Đang tải... (xem toàn văn)
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ A. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNGKHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN DUNG MÔI LÊN THỜI GIAN LƯU I. Nguyên tắc: • Là phương pháp phân tách ,phân li,phân tích các chất dựa trên tương tác khác nhau của nó với pha động và pha tĩnh. • Tùy theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà ta có 2 phương pháp khác nhau: Sắc kí pha thuận dùng để tách các hợp chất có độ phân cực cao :pha tĩnh phân cực và pha động kém hoặc không phân cực Sắc kí pha đảo dùng để tách các hợp chất kém hoặc không phân cực: có pha tĩnh kém hoặc không phân cực còn pha động phân cực cao. • Mẫu phân tích được đưa vào phần trên của cột,cho dung dịch rửa chảy qua cột,sẽ xảy ra sự phân li tách cấu tử.Thu thập dung dịch chạy ra khỏi cột trong từng khoảng thời gian xác định khác nhau,phân tích nồng độ các cấu tử bằng các phương pháp thích hợp xây dựng đồ thị→có thể dùng để phân tích định tính hoặc định lượng. II. Nội dung thực tập: • Nghiên cứu hiệu năng cột tách và độ chọn lọc trong sắc kí lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) có pha tĩnh là pha đảo.Hệ thống HPLC cơ bản gồm : bơm,van tiêm mẫu, cột, đầu dò, thiết bị ghi nhận và hiển thị tín hiệu. • Sắc kí lỏng hiệu năng cao ,pha tĩnh kém phân cực vốn giữ rất chặt các hợp chất kém hoặc không phân cực.Trong bài này cột sắc kí được nhồi pha tĩnh là những hạt silica hình cầu xốp.Hidrogen trên nhóm silanol SiOH được thay thế bằng nhóm octodecyl ( C18 ) làm cho bề mặt hạt silica trở nên không phân cực.Mức độ không phân cực của bề mặt hạt silica tùy thuộc vào tương quan giữa mật độ C18 và nhóm silanol còn lại,mức độ che phủ C18 và độ xốp của hạt silica. • Thực hiện tối ưu hóa khả năng tách hỗn hợp chứa metyl parahydroxybenzoate, etyl parahydroxybenzoate ,propyl parahydroxybenzoate ,và butyl parahydroxybenzoate bằng cách tiêm hỗn hợp 4 chất vào cột,rửa thành phần pha động thay đổi để tìm pha động tách tốt nhất→đánh giá hiệu năng cột tách. III. Thực nghiệm : 1. Khảo sát ảnh hưởng của pha động lên khả năng phân tách hỗn hợp: Tiến hành chạy máy đo HPLC với chất mẫu là hỗn hợp các ester trên và thay đổi thành phần pha động : • Dung dịch MeOH 100% • Dung dịch MeOHnước = 8020 • Dung dịch MeOHnước = 6535 ( Lưu ý là các pha động phải được đuổi khí hoà tan trước ) Một số chú ý thao tác: • Khi tiêm mẫu: Bơm thừa 1 ít mẫu để đẩy mẫu cũ ra đường thải. Tráng rửa bơm tim trước bằng mẫu đo • Khi thay đổi pha động :nhấn Stand By ,thế dung pha động mới,chờ khoảng 10 phút để đẩy hết pha động cũ ra ngoài. Kết quả chạy HPLC : a. Pha động 100% MeOH: Nhận xét: sắc kí đồ thu được chỉ có 1 peak→pha động MeOH 100% không có khả năng phân tách hỗn hợp. b. Pha động MeOHH2O =8020 : Nhận xét: sắc kí đồ thu được 4 peak ứng với 4 chất trong hỗn hợp nhưng các peak rất gần nhau, còn có phần chung không rõ ràng→ tách được nhưng không tốt. c. Pha động MeOHH2O = 6535 : Thời gian lưu ứng với các peak : • Peak 1 : tR = 2.422 (s) • Peak 2 : tR =3.126 (s) • Peak 3 : tR = 4.543 (s) • Peak 4 : tR = 7.255 (s) Nhận xét: sắc kí đồ thu được có 4 peak rõ ràng→tách tốt.Như vậy ta có thể dự đoán được pha động MeOHH2O = 5545 cũng có khả năng tách hỗn hợp, tuy nhiên thời gian lưu hơi lâu nên ta chọn pha động MeOHH2O=6535 là dung môi tách hỗn hợp tốt nhất. Giải thích: Các chất mẫu dùng trong bài có mạch C phức tạp ( chứa nhân benzene)→kém phân cực,tính kị nước cao.Chính vì vậy mà khi thay đổi pha động theo chiều hướng tăng dần %H2O thời gian lưu bị kéo dài ra và phân biệt rõ ràng hơn→khả năng tách tốt hơn. 2. Định danh các peak : Dùng pha động MeOHH2O=6535 chạy với các mẫu là từng dung dịch chứa từng phidroxibenzoate ester vào cột.Kết quả như sau: • Mẫu 1: dung dịch metyl phidroxibenzoate