Nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (strongyloides stercoralis) ở người 2017 2020 tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -* TRẦN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP CHẨN ĐOÁN NHIỄM GIUN LƯƠN ĐƯỜNG RUỘT (Strongyloides stercoralis) Ở NGƯỜI, 2017-2020 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số: 62.72.01.16 Hà Nội – Năm 2021 Cơng trình hồn thành Cơ sở đào tạo Sau đại học Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Xuân Mai PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình Phản biện thứ nhất: Phản biện thứ hai: Phản biện thứ ba: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, Hội đồng họp Viện Sốt rét – KST – CTTƯ vào hồi ngày năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng-Trung ương ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh giun lươn (Strongyloidiasis) bệnh nhiễm ký sinh trùng đường ruột mãn tính người Strongyloides spp gây Việt Nam xác định vùng dịch tễ lưu hành bệnh Việc chẩn đốn xác, sớm ca bệnh gặp nhiều khó khăn dễ bị bỏ sót Soi phân tìm ấu trùng có độ nhạy thấp Chẩn đốn huyết tìm kháng thể có độ nhạy cao có độ đặc hiệu thấp Phương pháp Baermann, cấy phân đĩa thạch hay nuôi cấy từ giấy lọc cần lượng phân nhiều, dụng cụ chuyên biệt, tốn nhân lực thời gian Các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt (thường dùng kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vịng trung gian – Loopmediated isothermal amplification LAMP) có độ nhạy đặc hiệu tương đương với PCR; cần thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn; phát kết xét nghiệm mắt thường; thời gian xét nghiệm nhanh Hiện chưa có kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột thương mại hóa Việc nghiên cứu, phát triển ứng dụng kỹ thuật LAMP mà áp dụng thực địa để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột nhu cầu cấp bách Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) người 2017-2020” với mục tiêu: Xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định kit phịng thí nghiệm thực địa TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI, Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài áp dụng phương pháp nghiên cứu có tính khoa học chuẩn mực áp dụng rộng rãi Việt Nam Thế giới - Hoàn thiện quy trình chế tạo kit LAMP chẩn đốn giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis Việt Nam quy mơ phịng thí nghiệm - Đây nghiên cứu nghiên cứu xây dựng kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis Việt Nam Trong bối cảnh giới chưa có kit LAMP chẩn đốn nhiễm giun lươn thương mại hóa, việc chế tạo thành công kit tạo bước đột phá giải pháp kỹ thuật chẩn đoán nhiễm giun lươn, đóng góp vào cơng tác chẩn đốn sớm điều trị kịp thời, đáp ứng yêu cầu thực tiễn phòng chống giun lươn đường ruột nước ta CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án có 112 trang (không kể phụ lục) bao gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); chương 1: Tổng quan tài liệu (31 trang); chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (19 trang); chương 3: Kết nghiên cứu (34 trang); chương 4: Bàn luận (23 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); Các cơng trình cơng bố tác giả có liên quan đến nội dung luận án (1 trang); Những đóng góp luận án (1 trang); tài liệu tham khảo 120 (17 trang, gồm 26 tài liệu tiếng việt, 94 tài liệu tiếng Anh) phụ lục (30 trang) Luận án trình bày với 28 bảng, 28 hình Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Lịch sử phát hiện, nghiên cứu giun lươn Strongyloides stercoralis Strongyloides stercoralis Normand phát lần năm 1876 Giống Strongyloides có loài xác định gây bệnh người, chủ yếu S stercoralis gặp S fuelleborni [39] Đặc điểm sinh học, bệnh học giun lươn S stercoralis Giun lươn (GL) S stercoralis có chu kỳ phát triển phức tạp GL ký sinh ruột non, đẻ trứng số lượng ngày ít, trứng nhanh chóng nở thành ấu trùng (AT) ruột non Trong chu kỳ phát triển GL có q trình tự nhiễm Bệnh GL có thời gian ủ bệnh khoảng tháng Hai thể bệnh bệnh giun lươn là: Thể bệnh thông thường: đau bụng; rối loạn tiêu hóa; ngứa, mẩn, mề đay thể bệnh nặng [3] bao gồm hội chứng tăng nhiễm GL bệnh GL lan tỏa, thường gặp bệnh nhân dùng corticosteroid liều cao Chẩn đoán điều trị bệnh giun lươn Độ nhạy kỹ thuật dựa kính hiển vi (KHV) thấp, đặc biệt trường hợp nhiễm mạn tính Các kỹ thuật Baermann nuôi cấy đĩa thạch cồng kềnh tốn thời gian Miễn dịch cơng cụ hữu ích cho kết cao thực tế không xác định mắc hay mắc [31], [42] Nhiều nghiên cứu sinh học phân tử GL tiến hành phương pháp độ nhạy độ đặc hiệu cao [44], [67], [79] Điều trị cho bệnh GL khuyến cáo cho tất người bị nhiễm, dù có triệu chứng hay khơng với hai phác đồ dùng ivermectin albendazole [3] Tình hình nhiễm giun lươn Bệnh giun lươn xảy nhiều quốc gia, mức độ nhiễm khác tùy vùng Châu Phi, Nam Trung Mỹ, Đông Nam Á vùng dịch tễ lưu hành Tỉ lệ S stercoralis bị đánh giá thấp so với thực nhiễm Theo điều tra Trường Đại học Y Hà Nội Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương tỉ lệ nhiễm GL miền Bắc thường xuyên 1% [6] Ở tỉnh phía Nam Việt Nam, số bệnh nhân nhiễm GL phát hiện, chẩn đoán điều trị năm gần tương đối nhiều [12], [18] Ngồi ra, Việt Nam có số báo cáo ca bệnh GL nặng Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian LAMP Kỹ thuật LAMP phương pháp nhân gen, tổng hợp đoạn ADN lớn mà không cần chu trình biến nhiệt LAMP sử dụng 4-6 mồi khác thiết kế đặc biệt để nhận 6-8 vùng riêng biệt gen đích LAMP xảy chuỗi mồi bám vào vị trí đích khn, tạo sản phẩm ADN-vịng Q trình diễn 55oC-65oC, hiệu khuếch đại cao Sản phẩm phản ứng quan sát mắt thường LAMP thường sử dụng để tạo kit chẩn đoán nhanh [9], [110] xây dựng để ứng dụng chẩn đoán số đơn bào, việc thương mại hóa ứng dụng đánh giá hiệu [70] Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu ứng dụng LAMP vào chẩn đốn nhiễm S stercoralis cơng bố Trên thị trường chưa có kit LAMP chẩn đốn S stercoralis thương mại hóa ứng dụng lâm sàng Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người Đối tượng nghiên cứu: Ấu trùng (AT) S.stercoralis làm chứng chuẩn phát triển chứng dương Địa điểm thời gian nghiên cứu: từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2019 phịng thí nghiệm Khoa SHPT Viện Sốt rét-Ký sinh trùng -Côn trùng Trung ương, Bộ môn Vi sinh - Ký sinh, khoa Y, Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh Thiết kế nghiên cứu: Thực nghiệm mơ tả phịng thí nghiệm Cỡ mẫu: Mẫu chuẩn dương để chuẩn kỹ thuật: tối thiểu 03 mẫu AT giun lươn S stercoralis giai đoạn nghiên cứu, mẫu tiến hành xét nghiệm lặp lại lần Nội dung nghiên cứu -Xây dựng quy trình gồm bước: + Bước 1: Thiết kế mồi: Tải 30 trình tự gen 18S rRNA giun lươn, xác định vùng bảo tồn, đưa vào phần mềm thiết kế mồi LAMP để lựa chọn mồi Khảo sát tính đặc hiệu mồi + Bước 2: Khảo sát tối ưu hóa điều kiện phản ứng LAMP + Bước 3: Khảo sát ngưỡng phát mồi + Bước 4: Tạo chứng dương công nghệ ADN tái tổ hợp - Đóng gói kit Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Thu thập bảo quản mẫu, xử lý mẫu tách chiết ADN, sử dụng phần mềm tin sinh chuyên dụng Primer Explorer v.5, Primer Blast, Mega 7, kỹ thuật qPCR – Taqman Probe, phương pháp điện di, phương pháp tạo dịng, giải trình tự Các số đánh giá - Tính đặc hiệu mồi với S stercoralis - Các điều kiện phản ứng - Ngưỡng phát - Chất lượng chứng dương - Quy trình chế tạo kit đóng gói: 2000 test Mục tiêu 2: Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định kit phịng thí nghiệm thực địa Đối tượng nghiên cứu: Bộ kit LAMP sản phẩm mục tiêu 1, mẫu phân, mẫu huyết thu thập từ người xác định nhiễm, nghi ngờ nhiễm không nhiễm GLĐR Địa điểm thời gian nghiên cứu: từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2020 Đức Hòa, Long An, ĐHYK Phạm Ngọc Thạch, Khoa Khám bệnh chuyên ngành Khoa SHPT Viện Sốt rét-Ký sinh trùng -Côn trùng Trung ương, BM Vi sinh-Ký sinh, khoa Y, Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phịng thí nghiệm thực địa Cỡ mẫu: Đánh giá độ nhạy độ, đặc hiệu kit: dựa vào cơng thức tính mẫu [105], tính cỡ mẫu 73 mẫu, cần có 19 mẫu dương thật, thực tế sử dụng 132 mẫu gồm: 100 mẫu (-) 32 mẫu (+) Đánh giá tính ổn định kit: 07 mẫu Đánh giá kit thực địa: thu thập có chủ đích 300 mẫu So sánh kit với mồi khác có mục đích tương tự cần 50 mẫu gồm 25 mẫu dương tính 25 mẫu mẫu âm tính Dựa 141 mẫu lưu thu Khoa Khám bệnh thời gian nghiên cứu để so sánh kit với soi phân ELISA Nội dung nghiên cứu - Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit phịng thí nghiệm: qPCR làm phương pháp tham chiếu - Tính ổn định kit: tiến hành qua thử nghiệm - Đánh giá kit thực địa - So sánh kit với mồi mục tiêu cơng bố tạp chí uy tín Mức độ đồng thuận: hệ số Kappa - So sánh kit LAMP với phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng soi phân ELISA Đánh giá mức độ đồng thuận cặp phương pháp: hệ số Kappa - Xây dựng tiêu chuẩn sở đăng ký kiểm định kit Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Thu thập bảo quản mẫu, xử lý mẫu tách chiết ADN, kỹ thuật ELISA, kỹ thuật soi phân, kỹ thuật qPCR – Taqman Probe, phương pháp điện di gel agarose Các số đánh giá: - Độ nhạy: > 95% - Độ đặc hiệu: > 95% - Trị số K so sánh kit LAMP với mồi tương đương phương pháp chẩn đoán giun lươn khác - Tính ổn định: kit phải hoạt động ổn định sau tháng bảo quản điều kiện phù hợp - Bộ tiêu chuẩn sở thẩm định quan uy tín Xử lý số liệu: Phần mềm MedCalc, tính độ nhạy, độ đặc hiệu, hệ số Kappa, sai số độ lệch chuẩn SD Kiểm sốt sai số Q trình thực nghiệm dựa quy trình chuẩn, tn thủ theo tiêu chuẩn phịng thí nghiệm ISO 15189, mã hóa số liệu Đạo đức nghiên cứu Tuân thủ đầy đủ quy định đạo đức nghiên cứu Y sinh học Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP để chẩn đốn nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người 3.1.1 Kết thiết kế mồi 3.1.1.1 Kết trình tự mồi Kết mồi thu có trình tự sau: Bảng 3.1 Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán giun lươn đường ruột St t1 Tên mồi F3 Trình tự mồi Độ dài AGAGGGTTTAAACCAGACATT 21 B3 CTTCGAACCTCTAACTTTCGTT 22 FIP GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCAGGTCTAGCATGGAATAACACT 45 BIP TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGACCTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC 50 LF GGTCTAGCATGGAATAACACT 21 LB GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCA 24 Bảng 3.4 Nhiệt độ nóng chảy khả tạo bắt cặp dimer mồi (dG 95% Độ đặc hiệu > 95% Ngưỡng phát gen/µL Thời gian xét nghiệm Không Độ ổn định 12 tháng điều kiện bảo quản -200C ± 50C; tháng kể từ ngày mở nắp 18 Bộ tiêu chuẩn sở thẩm định Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế đạt yêu cầu theo công bố Chương BÀN LUẬN Xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người 4.1.1 Kết thiết kế mồi Nhiều xét nghiệm PCR được thiết kế để phát S stercoralis, với gen đích gen ty thể cythocrome c oxidase tiểu đơn vị I (COX1) [71] gen nhân tế bào 18S rRNA [65], [112] hay 28S rRNA [73] Trong đó, khuếch đại tiểu đơn vị nhỏ 18S chứng minh nhạy sử dụng hầu hết xét nghiệm qPCR cho chẩn đoán Strongyloides stercoralis [31], [43], [56] Chúng tơi chọn vùng gen đích nghiên cứu 18S rRNA Kết bảng 3.1, 3.2, 3.3 3.4 cho thấy đánh giá chất lượng mồi so với tiêu chuẩn mồi đạt tiêu chuẩn Kết hình 3.4 cho thấy, dùng phần mềm Primer Blast để kiểm tra thấy đoạn mồi F3, B3 bắt cặp 100% ngân hàng gen có sản phẩm khuếch đại với kích thước 226 bp Khi thực phản ứng PCR sử dụng cặp mồi F3 B3 mồi LAMP với mẫu ADN mồi tự thiết kế đảm bảo đặc hiệu cho Strongyloides stercoralis, khơng có phản ứng chéo với loài giun khác 4.1.2 Kết xác định điều kiện phản ứng LAMP Nhiệt độ gắn mồi (Ta) thông số quan trọng tối ưu phản ứng PCR Ta cao, mồi bắt cặp vào mạch khuôn, Ta thấp dẫn đến hình thành sản phẩm khơng đặc hiệu Nhiệt độ lai tối ưu dao động xung quanh nhiệt độ biến tính mồi (T m) 5oC Theo đó, nhiệt độ phản ứng LAMP tiến hành khảo sát từ 60 đến 65o C Kết điện di sản phẩm LAMP cho thấy khơng có khác biệt điểm nhiệt độ khảo sát 630C, 640C, 650C (hình 3.6) Chúng tơi chọn điểm 19 nhiệt độ 63°C nhiệt độ tạo điều kiện ủ mồi tăng cường khả chịu đựng chất ức chế Trong dung dịch đệm, ion Mg2+ đóng vai trị quan trọng nhất, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) ADN mạch đôi, tạo phức chất tan với dNTPs để hình thành chất mà enzym polymerase nhận ra, cần thiết cho q trình liên kết dNTPs Thông qua điện di sản phẩm gel agarose 2% chọn MgSO4 nồng độ 8mM nồng độ tối ưu cho phản ứng LAMP Chúng thử nghiệm mức điều kiện thời gian phản ứng 40 phút 60 phút, với điều kiện t h n h p h ầ n p h ả n ứ n g đ ược giữ nguyên đồng nhất, thí nghiệm lặp lại lần Kết cho thấy thời gian tối thiểu để khuếch đại ADN phản ứng LAMP kit 60 phút (hình 3.8) Độ đục kết tủa trắng tạo sau phản ứng LAMP phát mắt thường có độ chụm ngắn (khoảng -10 giây) sau lấy mẫu khỏi máy ủ nhiệt Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang calcein SYBR Green I nghiên cứu tác giả khác [86], [87] có giá tiền đắt, cần có hệ thống đèn UV để đọc kết Hơn nữa, calcein kết hợp với ion Mg2+ gây ức chế hoạt động ADN polymerase làm giảm độ nhạy chung xét nghiệm Chất thị màu Xanh malachite (MG) sử dụng thành công chất thị nhạy với pH để phát sản phẩm LAMP nghiên cứu chứng minh hiệu [81], [96] Việc bổ sung MG vào đệm LAMP trước tiến hành phản ứng không ảnh hưởng đến hoạt động Bst DNA polymerase, đồng thời loại bỏ nguy tạp nhiễm mẫu Hơn nữa, kỹ thuật sử dụng để sàng lọc nhanh số lượng mẫu đáng kể với kết lặp lại, quán cách sử dụng thiết bị đơn giản rẻ Các nồng độ MG khảo sát 0,0012%, 0,008%, 0,004% 0,001% Mỗi nồng độ tiến hành lặp lại lần, kết quan sát ghi nhận 20 người độc lập Kết cho thấy, có tương đồng 100% người quan sát (bảng 3.6) nồng độ MG 0,004% Từ kết ngưỡng phát sơ cấp mồi, xác định ngưỡng phát với độ tin cậy 95% (LOD95%) Kết ngưỡng phát tương đương nghiên cứu khác ứng dụng sinh học phân tử để chẩn đoán GL tác giả giới, sở để phát triển ứng dụng kit LAMP có độ nhạy tốt để chẩn đốn nhiễm GLĐR Việt Nam 4.1.3 Kết xây dựng chứng dương Chứng dương kit LAMP xác định nhiễm Strongyloides stercoralis xây dựng công nghệ ADN tái tổ hợp theo hướng dẫn NIMPE.HD 03.PP/44 Chúng thu Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA đặc trưng cho giun lươn đường ruột có kích thước 3282bp Lượng Plasmid thu hồi 5µg hịa tan 50µL để thu nồng độ 100ng/µL, tương đương với 2,82x1010 copies/µL, đáp ứng lượng chứng chuẩn cho 2000 test thử nghiệm Ngoài chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp mang đoạn ADN đích GLĐR bảo quản điều kiện 700C để sẵn sàng nhân nuôi tinh ADN cần thiết đảm bảo tách chiết ADN để làm chứng dương chuẩn Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định kit phịng thí nghiệm thực địa 4.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit phịng thí nghiệm Chúng tơi chọn phương pháp qPCR làm phương pháp tham chiếu hai phương pháp SHPT có độ nhạy tương đương mẫu khác Phương pháp qPCR khuếch đại dựa vào đoạn gen 18S rRNA, xác định có độ đặc hiệu cao 99% so sánh với phương pháp cấy phân Harada – Mori, có độ nhạy 100% trường hợp nhiễm trung bình nhiễm nặng [116] Kết cho thấy, kit LAMP chẩn đốn GLĐR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, đáp ứng 21 yêu cầu kit xét nghiệm chẩn đoán phù hợp cao phương pháp 4.2.2 Điều kiện bảo quản độ ổn định kit Tính ổn định kit tiến hành qua thử nghiệm, kết cho thấy bảo quản điều kiện - 200C ± 50C kit hoạt động ổn định sau thời gian năm, tan đá bảo quản nhiệt độ 2-80C kit hoạt động ổn định sau tháng, thời gian lâu không khảo sát Như kit áp dụng thực địa hồn tồn khả thi Tại sở y tế lớn, nơi có điều kiện bảo quản với tủ lạnh âm sâu (200C ± 50C) kit có hạn sử dụng dụng lên đến năm Ngược lại, sở y tế địa phương, điều kiện bảo quản với tủ lạnh âm sâu sau rã đơng, kit bảo quản ngăn mát tủ lạnh thông thường với nhiệt độ 2-80C kit có hạn sử dụng tháng Ngoài ra, kết cho thấy không tiến hành làm tan đông đá lại kit lần Như vậy, có nhu cầu di chuyển xa kit hoạt động tốt sau (dù sau bảo quản điều kiện - 200C ± 50C 2-80C) cần tránh trường hợp tan đá đông đá lại nhiều lần làm kit khơng cịn cho kết xác 4.2.3 Đánh giá so sánh kit thực địa Phương pháp soi phân trực tiếp không phát trường hợp nhiễm GLĐR (0%) phương pháp qPCR LAMP cho kết giống 100% với trường hợp dương tính (1%) Xét tỉ lệ nhiễm giun lươn 300 mẫu thực địa chúng tơi tỉ lệ thấp nhiều so với kết nghiên cứu xã thị trấn huyện Đức Hòa tác giả Lê Đức Vinh (2017 – 2018) [25] 6,64% Sự khác biệt tỉ lệ do: tác giả Lê Đức Vinh sử dụng đồng thời nhiều kỹ thuật xét nghiệm phân (trong có kỹ thuật cấy phân), nghiên cứu tác giả tiến hành địa bàn khác, dẫn đến khác tính chất dịch tễ khu trú khác 22 thời điểm lấy mẫu cỡ mẫu lớn cỡ mẫu nghiên cứu nên đưa đến không tương đồng tỉ lệ nhiễm giun lươn Chúng tơi tìm kit sẵn có chưa có kit LAMP chẩn đốn GLĐR thị trường Vì vậy, chúng tơi so sánh kit LAMP nghiên cứu với kết ứng dụng mồi LAMP chẩn đoán GLĐR tác giả Perdro- Fernandez- Soto cs công bố tạp chí Plos Neglected tropical diseases năm 2016 [86] Hệ số Kappa 0,92 chứng tỏ kit LAMP phù hợp cao với mồi công bố Perdro, đáp ứng tiêu chuẩn độ tin cậy để sử dụng cho nghiên cứu đánh giá áp dụng kỹ thuật LAMP Phụ lục 5, bảng 3.20 3.21 cho thấy khả phát chẩn đoán kit LAMP phù hợp thấp với phương pháp soi phân trực tiếp Như biết soi phân có độ nhạy thấp chẩn đốn giun lươn [31], LAMP đánh giá có độ nhạy cao Phụ lục 5, bảng 3.20 3.22 cho thấy khả phát chẩn đoán kit LAMP phù hợp với phương pháp ELISA Có 18 trường hợp dương tính với hai kỹ thuật LAMP ELISA Hai phương pháp sử dụng hai chế khác nên trường hợp kháng thể huyết ADN giun lươn phân không xuất song hành có kết khác kết ELISA LAMP 4.2.4 Kiểm định tiêu chuẩn sở kit Nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng tiêu chuẩn sở kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột, đạt yêu cầu số đề nghiên cứu chúng tơi đủ điều kiện để hướng đến triển khai rộng rãi thực địa 23 KẾT LUẬN 5.1 Xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người 5.1.1 Đã xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP chẩn đốn giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis gồm có bốn bước: - Bước 1: Thiết kế mồi đặc hiệu cho giun lươn đường ruột vùng gen 18S rRNA gồm mồi cụ thể là: + F3 (21 bp) có trình tự AGAGGGTTTAAACCAGACATT + B3 (22 bp) có trình tự CTTCGAACCTCTAACTTTCGTT + FIP (45 bp) có trình tự GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCAGGTCTAGCATGGAATAACACT + BIP (50 bp) có trình tự TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGACCTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC + LF (21 bp) có trình tự GGTCTAGCATGGAATAACACT + LB (24 bp) có trình tự GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCA - Bước 2: Các điều kiện phản ứng tối ưu hóa sau: + Nhiệt độ bắt cặp mồi 630C + Thời gian phản ứng 60 phút + Nồng độ Mg2+ 8mM + Chỉ thị màu sử dụng xanh malachit 0,004% - Bước 3: Xác định ngưỡng phát LOD 95% kit 2,12x100 gen/µL - Bước 4: Chế tạo chứng dương cách tạo plasmid tái tổ hợp mang vùng trình tự bảo tồn gen 18S rRNA giun lươn đường ruột sử dụng vector tách dịng pUC19 5.1.2 Từ quy trình trên, chúng tơi chế tạo thành cơng kit LAMP chẩn 24 đốn giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis quy mơ phịng thí nghiệm với số lượng 2000 test 5.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định kit phịng thí nghiệm thực địa - Bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột nghiên cứu có độ nhạy 96,88% (CI 95%: 83,78% - 99,92%), độ đặc hiệu 97,00% (CI 95%: 91,48%-99,38%) với phương pháp tham chiếu qPCR - Bộ kit hoạt động ổn định sau 12 tháng bảo quản -200C ±50C tháng sau mở nắp điều kiện bảo quản 2-80C - Đánh giá kit thực địa (300 mẫu): tương đồng 100% với qPCR - So sánh kit với mồi có mục đích (bộ mồi Perdro- FernandezSoto cs) có kết hệ số tương đồng K = 0,91, chứng tỏ phù hợp cao - Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế thẩm định kết luận tiêu chuẩn sở kit đạt yêu cầu theo công bố KIẾN NGHỊ Căn vào kết nghiên cứu, đề tài có số kiến nghị sau đây: - Tiếp tục đánh giá kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis mẫu lâm sàng phạm vi rộng để khẳng định hiệu kit thực địa - Nghiên cứu cải tạo cách thức đóng gói kit để phù hợp với yêu cầu đơn vị sử dụng - Đăng ký sở hữu trí tuệ cơng nghệ để sản xuất kit cung cấp cho bệnh viện tuyến tỉnh, tuyến huyện sở nghiên cứu, giảng dạy nước DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 1.Trần Thị Kim Chi, Nguyễn Thị Hương Bình, Trần Xuân Mai CS (2021), “Xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đốn giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người”, Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số /2021 Trần Thị Kim Chi, Nguyễn Thị Hương Bình, Trần Xuân Mai CS (2021), “Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu Kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người”, Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số /2021 ... ? ?Nghiên cứu chế tạo kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) người 2017- 2020? ?? với mục tiêu: Xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường. .. dựng quy trình chế tạo kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người 5.1.1 Đã xây dựng quy trình chế tạo kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột Strongyloides... Đây nghiên cứu nghiên cứu xây dựng kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis Việt Nam Trong bối cảnh giới chưa có kit LAMP chẩn đốn nhiễm giun lươn thương mại hóa, việc chế