, pp.61-72 [13] BLOOMFIELD S.F., BAIRD R., LEAK R.E., LEECH R., Microbial Quality Assurance in Pharmaceuticals, Cosmetics and Toiletries, Ellis Horwood Series in Pharmaceutical Technology, 1988, p 78 25 TCVN 01 [14] SAWYER E., GREEN B., COLTON H., Microorganisms survival in non-CFC propellant P134a and a combination of CFC propellants P11 and P12, Pharmaceutical Technology, March 2001, pp 90-96 [15] BRANNAN D.K., Packaging’s role in preservation, Cosmetics and Toiletries, 113, Abilene Christian University, Abilene, TX, April 1998 [16] SHARPELL F and MANOWITZ M., Preservation of cosmetics, Disinfection, sterilization and preservation, fourth edition, Seymour S Block — Lea & Febiger, 1991 [17] IBRAHIM Y.K.E., SONNAG H.-G., Preservative potentials of some aerosol propellants, Effectiveness in some pharmaceutical oils, Drugs made in Germany, 2, 1995 KABARA J.J., ORTH D.S., Principles for product preservation, Preservative-free and self- VN [18] preserving cosmetics and drugs, principles and practice, Marcel Dekker, Inc (ed.), New [19] TC York, 1997, pp 1-14 FRIEDELR.R.,CUNDELL A.M., The application of water activity measurement to the microbiological attributes testing of nonsterile over-the-counter drug products, [20] TH ẢO Pharmacopeial Forum, 24(2), March-April 1998 BRANNAN D.K., Dille J.C., Type of closure prevents microbial contamination of cosmetics during consumer use, Appl Environ Microbiol., 56, 1990, pp 1476-1479 [21] ENIGLD.C.,SORRELS K.M., Water activity and self-preserving formulas, Preservative-free Ự and self-preserving cosmetics and drugs, principles and practice, Marcel Dekker, Inc [22] D (ed.), New York, 1997, pp 45-71s MISOCK J "Report For International Cooperation On Cosmetics Regulation Regulators & Industry Joint Working Group (JWG): Review of ISO Microbiological Standards: Guidelines for Cosmetic Preservation and Product Protection" June 6, 2017 26