Xác định hàm lượng vitamin c bằng thuốc thử 2,6 diclophenolindophenol

Lời cảm ơn Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cô giáo Võ Thị Hoà đà tận tình h-ớng dẫn, giúp đỡ em qúa trình chọn thực đề tài Em xin cảm ơn ban chủ nhiệm Khoa Hoá - Tr-ờng Đại Học Vinh, thầy cô giáo, cán khoa, tổ môn Hoá Phân Tích, Phòng thí nghiệm hoá phân tích đà tạo điều kiện thuận lợi để em thực tốt đề tài này! Em xin gửi tới thầy cô lời cảm ơn chân thành Sinh Viên: Lê Thị Sen Lớp B2 - K41 - Khoa Hoá - Đại Học Vinh Khoá luận tốt nghiệp Lời mở đầu Đà từ lâu ng-ời ta biết đ-ợc thức ăn bao gồm chất dinh d-ỡng: protit, gluxit, lipit số muối khoáng Nh-ng sau ng-ời ta thÊy mét sè bƯnh g©y thiÕu mét chất thức ăn, vitamin (theo tiÕng La Tinh: Vita lµ sù sèng, vitamin lµ amin sống) Vitamin chất hữu có chất hoá học rât khác nhau, mà cần l-ợng nhỏ thức ăn ng-ời ®éng vËt bËc cao cịng ®đ ®¶m b¶o sù sinh tr-ởng phát triển bình th-ờng thể Nh-ng với l-ợng bé nh- chúng chất cung cấp l-ợng Ngày ng-ời ta đà rõ vai trò xúc tác vitamin trình biến đổi thể Theo y học, loại vitamin cần thiết cho hoạt động sống thể nào, làm xúc tác cho trình sinh hoá, gắn liền với việc giải phóng l-ợng, tham gia phản ứng tế bào Việc cung cấp không đầy đủ vitamin cho thể ảnh h-ởng xấu làm việc hệ thần kinh mà loạt quan khác bên thể Vì điều quan trọng phần ăn ng-ời phải có giá trị hoàn chỉnh ph-ơng diện calo, ph-ơng diện chất đạm mà ph-ơng diện vitamin Đối với vitamin C nói riêng có vai trò quan trọng, có vị trí đặc biệt lich sư cđa häc thut vỊ vitamin ThiÕu vitamin C thể bị bệnh hoại huyết, ảnh h-ởng tiêu cực đến tự vệ thể với bệnh nhiễm trùng khác Cơ thể hoàn toàn không tự tổng hợp đ-ợc vitamin C mà phải lấy từ nguồn thức ăn vào Vì việc phân tích vitamin C thực phẩm điều cần thiết Tuy nhiên hợp chất hữu thuộc đối t-ợng khó phân tích, mẫu phân tích tồn nhiều chất hữu vô dạng khác nhau, gây cản trở cho trình định l-ợng Do cần phải lựa chọn Lê Thị Sen Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp ph-ơng pháp phân tích hữu hiệu Có thể phân tích vitamin C ph-ơng pháp: sắc ký giấy, cực phổ, trắc quang, hóa học Trong ph-ơng pháp cực phổ ph-ơng pháp đặc tr-ng nhất, đ-ợc dùng nhiều thực tế để định l-ợng hàng loạt Ph-ơng pháp cực phổ đáp ứng đ-ợc yêu cầu phân tích hợp chất vô cơ, hữu với hàm l-ợng nhỏ, xác Tuy nhiên điều kiện phòng thí nghiệm ch-a đáp ứng đ-ợc nên không sử dụng đ-ợc ph-ơng pháp có -u điểm rõ rệt Khi định l-ợng vitamin C ph-ơng pháp trắc quang ng-ời ta sử dụng số thuốc thử vô nh-: axit photphovonframic, muèi titan (IV), axit photphomolipdic c¸c ph-ơng pháp th-ờng gặp khó khăn phân tích hàm l-ợng vitamin C hoa quả, dịch th-ờng có màu có chứa nhiều thành phần khử khác gây cản trở cho trình định l-ợng Để khắc phục số nh-ợc điểm đó, đề tài chọn thuốc thử 2,6 - diclophenolindophenol để định l-ợng axit ascorbic Với cách đặt vấn đề nh- nhiệm vụ đề tài gồm: - Xác định hàm l-ợng vitamin C n-ớc cam ép nguyên chất đóng hộp (nhập từ Ôxtrâylia) ph-ơng pháp chuẩn độ oxy hoá- khử (ph-ơng pháp phân tích thể tích) - Tìm điều kiện tối -u cho phép định l-ợng ph-ơng pháp đo quang - Thử điều kiện tối -u đà chọn vào việc phân tích mẫu tự tạo - Phân tích hàm l-ợng vitamin C n-ớc cam ép nguyên chất đóng hộp số hoa có bán thị tr-ờng thành phố Vinh - Kiểm tra, đánh giá ph-ơng pháp điều kiện phân tích với trình thực kết thu đ-ợc, hy vọng luận văn góp phần bổ sung, hoàn thiện ph-ơng pháp phân tích vitamin C nhiều đối t-ợng khác nh- n-ớc ép trái nguyên chất đóng hộp số hoa có bán thị tr-ờng Lê Thị Sen Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp phần I Tổng quan tài liệu I - Giíi thiƯu vỊ Vitamin C - L-ỵc sư [1] Bệnh Scocbut chất gây bệnh đà đ-ợc biết từ kỷ XI - XII Nh-ng tới Holst nghiên cứu kỹ chế tác dụng nguyên nhân gây bệnh, Zilva tách đ-ợc chất từ chanh, cam hiểu biết sử dụng chất có sở chắn Năm 1920 Đrumlnond đặt tên chất vitamin C Vài năm sau, Her - Bert Hirst Karrer tách đ-ợc vitamin C từ th-ợng thận Năm 1933 Funk Reichstein, Haworth tổng hợp đ-ợc vitamin C Ngày ng-ời ta biết vitamin C có tự nhiên d-ới dạng: khử (axit L Ascorbic) dạng oxy hoá (axit dehydroascorbic), dạng sau Cả hai dạng tan n-ớc, dễ bị phân huỷ tiếp xúc với chất oxy hóa bazơ So với vitamin khác vitamin C chất dạng phức hợp với Nucleotit Coenzym Hiện ng-ời ta điều chế vitamin C tổng hợp rẻ nhiều so với ph-ơng pháp điều chế từ thực vật - Vai trò Vitamin C đời sèng ng-êi [1, 2, 3] Vitamin C cã vÞ trí đặc biệt lịch sử học thuyết vitamin Vitamin C tham gia vào trình oxy hoá - khử khác thể Nó xúc tác cho chuyển hóa nhiều hợp chất thơm thành dạng Phenol t-ơng ứng Ví dụ: Quá trình hydroxyl hoá triptophan thành hydroxytriptophan, phenylalanin chuyển thành tirozin Phản ứng chuyển amin hoá tirozin axit - xetoglutaric tạo nên sản phẩm axit para oxyphenylpiruvic thùc hiƯn víi sù tham gia cđa vitamin C Ngoµi vitamin C tham gia điều hoà tạo ADN từ ARN chuyển procolagen thành colagen Nhờ trình hyđroxyl hoá prolin tạo nên chất oxyprolin cần thiết cho tổng Lê Thị Sen Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp hợp colagen Chính có tác dụng làm cho vết th-ơng chóng liền sẹo vitamin C liên quan với hình thành hormon tuyến giáp tràng tuyến thận Nó cần thiết cho thể để tăng sức đề kháng chống lại t-ợng choáng ngộ độc hoá chất nh- độc tố vi trïng Ng-êi ta còng chøng minh r»ng vitamin C có liên quan tới trao đổi gluxit thể Vì bị bệnh hoại huyết trao đổi gluxit tim bị rối loạn phân giải glicogen glucoza tăng lên mạnh, đồng thời tăng tích luỹ axit lactic Hiện t-ợng biến nhanh chóng thêm vitamin C vào chất dinh d-ỡng Khi thiÕu vitamin C thùc phÈm th× ng-êi ta sÏ bị bệnh hoại huyết Vì bệnh hoại huyết phát triển từ từ nên việc chuẩn đoán trạng thái thiếu vitamin C khó khăn Bệnh thiếu vitamin C đ-ợc đặc tr-ng giảm tính chịu đựng thể bệnh nhiễm trùng khác Bệnh nhân chóng mệt hay đau đầu luôn trạng thái mộng mị, ăn ngon Sau nhịp đập tim bị rối loạn, thành mao quản trở nên mỏng manh dễ bị đứt, xảy tr-ờng hợp chảy máu tự phát Khi bị bệnh thiếu vitamin C, tr-ờng hợp có tác động nhẹ học gây t-ợng chảy máu quan bên Trong bệnh thiếu vitamin C kèm theo thay đổi đặc tr-ng x-ơng răng: Răng tự phân hủy rụng nhanh Bệnh thiếu vitamin C đ-ợc gọi bệnh scobut Những rối loạn việc tổng hợp chất colagen sở t-ợng Điều gây nên thay đổi bệnh lý thành mao quản mô chống đỡ Hàng thể cần l-ợng vitamin C nhiều loại vitamin khác Nhu cầu vitamin C thay đổi theo tuổi, khí hậu lao động Ng-ời lớn ngày cần khoảng 50 - 100mg Đối với phụ nữ có thai trẻ ngày cần 100 - 200mg Tóm lại vitamin C cần thiết thể ng-ời Tuy nhiên thể hoàn toàn tự tổng hợp đ-ợc vitamin C, mà phải lấy từ nguồn thức ăn bên Vậy vitamin C thiên nhiên tồn đâu? Lê Thị Sen Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp - Các nguồn Vitamin C thiên nhiên [1, 2, 3, 4] Vitamin C tồn thiên nhiên d-ới dạng phổ biến axit ascorbic (dạng khử); axit dehydroascorbic (dạng oxy hoá) ascorbigen (dạng kết hợp) Vitamin C có nhiều loại rau nh-: Cam, chanh, dâu, ớt, rau cải, cà chua Còn loại hạt ngũ cốc trứng, thịt hầu nh- vitamin C Hàm l-ợng vitamin C biến đổi nhiều phụ thuộc vào loài, vị trí trồng trọt yếu tố nh- độ chiếu sáng, khí hậu Bình th-ờng l-ợng vitamin C giảm dần từ phía vỏ vào bên ruột vitamin C xuất hầu hết phận mầm gặp nhiều họ: đơn, thông, cải, gặp họ: cúc, trạch, tả .4 - Công thức hoá học: 4.1 - Axit L - Ascorbic - Công thức phân tử: - Công thức cấu t¹o C H8 O6 O C C OH O C H C HO C OH H CH2OH Tên thông th-êng: Axit ascorbic; vitamin C; cevitamin axit; hexuromic axit - Tên hoá học: L () Threo - 2, 3, 4, 5, Pentahydroxyl - hexanoic - axit - - Lactone Lê Thị Sen Lớp: 41B2 Khoá luận tèt nghiÖp 4.2 - Axit L - dehydroascorbic: - Axit L - dehydroascorbic gọi vitamin C2 - Công thức phân tử: C6H606 - Công thức cấu tạo: O C C O O C H C HO C O H CH2OH - Đây dạng oxy hoá - Ph-ơng pháp điều chế [5] Ngày ng-ời ta điều chế vitamin C đ-ờng tổng hợp hoá học, ph-ơng pháp rẻ nhiều so với ph-ơng pháp điều chế vitamin C từ thực vật Nguyên liệu D - glucose Hydrogen ho¸ D - glucose (1) víi xúc tác Cu - Cr đ-ợc D - sorbitol (2) Trong dung dịch n-ớc, D - sorbitol d-ới tác dụng cđa vi khn Acetobacter suboxydans t¹o L - sorbose (3) Ng-ng tơ (3) víi axeton víi xóc t¸c axit sunfuric tạo diaxeton sorbose (4) Oxy hoá (4) kalipermanganat tạo (5); thuỷ phân (5) tạo axit ceto L gulonic (6) Este hoá (6) methanol, sau cho tác dụng với natri methoxyd tạo (7) Thuỷ phân (7) dung dịch axit hydrocloric n-ớc loại nhóm methyl natri, lacton hoá tạo axit ascorbic (8): CHO CH2OH CH2OH CHOH CHOH C=O H2 HOCH A Suboxydans HOCH HOCH CHOH CHOH CHOH CHOH CH2OH CH2OH (1) Lê Thị Sen CHOH HOCH CH2OH (2) (3) Líp: 41B2 Kho¸ ln tèt nghiÖp H3 C CH3 H3 C CH3 C H O C O H O O H2 O KMnO4 H H O H2)HH2O O H2C H2 C COOH CH2OH O O H O C O H C H3 C CH3 H3C (4) CH3 (5) O COOH + H2 O COOCH CH3OH + HCl C=O C HCl HOC C OH Sau ®ã CH3ONa HO - CH CH OH HO - CH CH2OH (6) O NaOC CHOH HOCH CH2OH (7) C H C HO C OH H CH2OH (8) - TÝnh chÊt cña vitamin C [3, 4] 6.1 - Lý tính Axit L - ascorbic(C6H8O6) kết tinh hình mÃnh, không màu, vị chua Nóng chảy nhiệt độ 190C đến 192C, tan hoµn toµn H2O (1g 3ml n-íc, 50ml cồn) Không tan benzen; clorofoc; ete mỡ trạng thái khô, vững bền không khí, dạng dung dịch nhanh Lê Thị Sen Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp chóng bị phân huỷ có không khí, đặc biệt môi tr-ờng kiềm Đây chất có hoạt tính quang học []D20 = + 23 (trong H2O) .6.2 - Ho¸ tÝnh VỊ ho¸ tính, hoá tính chức lacton, nhóm hydroxyl Song quan trọng hoá tính nhóm endiol Nhóm gây tính axit tính khư cđa axit ascorbic .6.2.1 - TÝnh axit Do hiƯu ứng liên hợp với nhóm cacbonyl nên nguyên tử hydro nhóm hydroxyl vị trí số trở nên linh động làm cho vitamin C có tính axit mạnh Vì vitamin C có tên axit ascorbic ↷O ↷ H O: OH Do cã tÝnh axit m¹nh nên axit ascorbic dễ tan dung dịch kiềm cịng nh- cacbonat kim lo¹i kiỊm øng dơng tÝnh chÊt này, ng-ời ta điều chế muối ascorbat natri để pha dung dịch tiêm có nồng độ cao trung tính Tác dụng với muối kim loại cho muối Nhiều d-ợc điển dùng thuốc thử sắt (II) sunfat sắt (III) clorua để định tính ascorbic Ph-ơng trình phản øng: CH2OH CH2OH HOCH HOCH O O O HO Lª Thị Sen + NaHCO3 Sau + FeSO4 OH O Fe² O OH Líp: 41B2 + Kho¸ ln tốt nghiệp 6.2.2 - Tính khử đặc tính b¶n cđa Axit ascorbic Axit ascorbic cịng nh- tÊt c¶ endiol có tính chất khử mạnh bị oxy hoá phản ứng thuận nghịch thành axit dehydroascorbic Có thể dùng thuốc thử sau để oxi hoá: oxy, dung dịch iôt; 2,6 diclophenolindophenol; xanh metylen; kaliferixianua Tốc độ oxy hoá môi tr-ờng phụ thuộc vào pH, pH cực đại 5,0; với phản ứng có bazơ, pH cực đại 11,5 Trong môi tr-ờng kiềm phản ứng oxi hoá xảy nhanh môi tr-ờng axit Các tác nhân xúc tác oxy hoá là: ánh sáng, nhiệt độ, chất kiềm, enzym vết đồng hay sắt Sự oxy hoá khử thuận nghịch axit ascorbic thành axit dehydroascorbic O O C C C OH [O] C=O O C H C HO C OH O [H] C=O H H C HO C H CH2OH CH2OH Axit ascorbic Axit dehidroascorbic TÝnh chất vô quan trọng tác dụng sinh học axit Trong thể, axit ascorbic cho hai nguyên tử hydro (là chất cho) để tạo thành axit dehydroascobic; dạng này, nhận hai nguyên tử hydro (là chất nhận) để trë l¹i axit ascorbic Nh- vËy axit ascorbic tham gia vận chuyển hydro tức tham gia vào hệ enzym xúc tác trình oxy hoá khử xảy thể Lê Thị Sen Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp Bảng 8: Khảo sát phụ thuộc A vào thời gian đo Vdd (ml) Vdd(ml) Thời gian đo Axit ascorbic chất màu (phút) 5,00 2,00 0,329 5,00 2,00 0,331 5,00 2,00 10 0,331 5,00 2,00 20 0,331 5,00 2,00 30 0,331 5,00 2,00 40 0,331 5,00 2,00 50 0,331 5,00 2,00 60 0,330 MÉu sè A b NhËn xÐt: Trong kho¶ng thêi gian tõ 5-50 phút mát giá trị mật độ quang Nh- màu môi tr-ờng xylen bền vững, không cần đo vội vàng, quan trọng lắc liên tục từ thể tích nh- tiến hành chiết l-ợng thừa chất màu vào lớp xylen 2.6 Xây dựng đ-ờng chuẩn a Cách tiến hành: Cho vào bình định mức 25ml lần l-ợt từ 1-12ml dung dịch axit ascorbic chuẩn, thêm vào bình 5ml dung dịch đệm axetat pH = 4; 2ml dung dịch chất màu, định mức đến vạch n-ớc cất Cho vào phễu chiết dung tích 125ml, sau cho vào 10ml xylen, đậy phễu chiết lắc phần chất màu thừa không bị khử vào lớp xylen Để yên cho t-ớng phân lớp, tiến hành chiết Chuyển lớp xylen vào bình định mức 25ml định mức đến vạch xylen Tiến hành đo mật độ quang máy so màu ta thu đ-ợc kết bảng sau: Lê Thị Sen 35 Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp Bảng 9: Khảo sát phụ thuộc A vào hàm l-ợng dung dịch chuẩn Vdd (ml) Vdd (ml) Hàm l-ợng Axit ascorbic Chất mµu (mg)axit ascorbic 1,00 2,00 0,0250 0,390 2,00 2,00 0,0500 0,375 3,00 2,00 0,0750 0,361 4,00 2,00 0,1000 0,345 5,00 2,00 0,1250 0,331 6,00 2,00 0,1500 0,317 8,00 2,00 0,2000 0,289 10,00 2,00 0,2500 0,260 12,00 2,00 0,3000 0,228 MÉu sè A b Nhận xét: Khi hàm l-ợng ascorbic lớn 0,25mg giá trị mật độ quang không thuân theo định luật Bughe-Lambe-Bia Từ giá trị thu đ-ợc bảng ta xây dựng đồ thị biểu thị phụ thuộc mật độ quang vào hàm l-ợng axit ascorbic nh- sau: A 0,400 0,45 0,4 0,350 0,35 0,3 0,300 0,25 East 0,2 0,250 0,15 0,1 0,200 0,05 0,05 0,10 0,15 0,03 0,08 0,13 Lê Thị Sen 0,20 0,25 0,30 0,2 0,3 36 C Líp: 41B2 Kho¸ ln tèt nghiệp Xác định hàm l-ợng vitamin C mẫu tự tạo ph-ơng pháp đo quang Để có sở chắn, khoa học để áp dụng ph-ơng pháp phân tích điều kiện tối -u đà chọn Tr-ớc phân tích hàm l-ợng vitamin C mẫu n-ớc ép trái đóng hộp hoa quả, thử nghiệm xác định hàm l-ợng vitamin C mẫu tự tạo 3.1 Chuẩn bị mẫu: Cân xác cân phân tích 25,0 mg axit ascorbic tinh khiÕt vµ hoµ tan HPO3 6%, pha lo·ng thµnh 1000ml Dung dịch thu đ-ợc có hàm l-ợng vitamin C 0,025 mg/ml 3.2 Cách tiến hành: Hút 5ml dung dịch axit ascorbic chuẩn đà pha cho vào bình định mức 25ml Thêm 5ml dung dịch đệm axetat pH = 4; 2ml dung dịch chất màu, định mức đến vạch n-ớc cất Cho vào phễu chiết dung tích 125ml, sau cho vào 10ml xylen, đậy phễu chiết lắc phần chất màu thừa không bị khử vào lớp xylen Để yên cho t-ớng phân lớp, tiến hành chiết Chuyển lớp xylen vào bình định mức 25ml định mức đến vạch xylen Tiến hành đo mật độ quangổ b-ớc sóng = 490nm Ta thu đ-ợc kết bảng sau: Bảng 10: Hàm l-ợng xác Hàm l-ợng Độ tin cậy TT định đ-ợc (mg/ml) 24,94 10-3 24,92 10-3  X q%   X 100 t(TN) |t(TN)(-0,333)| 24,92 10-3 0,035.10-3 0,14 < |tb,k(4,30)| 24,90 10-3 S.S ngẫu nhiên Bằng ph-ơng pháp toán học thống kê đà tiến hành so sánh giá trị xác định đ-ợc với giá trị cho tr-ớc (a = 25 10 -3) Sự sai khác Lê Thị Sen 37 Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp X a nguyên nhân ngẫu nhiên Điều cho phép áp dụng ph-ơng pháp đo quang để phân tích hàm l-ợng vitamin C dịch với điều kiện tối -u nhận đ-ợc dung môi, pH b-ớc sóng Tiến hành xác định hàm l-ợng vitamin C n-ớc ép trái nguyên chất đóng hộp số hoa có bán thị tr-ờng thành phố Vinh 4.1 Xác định hàm l-ợng vitamin C số n-ớc ép trái nguyên chất đóng hộp (nhập từ Ôxtrâylia) 4.1.1 Xử lý mẫu: Lấy xác 50ml n-ớc cam ép nguyên chất đóng hộp (nhập từ Ôxtrâylia) với hàm l-ợng vitamin C ghi nhÃn 80mg/1 chai lít Cho vào bình định mức 100ml định mức đến vạch HPO 6% lắc lọc dịch phễu thuỷ tinh xốp 4.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh h-ởng đến trình định l-ợng ph-ơng pháp chiết indophenol-xylen a ảnh h-ởng dịch chiết có màu: Nhận thấy dịch chiết thu đ-ợc có màu Vì để định l-ợng vitamn C ph-ơng pháp chiết indophenol-xylen, tr-ớc hết phải xem dịch lọc có màu có chiết đ-ợc xylen không Thí nghiệm cách trộn 5ml dịch chiết axit thu đ-ợc với 5ml đệm chiết víi 10ml xylen Chun líp xylen vµo cuvÐt vµ tiÕn hành đo mật độ quang ta thu đ-ợc giá trị D ~ Nh- dịch chiết có màu không chiết đ-ợc xylen, ta áp dụng ph-ơng pháp để định l-ợng vitamin C số dịch có màu b ảnh h-ởng số tạp chất khử: Khi định l-ợng vitamin C dịch th-ờng gặp chất cản trở Bằng ph-ơng pháp sắc ký giấy với hệ dung môi là: n-butanol-axit axeticn-ớc (4:1:5) phát dung dịch 2,6-diclophenolindophenol Lê Thị Sen 38 Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp Ng-ời ta xác định đ-ợc thành phần cản trở hợp chất thuộc loại sunfhydrin chất có tính khử khác Đây tạp chất có tính khử với chất màu 2,6-diclophenolindophenol Tuy nhiên màu axit ascorbic thực tế xảy tức thời, màu tạp chất có tính khử phần nhiều chậm Do loại trừ ảnh h-ởng chất khử cách chiết l-ợng thừa chất màu 2,6 điclophenolinđophenol ch-a bị khử môi tr-ờng phản ứng axit xylen Vậy thời gian thích hợp để chiết l-ợng thừa chất màu vào môi tr-ờng xylen bao nhiêu? Để khoảng thời gian tạp chất khử ch-a phản ứng với 2,6-diclophenolindophenol c Khảo sát khoảng thời gian thích hợp để chiết l-ợng thừa chất màu vào môi tr-ờng xylen, tạp chất khử ch-a phản ứng với 2,6diclophenolindophenol Tiến hành cách: Hút 5ml dịch thu đ-ợc cho vào bình định mức 25ml, thêm 5ml dung dịch đệm, 2ml chất màu thêm n-ớc vạch Tiến hành đo mật độ quang dung dịch máy so màu, sau đo giá trị mật độ quang mốc thời gian khác ta thu đ-ợc kết bảng sau: Bảng 11: Khảo sát phụ thuộc l-ợng chất mµu thõa vµo thêi gian Vdd (ml) Vdd (ml) Thêi gian Axit ascorbic Chất màu (giây) 5,00 2,00 0,330 5,00 2,00 10 0,331 5,00 2,00 20 0,331 5,00 2,00 40 0,331 5,00 2,00 60 0,331 5,00 2,00 80 0,325 Lần đo Lê Thị Sen 39 A Líp: 41B2 Kho¸ ln tèt nghiƯp NhËn xét: Từ 10-60 giây giá trị mật độ quang không thay đổi Sau phút giá trị mật độ quang bắt đầu giảm xuống tạp chất khử đà bắt đầu phản ứng với 2,6-diclophenolindophenol Nh- khoảng thời gian thích hợp để chiết l-ợng thừa 2,6-diclophenolindophenol ch-a bị khử môi tr-ờng phản ứng axit xylen từ 10-60 giây 4.1.3 Tiến hành định l-ợng Cho vào bình định mức 25ml, bình 5ml dịch lọc thêm vào 5ml dung dịch đệm axetat pH = 2ml dung dịch chất màu 2,6 diclophenolindophenol, thêm n-ớc cất vạch Cho nhanh vào phễu chiết dung tích 125ml, sau cho vào 10ml xylen, đậy phễu chiết lắc khoảng thời gian từ 15-20 giây (cần thời gian chiết khoảng phút để loại trừ ảnh h-ởng thành phần khử khác có phản ứng với chất màu nh-ng chậm axit ascorbic) Để yên cho t-ớng phân lớp, tiến hành chiết Chuyển lớp xylen vào bình định mức 25ml định mức đến vạch xylen Tiến hành đo mật độ quang b-ớc sóng = 490nm Ta thu đ-ợc kết bảng sau: Bảng 12: Lần Mẫu m Độ tin cậy vitamin C (mg/ml)   X A ®o N-íc m(mg/ml) q%  0,346 0,0201 0,347 0,0198 0,348 0,0195 100 tTN  X a SX |tTN(-1.154)| < cam 0,0198 7,44x10-4 3,75 |tp,k (4,30)| sai sè Ðp ®ãng hép ngẫu nhiên 4.1.4 Xử lý kết thảo luận: Bằng ph-ơng pháp toán học thống kê tiến hành so sánh giá trị xác định đ-ợc với giá trị cho tr-ớc (đ-ợc coi giá trị chuẩn a, a = 0,02mg/ml) Sự sai khác m axit nguyên nhân ngẫu nhiên Lê Thị Sen 40 Líp: 41B2 Kho¸ ln tèt nghiƯp VËy chóng ta cã thể áp dụng ph-ơng pháp để xác định hàm l-ợng vitamin C n-ớc ép trái nguyên chất đóng hộp 4.2 Xác định hàm l-ợng vitamin C số loại 4.2.1 Xử lý mẫu: Nghiền nhỏ nhanh chóng l-ợng cần thử (cam H-ơng Sơn, cam Nghĩa Đàn) cối sứ môi tr-ờng axit HPO 6% Cân 10g bột nghiền chuyển vào bình định mức 100ml làm đầy HPO 6% Lọc dịch phễu thuỷ tinh xốp 4.2.2 Tiến hành định l-ợng a Mẫu cam ngày đầu: Cho vào bình định mức 25ml, bình 5ml dịch cam H-ơng Sơn pha trên, thêm vào 5ml dung dịch đệm axetat pH = 2ml dung dịch chất màu 2,6-diclophenolindophenol thêm n-ớc cất vạch Cho nhanh vào phễu chiết dung tích 125ml, sau cho vào 10ml xylen, đậy phễu chiết lắc khoảng thời gian từ 15-20 giây (cần giữ thời gian chiết khoảng phút để loại trừ ảnh h-ởng thành phần khử khác có phản ứng với chất màu nh-ng chậm axit ascorbic) Để yên cho t-ớng phân lớp, tiến hành chiết Chuyển lớp xylen vào bình định mức 25ml định mức đến vạch xylen Tiến hành đo mật độ quang b-ớc sóng = 490nm Ta thu đ-ợc kết bảng (13) Làm thí nghiệm t-ơng tự nh- với dịch cam Nghĩa Đàn ta thu đ-ợc giá trị mật độ quang (ở bảng 14) b Mẫu cam để ngày sau phá mẫu: Cho vào bình định mức 25ml, bình 5ml dịch cam H-ơng Sơn đà qua ngày xử lý, thêm vào 5ml dung dịch đệm axetat pH = 4, 2ml dung dịch chất màu 2,6-diclophenolindophenol, thêm n-ớc cất vạch Cho nhanh vào phễu chiết dung tích 125ml, sau cho vào 10ml xylen, đậy phễu chiết lắc khoảng thời gian từ 15-20 giây (cần thời gian chiết khoảng phút để loại trừ ảnh h-ởng thành phần khử Lê Thị Sen 41 Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp khác có phản ứng với chất màu nh-ng chậm axit ascorbic) Để yên cho t-ớng phân lớp, tiến hành chiết Chuyển lớp xylen vào bình định mức 25ml định mức đến vạch xylen Tiến hành đo mật độ quang phổ b-ớc sóng = 490nm Ta thu đ-ợc kết bảng (13) Làm thí nghiệm t-ơng tự nh- với dịch cam Nghĩa Đàn ta thu đ-ợc giá trị mật độ quang (ở bảng 14) Bảng 13: Mẫu số Ngày đầu Sau ngày Vdd (ml) Vdd (ml) Cam ChÊt mµu 5,00 2,00 0,289 5,00 2,00 0,288 5,00 2,00 0,286 5,00 2,00 0,349 5,00 2,00 0,349 5,00 2,00 0,348 Lần đo A Bảng 14: Mẫu số Ngày đầu Sau ngày Lê Thị Sen Vdd (ml) Vdd (ml) Cam Chất màu 5,00 2,00 0,313 5,00 2,00 0,314 5,00 2,00 0,311 5,00 2,00 0,351 5,00 2,00 0,349 5,00 2,00 0,352 Lần đo 42 A Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp 4.1.3 Xử lý kết thảo luận a Xử lý kết Mẫu cam H-ơng Sơn: Bảng 15: Kết phân tích hàm l-ợng vitamin C mẫu cam H-ơng Sơn Mẫu số Ngày đầu Sau ngày m(mg/100g) Lần đo A 0,289 39,9800 0,288 40,0000 0,287 40,0800 0,349 19,0600 0,349 19,0600 0,348 19,0900 vitamin C m  40,02 0,1310 19,07 0,0430 Bảng 16: Kết phân tích hàm l-ợng vitamin C Mẫu cam Nghĩa Đàn Mẫu số Ngày đầu Sau ngày m(mg/100g) Lần đo A 0,313 31,2500 0,314 31,2400 0,311 31,2900 0,351 18,4500 0,350 18,4200 0,352 18,3600 vitamin C m  31,2600 0,065 18,4100 0,114 Sau ®o mËt ®é quang, từ giá trị thu đ-ợc ta đ-a lên đ-ờng chuÈn, tõ ®ã suy nång ®é axit ascorbic dịch cam Biết nồng độ ta tính đ-ợc hàm l-ợng vitamin C mẫu Kết thu đ-ợc Lê Thị Sen 43 Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp xử lý theo ph-ơng pháp toán thống kê b Thảo luận kết quả: Từ kết phân tích đ-ợc thấy hàm l-ợng vitamin C mẫu cam H-ơng Sơn nhiều hàm l-ợng vitamin C mẫu cam Nghĩa Đàn hàm l-ợng vitamin C giảm ®i rÊt nhiỊu nÕu ®Ĩ mÉu cam ®· ph¸ mÉu qua ngày nhiệt độ phòng Điều chứng tỏ dung dịch axit ascorbic dễ bị oxy hoá không khí Lê Thị Sen 44 Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp phần III Kết luận Đà tổng quan tầm quan trọng vitamin C, nguồn vitamin C thiªn nhiªn, tÝnh chÊt cđa vitamin C, ph-ơng pháp để định l-ợng vitamin C Đà chọn đ-ợc thuốc thử thích hợp có khả tham gia phản ứng oxy hoá-khử thuận nghịch với axit ascorbic 2,6-diclophenolindophenol xác định đ-ợc cực đại hấp thụ cđa chÊt mµu nµy ë b-íc sãng  b»ng 490nm Đà loại trừ đ-ợc ảnh h-ởng chất cản trở trình định l-ợng cách chiết l-ợng thừa chất màu 2,6- diclophenolindophenol môi tr-ờng phản ứng xylen Thời gian chiết thích hợp 1phút (tính từ lúc bắt đầu cho chất màu vào dung dịch phân tích) Đà tiến hành xác định đ-ợc hàm l-ợng vitamin C n-ớc cam ép nguyên chất đóng hộp (nhập từ Ôxtrâylia) cam (H-ơng Sơn, Nghĩa Đàn) có bán thị tr-ờng thành phố Vinh Và thu đ-ợc kết nhsau: - Hàm l-ợng vitamin C chai n-ớc cam ép nguyên chất đóng hộp: Theo ph-ơng pháp chuẩn độ oxy hoá 74 1,972 (mg) Theo ph-ơng pháp chuẩn độ trắc quang 79,2 2,976 (mg) - Hàm l-ợng vitamin C trong mẫu cam: Phân tích ngày đầu: Lê Thị Sen + Cam H-ơng Sơn: 40,02 0,131 (mg /100g) + Cam Nghĩa Đàn: 31,26  0,065 (mg /100g) 45 Líp: 41B2 Kho¸ ln tốt nghiệp Phân tích sau ngày phá mẫu: + Cam H-¬ng S¬n: 19,07  0,043 (mg /100g) + Cam Nghĩa Đàn: 18,41 0,114 (mg /100g) Do thời gian không cho phép nên tiến hành phân tích hàm l-ợng vitamin C dùng với thuốc thử khác nhau, ch-a xác định đ-ợc hàm l-ợng vitamin C số hoa khác Chúng hy vọng quy trình phân tích đ-ợc áp dụng để phân tích hàm l-ợng vitamin C loại hoa khác đặc biệt sử dụng để kiểm nghiệm hàm l-ợng vitamin C số loại n-ớc ép trái nguyên chất (nội nhập, ngoại nhập ) có bán thị tr-ờng Vì điều kiện có hạn nên ng-ời thực đề tài không tránh khỏi thiếu sót Rất mong đ-ợc góp ý bảo thầy cô giáo bạn sinh viên Lê Thị Sen 46 Lớp: 41B2 Khoá luận tốt nghiệp Tài liệu tham khảo Lê Văn Tri, Nguyễn Ngọc Do·n Sinh häc vitamin NXB KHKT, Hµ Néi 1987 Lê DoÃn Diễn, lê Duy Thuỵ, Mỹ Xuyến, Hoàng Văn Tuyên Vitamin đời sống NXB KHTK, Hà Nội.1978 Lê Ngọc Tú, Phạm Quốc Thắng, Lê DoÃn Diễn, Bùi Đức Hội, La Văn Chữ, Nguyễn Thị Thịnh Hoá sinh học công nghiệp NXB Đại học & THCN, Hà Nội 1974 Trần Thị Hoàng Ba, Vũ Thị Bảy, Nguyễn Kim Chi, DoÃn Huy Khắc, Nguyễn Quang Luân Định l-ợng vitamin NXB Y học Hà Nội, 1976 Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh Thí nghiệm hoá sinh công nghiệp Tr-ờng ĐH Bách khoa Hà Nội, Hà nội 1997 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị ¸ng Ho¸ sinh häc NXB Gi¸o dơc, Hµ Néi 1999 Nguyễn Hữu Chất Enzym xúc tác sinh học NXB Y học Hà Nội, 1983 Trần ích Hoá sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội Hồ Viết Quý Phân tích lý hoá NXB Giáo dục, Hà Nội 2000 10 Nguyễn Tinh Dung Hoá phân tích, T1, T2 NXB Giáo dục, Hà Nội 1991 11 Nguyễn Khắc Nghĩa áp dụng toán học thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm ĐH Vinh Lê Thị Sen 47 Lớp: 41B2 Kho¸ ln tèt nghiƯp Mơc lơc Trang Lêi më đầu Phần i Tổng quan tài liệu I Giíi thiƯu vỊ vitamin C L-ỵc sư Vai trò vitamin C đời sống ng-ời 3 Các nguồn vitamin C thiên nhiên Công thức hoá học 5 Ph-ơng pháp ®iỊu chÕ 6 TÝnh chÊt cđa vitamin C II Các ph-ơng pháp xác định vitamin C 10 Nhận xét chung 10 Định l-ợng axit ascorbic ph-ơng pháp vật lý 11 2.1 Ph-ơng pháp quang phổ 11 2.2 Ph-ơng pháp cực phổ 11 2.3 Ph-ơng pháp sắc ký 14 Định l-ợng axit ascorbic ph-ơng pháp hoá học 16 3.1 Định l-ợng ph-ơng pháp oxyhoá 16 3.2 Định l-ợng axit ascorbic ph-ơng pháp đo quang 19 III Đặc điểm thuốc thử hữu c¬ 2,6 - diclophenolindophenol 20 IV KÕt luËn 21 V Xử lý thống kê số liệu thực nghiệm 22 26 Phần ii: Thực nghiệm I Hoá chất, dụng cụ, máy móc 26 II Ph-ơng pháp pha chế dung dịch dùng cho phân tích 26 III Xác định hàm l-ợng vitamin C ph-ơng pháp chuẩn độ oxy hoá khử Lê Thị Sen 48 Lớp: 41B2 27 Khoá luận tốt nghiệp Nguyên tắc ph-ơng pháp 27 Chuẩn bị dung dịch phân tích 28 Cách tiến hành 28 Xử lý kết thảo luận 29 IV Xác định hàm l-ợng vitamin C ph-ơng pháp đo quang 29 Nguyên tắc ph-ơng pháp 29 Xác định điều kiện tối -u, xây dựng đ-ờng chuẩn 30 Xác định hàm l-ợng vitamin C mẫu tự tạo ph-ơng pháp đo quang 36 Xác định hàm l-ợng vitamin C n-ớc ép trái nguyên chất 38 đóng hộp số hoa có bán thị tr-ờng phố Vinh 45 Phần iii: Kết luận 47 Tài liệu tham khảo Lê Thị Sen 49 Lớp: 41B2 ... H 2C H2 C COOH CH2OH O O H O C O H C H3 C CH3 H 3C (4) CH3 (5) O COOH + H2 O COOCH CH3OH + HCl C= O C HCl HOC C OH Sau ®ã CH3ONa HO - CH CH OH HO - CH CH2OH (6) O NaOC CHOH HOCH CH2OH (7) C H C. .. dixetogulonic t? ?c dông sinh h? ?c O C COOH C= O O C= O + H2O C= O H C HO C C=O H H C OH HO C H CH2OH Axit dehydroascorbic CH 2OH Axit 2,3 - dicetogulonic II - C? ?c ph-ơng pháp x? ?c định Vitamin C: - NhËn xÐt chung:... ascorbic 2,6 - diclophenolindophenol O C Cl C OH O C + O = =N OH OH Cl H C HO C Dạng oxy hoá 2,6 – diclophenolindophenol c? ? mµu xanh H CH2OH Axit ascorbic O C Cl C O O C + HO NH OH O Cl H C HO