Nghiên cứu đặc tính cellulase từ vi khuẩn ruột mối

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI GV hƣớng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân SV thực hiện: Hồ Thị Ngọc - 1152043831 Cao Thị Miên - 1152040528 Lớp: 52K - CNTP Nghệ An - 5/2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Hồ Thị Ngọc - 1152043831 Cao Thị Miên - 1152040528 Khóa : 52K - CNTP Ngành : Công nghệ thực phẩm Tên đề tài: Nghiên cứu đặc tính cellulase từ vi khuẩn ruột mối Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: Cán hƣớng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 201 Ngày hoàn thành đồ án Ngày tháng năm 201 : Ngày tháng năm 201 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) Chủ nhiệm mơn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên hồn thành nộp đồ án vào ngày i tháng năm 201 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Hồ Thị Ngọc - 1152043831 Cao Thị Miên - 1152040528 Khóa : 52K - CNTP Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn : Cán duyệt ThS Đào Thị Thanh Xuân : Nội dung nghiên cứu, thiết kế Nhận xét cán hƣớng dẫn Ngày tháng năm 201 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Hồ Thị Ngọc - 1152043831 Cao Thị Miên - 1152040528 Khóa : 52K - CNTP Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn : Cán duyệt ThS Đào Thị Thanh Xuân : Nội dung nghiên cứu, thiết kế Nhận xét cán hƣớng dẫn Ngày tháng năm 201 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) iii Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân LỜI CẢM ƠN Chúng em xin chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Vinh tận tình hƣớng dẫn chúng em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Chúng em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy cô, cán hƣớng dẫn thí nghiệm phịng Hóa thực phẩm, phịng Hóa hữu cơ, phịng Hóa phân tích, Trung tâm kiểm định chất lƣợng thực phẩm Trƣờng Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ chúng em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Chúng xin gửi lời cám ơn chân thành tới bạn phịng thí nghiệm thực phẩm tạo điều kiện giúp đỡ chúng tơi hồn thành đồ án Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, ngƣời thân bạn bè động viên giúp đỡ suốt trình học tập làm đồ án tốt nghiệp SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên i Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU .vi TÓM TẮT ĐỒ ÁN viii LỜI MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu .2 Vật liệu, phạm vi nội dung nghiên cứu .2 CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Hệ enzym Cellulase .4 1.1.1 Định nghĩa .4 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm cấu tạo 1.1.4 Tính chất .6 1.1.5 Cơ chế tác dụng enzym cellulase 1.1.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng tới hoạt tính enzym 1.1.7 Trung tâm hoạt động enzym 1.2 Cellulose .10 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo 10 1.2.2 Dẫn cuất cellulose 12 1.3 Nguồn thu nhận enzym cellulase .13 1.4 Các phƣơng pháp tinh chế enzym 14 1.4.1 Phƣơng pháp kết tủa đẳng điện 15 1.4.2 Kết tủa phân đoạn muối trung tính (NH4)2SO4 để tách enzym 15 1.4.3 Kết tủa enzym dung môi hữu 15 1.4.4 Sử dụng chất trợ lọc (support) kết tủa enzym 16 1.4.5 Kết tủa polymer có khối lƣợng phân tử cao 16 1.4.6 Thay đổi thành phần hóa học môi trƣờng để làm enzym 16 1.4.7 Sắc ký lỏng cao áp .16 1.4.8 Sắc ký tƣơng tác ƣa béo .16 1.4.9 Phân tách lỏng - lỏng 17 1.5 Ứng dụng enzym cellulase 17 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên ii Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 1.5.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm 17 1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy 18 1.5.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .18 1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 19 1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu 20 1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .20 1.6 Tình hình nghiên cứu thu nhận enzym cellulase từ vi khuẩn ruột mối giới Việt Nam 20 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới .20 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam .22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu 23 2.2 Hóa chất thiết bị 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 25 2.3 Các môi trƣờng nuôi cấy 25 2.3.1 Môi trƣờng giữ giống D5 .25 2.3.2 Môi trƣờng nhân giống (LB lỏng khơng có CMC) .26 2.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy M3 26 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Xác định hoạt độ enzym cellulase phƣơng pháp Miller 26 2.4.2 Nghiên cứu tinh enzym cellulase phƣơng pháp kết tủa phân đoạn 29 2.4.3 Nghiên cứu đặc tính enzym cellulase 31 2.4.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất hoạt hóa chất kìm hãm enzym cellulase 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 3.1 Thu nhận enzym thô 34 3.2 Nghiên cứu tinh enzym cellulase phƣơng pháp kết tủa phân đoạn 35 3.2.1 Kết tủa Enzym cellulase muối (NH4)2SO4 bão hòa 36 3.2.2 Kết tủa Enzym cellulase acetone .36 3.2.3 Kết tủa Enzym cellulase cồn 37 3.2.4 So sánh độ tinh enzym tác nhân tinh 38 3.3 Nghiên cứu đặc tính enzym cellulase 39 3.3.1 Khảo sát nhiệt độ tối ƣu 39 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ ổn định 40 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên iii Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 3.3.3 Khảo sát pH tối ƣu 41 3.3.4 Khảo sát pH ổn định 42 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất hoạt hóa chất kìm hãm enzym 43 3.4.1 Ảnh hƣởng cation hóa trị II đến hoạt độ enzym 43 3.4.2 Ảnh hƣởng chất hoạt động bề mặt đến hoạt độ enzym 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .46 Kết luận 46 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên iv Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Aa : amino acid CMC : Carboxymethyl cellulose CMCase : Carboxymethyl cellulase DNS : 3,5-dinitro salicylic Dalton : Đơn vị khối lƣợng phân tử ĐVHT : Đơn vị hoạt tính EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid E : enzym HTR : Hoạt tính riêng SDS : Natri dodecyl sulfat UI : Unit International, đơn vị quốc tế SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên v Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xn DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU Trang Hình Hình 1.1 Enzym cellulose .4 Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian ba chiều enzym cellulase .6 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động exoglucanase Hình 1.4 Cơ chế hoạt động endoglucanase .7 Hình 1.6 Sơ đồ trung tâm hoạt động enzym Hình 1.7 Cấu trúc phân tử cellulose 10 Hình 1.8 Cấu trúc không gian phân tử cellulose 11 Hình 1.9 Carboxymethyl cellulose .12 Bảng Bảng 3.1 Nồng độ glucose xây dựng đƣờng chuẩn 34 Bảng 3.2 Mật độ quang xây dựng đƣờng chuẩn Albumin 35 Bảng 3.3 Tổng hoạt tính CMC enzym tinh muối (NH4)2SO4 36 Bảng 3.4 Tổng hoạt tính CMC enzym tinh acetone 37 Bảng 3.5.Tổng hoạt tính CMC enzym tinh cồn 38 Bảng 3.6 Kết tinh enzym với tác nhân tinh 39 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ tối ƣu tới hoạt độ enzym 39 Bảng 3.8 Khảo sát nhiệt độ ổn định 40 Bảng 3.9 Khảo sát pH tối ƣu .41 Bảng 3.10 Khảo sát pH ổn định 42 Bảng 3.11 Khảo sát cation hóa trị II 43 Bảng 3.12 Khảo sát chất hoạt động bề mặt 44 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên vi Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 3.2.1 Kết tủa Enzym cellulase muối (NH4)2SO4 bão hịa - Tiến hành tủa dịch chiết enzym thơ với muối (NH4)2SO4 bão hòa điều kiện lạnh nồng độ 60, 70, 80, 90% - Thu tủa hòa tan đệm citrate 0.05M pH = 4.8 đem xác định hoạt độ hàm lƣợng protein - Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.3 Tổng hoạt tính CMC enzym tinh muối (NH4)2SO4 Nồng độ muối bão hòa (%) 60 70 80 90 Enzym thô Tổng hoạt độ (UI/ml) 0.53 1.04 1.19 1.24 2.07 Hàm lƣợng protein (mg/ml) 1.16 1.61 1.76 1.80 25.05 Hoạt độ riêng (UI/mg) 0.15 0.65 0.67 0.71 0.08 Độ tinh 5.63 8.13 8.38 8.87 Hoạt độ lại (%) 25.60 50.24 57.48 59.90 100 Đồ thị 3.3 Hiệu suất hoạt tính cellulase với tác nhân (NH4)2SO4 Nhận xét: Với nồng độ muối (NH4)2SO4 nồng độ 90% ta thu đƣợc hoạt tính enzym cao 1.24 3.2.2 Kết tủa Enzym cellulase acetone - Tiến hành tủa dịch chiết enzym thô với aceton điều kiện lạnh nồng độ 60, 70, 80, 90% SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 36 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân - Thu tủa hòa tan đệm citrate 0.05M pH = 4.8 đem xác định hoạt độ hàm lƣợng protein Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.4 Tổng hoạt tính CMC enzym tinh acetone Nồng độ acetone (%) 60 70 80 90 Enzym thô Tổng hoạt độ (UI/ml) 0.65 1.32 1.56 1.73 2.07 2.35 4.16 4.60 4.90 25.05 Hoạt độ riêng (UI/mg) 0.29 0.32 0.34 0.35 0.08 Độ tinh 3.63 4.00 4.25 4.38 Hoạt độ lại (%) 31.40 63.77 75.36 83.57 100 Hàm lƣợng protein (mg/ml) Đồ thị 3.4 Hiệu suất hoạt tính cellulase với tác nhân acetone Nhận xét: Với nồng độ acetone 90% ta thu đƣợc hoạt tính enzym cao 1.73 3.2.3 Kết tủa Enzym cellulase cồn Việc tủa enzym cellulase cồn đƣợc thực tƣơng tự nhƣ tủa enzym cellulase acetone SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 37 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân  Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.5.Tổng hoạt tính CMC enzym tinh cồn 60 70 80 90 Enzym thô Tổng hoạt độ (UI/ml) 0.56 1.20 1.24 1.27 2.07 Hàm lƣợng (mg/ml) 1.75 2.03 2.05 2.07 25.05 Hoạt độ riêng (UI/mg) 0.32 0.59 0.60 0.61 0.08 Độ tinh 4.00 7.38 7.50 7.62 % Hoạt độ lại 27.05 57.94 59.90 61.35 100 Nồng độ cồn (%) protein Đồ thị 3.5 Hiệu suất hoạt tính cellulase với tác nhân cồn Nhận xét: Với nồng độ cồn 90 % ta thu đƣợc hoạt tính enzym cao 1.27 3.2.4 So sánh độ tinh enzym tác nhân tinh  Từ bảng số liệu mục ta rút bảng số liệu để so sánh khả tinh enzym cellulase tác nhân khác nhau, sử dụng phân đoạn thu đƣợc độ tinh cao tác nhân  Kết thu đƣợc bảng sau: SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 38 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Bảng 3.6 Kết tinh enzym với tác nhân tinh Hoạt độ (UI/ml) Tổng hàm lƣợng protein (mg/ml) Hoạt độ riêng (UI/ml) Độ tinh Hoạt tính cịn lại (%) Enzym thơ 2.07 25.05 0.08 100 Cồn 90% 1.27 2.07 0.61 7.62 61.35 Acetone 90% 1.73 4.90 0.35 4.38 83.57 Muối (NH4)2SO4 90% 1.24 1.80 0.69 8.63 59.9 Tác nhân Nhận xét:  Về hoạt tính: tủa acetone > cồn > muối (NH4)2SO4  Về hàm lƣợng protein: tủa acetone > cồn > muối (NH4)2SO4  Về hoạt tính riêng: tủa muối (NH4)2SO4 > cồn > acetone  Về hiệu suất hoạt tính: tủa acetone > cồn > muối (NH4)2SO4  Về độ tinh sạch: tủa muối (NH4)2SO4 > cồn > acetone  Kết quả: Trong tác nhân hóa học sử dụng để kết tủa protein để tinh celluase chọn đƣợc muối (NH4)2SO4 tác nhân kết tủa tốt có độ tinh 8.63 3.3 Nghiên cứu đặc tính enzym cellulase 3.3.1 Khảo sát nhiệt độ tối ưu  Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu, tiến hành khảo sát xác định hoạt độ enzym nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70, 80 90oC  Kết thu đƣợc bảng sau: Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ tối ƣu tới hoạt độ enzym Nhiệt độ (0C) Hoạt độ enzym (UI/ml) 30 1.23 40 1.42 50 1.75 60 2.09 70 1.89 80 0.75 90 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 39 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzym tinh Nhận xét: Từ kết ta thấy cellulase từ vi khuẩn G4 enzym chịu nhiệt tƣơng đối tốt, tăng nhiệt độ hoạt độ tăng lên tối ƣu nhiệt độ 600C với hoạt độ đạt 2.09 (UI/ml) Bởi nhiệt độ tăng lên vận tốc phản ứng đạt ngƣỡng tới hạn Khi vƣợt qua ngƣỡng tốc độ phản ứng giảm Nếu tăng nhiệt độ lên 800C hoạt độ cịn lại 36% so với hoạt độ cực đại 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ ổn định  Ủ enzym nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70 80oC thời gian 30 phút Sau xác định hoạt độ lại enzym phƣơng pháp Miller  Kết thu đƣợc bảng sau: Bảng 3.8 Khảo sát nhiệt độ ổn định Nhiệt độ (0C) Hoạt tính cịn lại (UI/mg) 30 1.66 40 1.65 50 1.63 60 1.26 70 0.92 80 Enzym tinh 1.66 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 40 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Đồ thị 3.7 Khảo sát nhiệt độ ổn định Nhận xét: Khi ổn định nhiệt độ từ 30 đến 500C hoạt tính enzym hầu nhƣ khơng thay đổi nhƣng nhiệt độ tăng từ 600C hoạt tính giảm dần bị hẳn nhiệt độ 800C 3.3.3 Khảo sát pH tối ưu  Sử dụng dung dịch đệm có pH = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Để khảo sát pH tối ƣu, tiến hành khảo sát hoạt độ enzym nồng độ pH khác  Kết thu đƣợc bảng sau: Bảng 3.9 Khảo sát pH tối ƣu pH Hoạt độ (UI/ml) 0.34 1.66 1.90 2.04 2.14 1.68 1.37 10 0.76 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 41 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Đồ thị 3.8 Khảo sát pH tối ưu Nhận xét: Hoạt độ enzym cellulase tối ƣu pH =7 Nếu vƣợt pH = hoạt độ enzym cellulase có xu hƣớng giảm xuống pH môi trƣờng ảnh hƣởng đến độ ion hóa chất độ bền chất nên có tác động mạnh pH hoạt tính enzym giảm 3.3.4 Khảo sát pH ổn định  Ủ enzym pH = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 thời gian 30 phút nhiệt độ phòng trƣớc tiến hành khảo sát hoạt độ lại enzym  Xác định hoạt độ lại enzym phƣơng pháp Miller  Kết thu đƣợc bảng sau: Bảng 3.10 Khảo sát pH ổn định pH Hoạt độ lại (UI/ml) 0.63 0.88 1.70 1.81 1.73 1.56 1.03 10 0.72 Enzym tinh 1.71 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 42 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Đồ thị 3.9 Khảo sát pH ổn định Nhận xét: pH có ảnh hƣởng lớn đến vận tốc phản ứng enzym, thay đổi pH làm cho hoạt tính xúc tác enzym thay đổi pH mà trạng thái ion hóa enzym chất thể cách tốt đƣợc gọi pH thích hợp Tử kết nghiên cứu cho thấy pH thích hợp cho hoạt động enzym từ đến 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất hoạt hóa chất kìm hãm enzym  Chất hoạt hóa chất có mặt mơi trƣờng làm tăng hoạt độ enzym  Chất kìm hãm chất có mặt mơi trƣờng làm giảm hoạt độ enzym 3.4.1 Ảnh hưởng cation hóa trị II đến hoạt độ enzym  Ủ enzym với cation hóa trị II khác 30 phút trƣớc tiến hành khảo sát hoạt tính cịn lại enzym  Xác định hoạt độ lại phƣơng pháp Miller  Kết thu đƣợc bảng sau: Bảng 3.11 Khảo sát cation hóa trị II Hoạt độ (UI/ml) 1.50 1.78 1.68 0 1.70 Cation Ba2+ Ca2+ Fe2+ Mg2+ Cu2+ Zn2+ Co2+ Enzym SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 43 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Nhận xét: Các cation gây ức chế hoạt động enzym: Co2+,Zn2+,Cu2+,Fe2+ Mg2+, Ba2+gây ức chế nhẹ enzym Ca2+ làm tăng hoạt độ enzym 3.4.2 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt đến hoạt độ enzym  Để nghiên cứu ảnh hƣởng chất hoạt động bề mặt đến hoạt độ enzym, sử dụng chất Tween 80, EDTA, SDS nồng độ 1, 5, 10mM  Ủ enzym với chất hoạt động bề mặt nồng đồ khác 30 phút trƣớc tiến hành khảo sát hoạt độ lại enzym  Hoạt độ lại đƣợc xác định phƣơng pháp Miller  Kết thu đƣợc bảng sau: Bảng 3.12 Khảo sát chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động bề mặt Nồng độ (mM) Hoạt độ (UI/mg) 10 1.24 1.28 1.34 10 1.17 1.37 1.41 10 0.35 0.62 1.24 Tween 80 DETA SDS Enzym tinh SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 1.05 44 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Đồ thị 3.10 Khảo sát chất hoạt động bề mặt Nhận xét: - Đối với Tween 80 EDTA làm tăng hoạt tính enzym nồng độ 1, 5, 10mM khả làm tăng cao nồng độ 1mM - Đối với SDS làm tăng hoạt tính nồng độ 1mM, cịn nồng độ 10mM lại gây kìm hãm hoạt động enzym làm hoạt tính giảm SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 45 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã nghiên cứu tinh enzym tác nhân hóa học nhƣ: ethanol, acetone, dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hịa, thu đƣợc tác nhân làm có độ tinh cao aceton nồng độ 90% độ tinh 4.38 - Nghiên cứu yếu tố tối ƣu ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym cellulase chủng Bacillus G4 thu đƣợc kết nhƣ sau:  Nhiệt độ tối ƣu: 60oC  pH tối ƣu: pH =  Nhiệt độ ổn định: 30 - 50oC  pH ổn định: pH = -  Cation làm tăng hoạt tính enzym: Ca2+ Một số cation ức chế hoạt tính enzym nhƣ Fe2+, Cu2+, Zn2+, Co2+, Fe3+  Chất hoạt động bề mặt làm tăng hoạt tính enzym: Tween 80 EDTA nồng độ 1, 5, 10mM cao nồng độ 1mM SDS làm tăng hoạt tính enzym nồng độ 1mM nhƣng nồng độ 10mM lại gây kìm hãm hoạt động enzym Kiến nghị - Tiến hành tủa enzym với tác nhân hóa học khác để tìm tác nhân hóa học tốt - Ứng dụng việc đƣa enzym cellulase tinh vào thực tiễn - Tùy theo mục đích sử dụng mà ta nghiên cứu tạo chế phẩm enzym cellulase dạng dịch dạng bột có độ tinh cao - Tiến hành khảo sát tìm enzym cellulase có hoạt tính từ chủng vi sinh vật khác SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 46 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, 2004 Công nghệ Enzym.Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [2] Phạm Thị Ánh Hồng, 2003 Kỹ thuật sinh hóa Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Thị Thảo.Nghiên cứu sàng lọc gên mã hóa enzym tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật ruột mối kỹ thuật Metagenomics.Dự thảo luận án tiến sĩ sinh học Trƣờng ĐHKH Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, 2014 [4] Trần Thị Ánh Tuyết, Trƣơng Quốc Huy Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzym cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis Tuyển tập Báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ7 [5] Lê Hồng Phú Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase cellulase ứng dụng sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men [6] Nguyến Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, 2003 [7] Châu Hoàng Vũ Thu nhận tinh enzym cellulase từ trichodermabằng phương pháp lên men bán rắn Khoa luận cử nhân khoa học, Trƣờng Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [8] Nguyễn Hồi Hƣơng & Bùi Văn Thế Vinh Bài giảng Thực hành hóa sinh Trƣờng Đại học Kỹ thuật & Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh, 2009 [9] Lê Quốc Nam Thu nhận tinh enzym cellulase từ nấm mốc Aspergilluse niger, mucor môi trường lên men bán rắn Trƣờng Đại học Tôn Đức Thắng, 2007 [10] Hồ Thị Bích Liên Sàng lọc vi sinh vật sinh enzym cellulase từ ruột mối tối ưu hóa mơi trường nhằm nâng cao hoạt tính enzym Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Mở TP Hồ Chí Minh, 2014 [11] Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phƣợng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hƣng, Trƣơng Thị Hồng Vân Thu nhận enzym cellulsae trichoderma reesei mơi trường bán rắn.Tạp chí phát triển Khoa học Công Nghệ, tập 10, số 07-2007 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 47 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân [12] Nguyễn Trần Nhật Minh Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzym Cellulase Từ NấmTrichoderma Reesei.Khóa luận tốt nghiệp [13] Nguyễn Văn Tuân Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợpendo-β-1,4-Glucanase đánh giá tính chất lý hóa endo-β-1,4Glucanase Luận văn thạc sĩ khoa học.Viện khoa học công nghệ Việt Nam, 2009 [14] Trần Thị Bích Lam Các phương pháp định lượng protein.Luận văn thạc sĩ khoa học, 2013 Tài liệu tiếng Anh [15] T Nakari-Setala and M Penttila Production of Trichoderma reesei cellulases on glucose-containing media Appl Environ Microbiol, 1995 [16] Goldbeck R, Andrade CCp, Ramos MM, Pereira GAG, Maugeri Filho F Identification and characterization of cellulases produced by Acremonium strictum isolated from Brazilian biome International Research Journal of Microbiology (IRJM) (ISSN: 2141 - 5463) Vol 4(6) pp 135 - 146, June, 2013 [17] Ponnuswamy Vijayaraghavan and S.G Prakash Vincent Purification and Characterization of Carboxymethyl Cellulase from Bacillus sp Isolated from a Paddy Field Polish Journal of Microbiology, 2012, Vol 61, No 1, 51 - 55 [18] ALI, Nagham1, YAZAJI, SABAH, HAJALI, A.2 and AZMEH, M.F.Optimization of cellulase production by submerged fermentation of agriculture wastes by Trichoderma spp.Department of Food Science, faculty of Agriculture, Damascus University [19] M.K Bakare1, I.O.Adewale, A Ajayi3, O.O.Shonukan3 Purification and characterization of cellulase from the wild-type and two improved mutants of Pseudomonas fluorescens Department of Biochemistry and Microbiology, Obafemi Awolowo University, Ile-Ife, Nigeria, 10 August, 2005 [20] Ekundayo Opeyemi Adeleke, Bridget Okiemute Omafuvbe, Isaac Olusanjo Adewale, Mufutau Kolawole Bakare Purification and characterization of a cellulase obtained from cocoa (Theobroma cacao) pod-degrading Bacillus coagulans Co4 Turkish Journal of Biochemistry, 2012; 37 (2): 222 - 230 [21] Schwarz W H (2001), “The cellulose degradation by anaerobic bacteria”, Appl Microbiol Biotechnol (56), pp 634 - 64.9 [22] Mahmoud Abdul-Megead Yassien, Aif Ahmad Mohammad Jiman-Fatani and Hani Zakaria Asfour Production, purification and characterization of cellulase SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 48 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân from Streptomyces sp African Journal of Microbiology Research Vol 8(4), pp 348 - 354, 22 January, 2014 [23] H Ariffin, N Abdullah, M.S Umi Kalsom, Y Shirai and M.A Hassan Production and characterization of cellulase by Bacillus Pumilus EB3 International Journal of Engineering and Technology, Vol 3, No 1, 2006, p 47 - 53 [24] M Moosavi-Nasab and M Majdi-Nasab Cellulase Production by Trichoderma reesei using Sugar Beet Pulp.Department of Food Science and Technology, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, I R Iran [25] Anikó Brumbauer, Gote Johansson & KatiRéczey Fractionation of cellulase and  -glucosidase in a Trichoderma reesei culture liquid by use of two-phase partitioning Department of Biochemistry, Lund University, P.O Box 124, S221 00 Lund [26] Montenecourt, B.S (1983) Trichoderma reesei cellulases Trends in Biotechnology, 1(5), pp 156-161 [27] Richa Gautam, Jitender Sharma Optimization, Purification of Cellulase produced from Bacillus Subtilis Subsp Inaquosorum under solid state fermentation and its potential applications in Denim Industry International Journal of Science and Research (IJSR) ISSN (Online): 2319 - 7064, Impact Factor (2012) [28].Saloheimo, M., et al (1997) cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast European Journal of Biochemistry, 249(2), pp 584-591 [29] Om Shankar, M K Shrivastava, Anoop Batra, V Tripathi, Vikas Gupta, and Kuldeep Kumar Production, Purification, Characterization and Application of Cellulose from Trichoderma species ISSN: 2320 - 7051 Int J Pure App Biosci (4): 222 - 239 (2014) [30] Martinez, D., et al (2008) Genome sequencing and analysis of the biomassdegrading fungus Trichoderma reesei (syn Hypocrea jecorina) Nature Biotechnology, 26(5), pp 553-560 [31] Linder, M., et al (1995).The difference in affinity between two fungal cellulosebinding domains is dominated by a single amino acid substitution FEBS letters, 372(1), pp 96-98 [32] Nema, N., Alamir, L And Mohammad, M Production of cellulase from Bacillus cerus by submerged fermentation using corn husks as subtrates International Food Research Journal 22(5): 1831 - 1836 (2015) SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 49 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân [33] Shazia Shafique, Rukhsana Bajwa and Sobiya Shafique.Cellulase biosynthesis by selected trichoderma species Institute of Mycology and Plant Pathology,University of the Punjab, Quaid-e-Azam Campus Lahore, Pakistan [34] Mattinen, M.L., et al (1997) Three-dimensional structures of three engineered cellulose-binding domains of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei Protein science, 6(2), pp 294-303 [35] T K GHOSE Measurement of cellulase activities.Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, New Delhi-110016, India [36] Kleywegt, G.J., et al (1997) The crystal structure of the catalytic core domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei at 3.6 Å resolution, and a comparison with related enzyms1 Journal of molecular biology, 272(3), pp 383-397 [37] J Environ Biol Optimization of solid state fermentation conditions for the production of cellulase by Trichoderma reesei Journal of Environmental Biology January 2012 [38] T K Ghose Measurement of cellulase activities.International union of pure and applied chemistry [39] BY K Selby and C C.Maitland The Cellulase of Trichoderma viride separation of the components involved in the solubilization off cotton Shirley Institute, Didebury, Marncheter 20(Received 16 December 1966) [40] Nyi Mekar Saptarini and Wiwiek Indriyati Isolation of cellulolytic bacteria from termites with cellulose of corn cobs as a carbon source.International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences Vol, Issue 4, 2014 [41] Kleywegt, G.J., et al (1997) The crystal structure of the catalytic core domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei at 3.6 Å resolution, and a comparison with related enzyms1 Journal of molecular biology, 272(3), pp 383-397 SVTH: Hồ Thị Ngọc - Cao Thị Miên 50 Lớp: 52K - Hóa thực phẩm ... enzym cellulase từ vi khuẩn ruột mối Kết đề tài bổ sung cho nghiên cứu trƣớc hệ enzym vi khuẩn ruột mối, đồng thời làm sở cho nghiên cứu vi khuẩn ruột mối Kết nghiên cứu nguồn tham khảo tốt cho nghiên. .. nhiên Vi? ??t Nam, nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối hạn chế chƣa đƣợc ứng dụng rộng rãi Trên sở chúng tơi lựa chọn đề tài ? ?Nghiên cứu đặc tính cellulase từ vi khuẩn ruột mối? ?? Nhiệm vụ nghiên. .. nghiên cứu - Thu nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối - Nghiên cứu tác nhân tỉ lệ thích hợp để tinh enzym cellulase từ chủng G4 - Nghiên cứu đặc tính enzym cellulase tinh từ chủng G4 - Nghiên cứu