Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ trứng gà tại một số trang trại trên địa bàn hà nội và vùng phụ cận

LỜI CAM ĐOANDữ liệu trong luận văn là một phần của đề tài “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng và sự phát tán của chủng vi khuẩn kháng thuốc giữa các t

H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN HỒNG THÁI

TR NG GÀ T I ỨNG GÀ TẠI ẠI M T S TRANG TR I TRÊN ỘT SỐ TRANG TRẠI TRÊN Ố TRANG TRẠI TRÊN ẠI

Đ A BÀN HÀ N I VÀ VÙNG PH C N ỊA BÀN HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN ỘT SỐ TRANG TRẠI TRÊN Ụ CẬN ẬP TỪ

Ng ười hướng dẫn khoa học: ướng dẫn khoa học: i h ng d n khoa h c: ẫn khoa học: ọc: TS Chu Th Thanh H ị Thanh Hương ương ng

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Dữ liệu trong luận văn là một phần của đề tài “Nghiên cứu tính kháng kháng

sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng và sự phát tán của chủng vi khuẩn kháng thuốc giữa các trang trại”, mã số 02/DAVB, được tài trợ bởi Dự án Việt- Bỉ thuộc

chương trình hợp tác nghiên cứu khoa học giữa Học viện Nông nghiệp Việt Nam vàTrường Đại học Vương quốc Bỉ, giai đoạn 2014-2019

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trungthực, chính xác và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào Tôi xin cam đoan cácthông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Hồng Thái

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhậnđược sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo Cùng sự giúp đỡ, động viêncủa bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được cảm ơn Ban Giám Đốc Họcviện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Họcviện Nông nghiệp Việt Nam, đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, thực hiện đề tài vàhoàn thành luận văn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Chu Thị Thanh Hươngkhoa Thú y đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đềtài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các hộ trang trại chăn nuôi gia cầm trên địa bàn

Hà Nội và vùng phụ cận đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tàinghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp luôn độngviên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Hồng Thái

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

Danh mục chữ viết tắt vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 2

1.3 Địa điểm thực hiện đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Một số hiểu biết về vi khuẩn escherichia coli. 3

2.1.1 Khái quát về vi khuẩn E.coli 3

2.1.2 Đặc tính sinh học 4

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 5

2.1.4 Đặc tính sinh hóa 5

2.1.5 Đặc tính gây bệnh và sức đề kháng 6

2.2 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli 7

2.2.1 Thuốc kháng sinh là gì 7

2.2.2 Phân loại kháng sinh 7

2.2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh. 8

2.2.4 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn 9

2.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 12

2.2.6 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli và một số nghiên cứu 14

2.3 Tình hình nghiên cứu kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli 15

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 16

2.3.3 Tình hình kháng kháng sinh đối với vi khuẩn E coli trên gà. 19

Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Nội dung nghiên cứu 21

3.2 Đối tượng nghiên cứu 21

3.3 Nguyên liệu nghiên cứu 21

3.3.1 Mẫu 21

3.3.2 Các môi trường chuyên dụng dùng để phân lập, giám định vi khuẩn 21

3.3.3 Các kháng sinh được sử dụng trong đề tài 21

3.3.4 Dụng cụ thí nghiệm 21

3.4 Phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà đẻ 22

3.4.2 Phương pháp thu thập trứng 22

3.4.3 Phương pháp xử lý mẫu 22

3.4.4 Phương pháp bảo quản mẫu 22

3.4.5 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E coli 22

3.4.6 Thử tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập được. 23

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 27

4.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh 27

4.2 Kết quả phân lập và giám định vi khuẩn E coli 28

4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E Coli 28

4.2.2 Kết quả giám định vi khuẩn E.coli 32

4.3 Kiểm tra tính kháng kháng sinh và xác định gen kháng kháng sinh của vi khuẩn 33 4.3.1 Đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập được 33

4.3.2 Xác định gen kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được 40

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 43

5.1 Kết luận 43

5.1.1 Về tình hình sử dụng kháng sinh ở các trang trại 43

5.1.2 Về kết quả phân lập và giám định vi khuẩn E coli 43

5.1.3 Về đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli 43

5.2 Kiến nghị 43

Phụ lục 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Kết quả xét nghiệm vi khuẩn E coli kháng nhiều loại kháng sinh 18

Bảng 3.1 Bảng đánh giá khả năng mẫn cảm / kháng của E coli 24

Bảng 3.2 Trình tự gen tham chiếu mcr-1 26

Bảng 4.1 Kết quả phân lập E coli từ trứng và swab ổ nhớp 30

Bảng 4.2 Kết quả phân lập E coli ở vỏ trứng theo địa phương lấy mẫu 31

Bảng 4.3 Chỉ tiêu sinh hóa của Vi khuẩn E.coli 32

Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra tính đa kháng kháng sinh 39

Bảng 4.5 Kết quả xác định gen kháng kháng sinh 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 E coli trong niêm mạc ruột 4

Hình 2.2 E coli dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 8

Hình 2.4 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 14

Hình 3.1 Tóm tắt các bước phân lập và bảo quản giống 23

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí các khoanh giấy kháng sinh 25

Hình 4.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh 27

Hình 4.2 Hình ảnh đặc trưng của vi khuẩn E coli trên môi trường (1) MacConKey và (2) TBX 29 Hình 4.3 Kết quả phân lập E coli trên thạch TBX 29

Hình 4.4 Tỷ lệ phân lập E coli ở vỏ trứng theo tình trạng dùng kháng sinh 32

Hình 4.6 Tính mẫn cảm kháng sinh của E coli phân lập từ vỏ trứng 34

Hình 4.7 Tính mẫn cảm với Ciprofloxacin, Amoxicillin và Colistin 35

Hình 4.8 Kết quả thử tính mẫn cảm với Gentamycin, Trimethoprim/sulfamethoxazole, Tetracycline và Nitrofurantoin 36

Hình 4.9 So sánh tính mẫn cảm của E coli phân lập từ vỏ trứng ở nhóm không sử dụng và có sử dụng kháng sinh 37

Hình 4.10 So sánh trình tự amino acid của protein mã hóa bởi gen mcr-1 41 Hình 4.11 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid của protein mã hóa bởi

gen mcr-1 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTChữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

MIC Minimum inhibitory concentration

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Nguyễn Hồng Thái

Tên luận văn: Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ

trứng gà tại một số trang trại trên địa bàn Hà Nội và vùng phụ cận”

Cơ sở đào tạo: Học viện nông nghiệp Việt

Nam Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá mức kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập từ trứng thu thập

từ trang trại trên địa bàn Hà nội và vùng phụ cận

Phương pháp nghiên cứu

- Khảo sát hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà đẻ

- Phương pháp thu thập trứng

- Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E coli

- Thử tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập

- Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel

Kết quả nghiên cứu

1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh

Trong tổng số 14 loại kháng sinh được điều tra thì có 9 loại đã được sử dụngtrong quá trình chăn nuôi gà, một số loại được thấy dùng phổ biến nhất, ví dụ như:Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%).Người chăn nuôi dùng kháng sinh chủ yếu dựa vào kinh nghiệm chăn nuôi và làm theohướng dẫn của nhà sản xuất Về mục đích sử dụng kháng sinh, phần lớn kháng sinhđược dùng để phòng bệnh

2 Kết quả phân lập và giám định vi khuẩn E.coli

Nghiên cứu này đã thu thập mẫu ở 29 đàn gà nuôi tại Hà Nội, Hưng Yên và HòaBình Có 10 đàn gà không sử dụng kháng sinh và 19 đàn gà dùng kháng sinh trong quátrình nuôi

Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm E coli kể trên cho biết vỏ trứng có thể là một nguồn lây nhiễm vi khuẩn E coli từ trang trại tới bàn ăn Mặt khác, do tỷ lệ nhiễm E.

coli ở lòng trứng rất thấp (1,6%) nên nghiên cứu này tập trung phân lập E coli ở vỏ

trứng và dùng cho nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh Các phần dưới đây tổng

hợp kết quả phân lập E coli ở vỏ trứng theo địa phương và theo tình trạng sử dụng

kháng sinh trong quá trình nuôi.

3.Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được

3.1.Đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được

Nghiên cứu về đặc điểm kháng kháng sinh của E coli, có khoảng 16 loại kháng

sinh thường được dùng tuy nhiên chỉ có 9 loại kháng sinh được thử, bao gồm:Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin,Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin và Amoxicillin-clavulanic acid

Các chủng E coli hình thành vòng vô khuẩn với đường kính vòng vô khuẩn

khác nhau Đối với 2 loại kháng sinh trong đó các vi khuẩn Gram âm không mẫn cảm là

Vancomycin và Erythromycin, 100% số chủng E coli thử đều không hình thành hoặc

hình thành vòng vô khuẩn với đường kính rất nhỏ (< 1 cm)

3.2.Đặc điểm di truyền của E.coli đa kháng kháng sinh

Nghiên cứu đã làm rõ đặc điểm về kiểu hình kháng kháng sinh của E coli phân

lập từ trứng Do tính trạng kháng kháng sinh do gen quy định, nên nghiên cứu này tiếp

tục tìm hiểu về đặc điểm gen của E coli đa kháng kháng sinh Hiện có hai hướng tiếp cận chính khi nghiên cứu về gen kháng kháng sinh của E coli, là: (1) dùng mồi đặc hiệu phát hiện các gen kháng kháng sinh (Nguyen et al., 2016; Trương Quý Dương và cs.,

2017), (2) giải trình tự và phân tích trình tự genome của vi khuẩn để xác định gen mã

hóa yếu tố độc lực và gen kháng kháng sinh (Rumore et al., 2018) Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chọn cách tiếp cận là giải trình tự genome của E coli để làm

rõ tất cả các gen độc lực cũng như gen kháng kháng sinh của E coli, chúng tôi đã chọn

01 chủng E coli đại diện (VB104) để giải trình tự genome bằng hệ thống Illumina

HiSeq 2000 (Công ty BGI, Hồng Kông)

THESIS ABSTRACTMaster candidate: Nguyen Hong Thai

Thesistitle: Situation of antibiotic resistance of E coli isolated from chicken eggs on

some farms in Hanoi and surrounding areas”

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

- To evaluate the antibiotic resistance level of E coli isolated from eggs on

some farms in Hanoi and surrounding areas

Materials and Methods

- Survey the current status of using antibiotics in breeding chicken

- Method of collecting eggs

- Method of isolation and identification of E.coli bacteria

- Test antibiotic resistance of isolated E coli bacteria

- Method of processing data using Microsoft Excel software

Main findings and conclusions

1 Results of investigating the situation of antibiotic use

In total 14 antibiotics were investigated, there are 9 types were used during chicken production Some of the most commonly used are: Amoxicillin (62.1%), Doxycycline (58.6%), Trimethoprim / sulfamethoxazole (51.7%) Farmers use antibiotics mainly based on their breeding experience and follow the manufacturer's instructions Regarding the purpose of using antibiotics, most antibiotics are used to prevent disease.

2.Method of isolation and identification of E.coli bacteria

This study collected samples from 29 chickens raised in Hanoi, Hung Yen andHoa Binh There are 10 chickens without antibiotics and 19 chickens used antibioticsduring farming

The result determination of E coli infection indicates that eggshell can be a source of E coli contamination from farm to dinner table On the other hand, due to the low incidence of E coli in the egg yolk (1.6%), this study focused on isolating E coli in

eggshell and used for research on antibiotic resistance The following sections

summarize the results of E coli isolation at eggshell in local and according to antibiotic

use status during culture

3 Test antibiotic resistance of isolated E coli bacteria

3.1 Antimicrobial resistance characteristics of isolated bacteria

Research on antibiotic resistance characteristics of E coli, there are about 16

antibiotics commonly used but only 9 types of antibiotics are tested, including:Tetracyclin, Trimethoprim / Sufamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin,Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin and Amoxicillin-clavulanic acid

Strains of E coli form sterile rings with different diameters of rings For 2 types

of antibiotics in which non-sensitive Gram-negative bacteria are Vancomycin and

Erythromycin, 100% of the strains of E coli tested are not form or form a sterile ring

with a very small diameter (<1 cm)

3.2.Genetic characteristics of multi-antibiotic resistant E.coli

There are currently two main approaches when studying the antibiotic resistance

gene of E coli: (1) using specific primers to detect antibiotic resistance genes (Nguyen et

al., 2016; Truong Quy Duong và cs., 2017), (2) sequencing and analyzing bacterial genome

sequence to identify genes encoding virulence factors and antibiotic resistance genes

(Rumore et al., 2018) Within the scope of this study, we chose the approach of sequencing the genome of E coli to clarify all virulence genes as well as antibiotic resistance genes of

E coli, we selected 01 strain E representative coli (VB104) for genome sequencing using

the Illumina HiSeq 2000 system (BGI Company, Hong Kong).

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây, ngành chăn chăn nuôi trên thế giới cũng nhưViệt Nam phát triển khá bền vững và đạt được những kết quả rất cao, đáp ứngđược các nhu cầu cơ bản về thực phẩm trong nước ngày càng cao của con người.Tuy vậy, mục tiêu chuyển dịch ngành chăn nuôi nước ta từ chăn nuôi nhỏ lẻ lênchăn nuôi quy mô lớn chưa đạt được nhiều thành tựu Với tình hình chăn nuôingày càng phát triển thì việc sử dụng kháng sinh để phòng và điều trị bệnh trongchăn nuôi hiện nay đang tăng mạnh và trở nên phổ biến ở cả quy mô nông hộ vàchăn nuôi trang trại Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tác động vào tìnhtrạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Phần lớn lượng kháng sinh được sử dụngnhư một hoạt chất phụ trợ trong thức ăn để phòng bệnh và tăng trọng làm tăng

nguy cơ kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli … Thông qua thức ăn có thể làm

con người bị “ăn” kháng sinh một cách thụ động và biến các vi khuẩn gây bệnhcho người càng kháng thuốc kháng sinh

Thực tế cho thấy các loại thuốc kháng sinh được bày bán, quảng cáo trên thịtrường một cách tràn lan, khó kiểm soát và đều ghi công dụng chữa trị được rấtnhiều bệnh khác nhau mà ít khi ghi đặc trị đối với một nhóm bệnh cụ thể Vì vậyngười chăn nuôi khi chưa nắm rõ được các thành phần và tác dụng đặc trị củakháng sinh thường hiểu nhầm là sử dụng các loại có công dụng đa năng sẽ manglại hiệu quả hơn nên thường xuyên sử dụng chúng liên tục trong quá trình chănnuôi Trong những năm gần đây, hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram

âm đặc biệt là vi khuẩn E.coli đã được cảnh báo Điều này gây ra khó khăn không

nhỏ trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn này gây ra Không chỉgây thiệt hại về mặt kinh tế, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh mà còn làm ngườichăn nuôi lúng túng trong việc lựa chọn các loại kháng sinh thích hợp để điều trịbệnh cho vật nuôi Đó thực sự là mối đe dọa đối với sức khỏe cộng đồng bởi vì

có những vi khuẩn kháng kháng sinh từ vật nuôi sẽ truyền khả năng kháng thuốcnày cho các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm trên người thông qua nhiều con đườngkhác nhau

E coli là bệnh nhiễm khuẩn phổ biến nhất của các loài gia cầm Lây

nhiễm E coli từ trứng là rất phổ biến và là nguyên nhân gây tỷ lệ chết cao cho gia

cầm mới nở từ đó gây ra tổn thất nhiều về kinh tế và việc phòng trị bệnh trở

nên khó khăn hơn.Vi khuẩn E coli cũng thường xuyên có mặt trong hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của gia cầm và môi trường chăn nuôi Những E coli gây bệnh

cho gia cầm có mang yếu tố độc lực đặc hiệu và có khả năng gây bệnh Đây làmột trong những bệnh quan trọng trong chăn nuôi gia cầm Gây ảnh hưởng lớnđến chất lượng đàn giống và gây tổn thất to lớn về kinh tế Có rất nhiều nghiêncứu về sự kháng kháng sinh trên thực phẩm đặc biệt là thịt,cá, sữa… nhưng ít cónhững nghiên cứu về sự lưu hành của vi khuẩn và kháng kháng sinh của vi khuẩnqua trứng, chỉ một vài bài báo và nghiên cứu về trứng Cần có nhiều nghiên cứu

và đi sâu vào vi khuẩn gây trên trứng hơn nữa nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài: “Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn

Escherichia coli phân lập từ trứng gà tại một số trang trại trên địa bàn Hà Nội

và vùng phụ cận”.

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

thu thập được từ trang trại trên địa bàn Hà Nội và vùng phụ cận

1.3 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Hà Nội và vùng phụ cận

sinh vật – Truyền nhiễm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI.

2.1.1 Khái quát về vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn E.coli là một trực khuẩn gram âm, lần đầu tiên được nhà khoa

học người Đức tên là Theodor Escherich phân lập vào năm 1885 và được đặt tên

là Bacterium coli commune Đến năm 1954, vi khuẩn này được đặt theo tên nhà

khoa học đầu tiên phân lập được vi khuẩn là E.coli Vi khuẩn E.coli thuộc giới

Bacteria, hệ thống Proteobacteria, lớp Gammaproteobacteria, bộ

Enterobacteriales, họ Enterobacteriaciae, giống Escherichia Giống Escherichia

có 5 loài là E albertii, E coli, E fergusonii, E hermannii và E vulneris Trong

đó, loài phổ biến nhất là E coli.

Căn cứ vào khả năng gây bệnh đối với vật chủ, vi khuẩn E.coli được chiathành hai nhóm là: nhóm gây bệnh (pathogenic groups) và nhóm không gây bệnh(non – pathogenic groups) Cả hai nhóm này đều tìm thấy trong môi trường tựnhiên và đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm Nhóm vi khuẩn không gây bệnhcũng có thể được xem như là nhóm vi khuẩn cơ hội, có thể gây bệnh khi kết hợpvới các tác nhân gây bệnh khác như ký sinh trùng, vi trùng, vi rút

E coli là loài vi khuẩn sống cộng sinh trong đường tiêu hóa, nhưng có thể

là vi khuẩn gây ra nhiều bệnh ở đường ruột và các cơ quan khác Vi khuẩn có 3loại kháng nguyên gồm: O, H và K

Kháng nguyên thân O (Somatic antigen): là kháng nguyên của vách tếbào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau Đặc tính củakháng nguyên O là chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng ở 100oC trong 2giờ Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50% Bị hủy bởi formon 5%.Rất độc, chỉ cần 0,05mg đủ để giết chết chuột nhắt sau 24 giờ Khi kháng nguyên

O gặp huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên Ogiữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tínhriêng biệt cho từng loại vật chủ

Kháng nguyên lông H (Flagenlar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấutạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt Bị hủy bởi cồn 50% và các

proteinase, không bị hủy bởi formon 5% Khi kháng nguyên H gặp kháng thểtương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết H.

Kháng nguyên giáp mô K (Capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau

và nằm ngoài kháng nguyên O Kháng nguyên K có bản chất là polysacharidehay là protein Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn vi khuẩn thì sẽ ngăn cản

hoàn toàn phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên giáp mô K giúp E coli bám vào

tế bào biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu Hiện nayngười ta đã phát hiện ra khoảng: 170 serotype kháng nguyên O, 56 serotypekháng nguyên H và 89 serotype kháng nguyên K

E coli gây bệnh hay không gây bệnh đều được gọi chung là Coliform.

Loại E coli gây bệnh phải có các yếu tố gây bệnh: độc tố, yếu tố bám dính và

yếu tố gây dung huyết…

2.1.2 Đặc tính sinh học

E coli là loại vi khuẩn phổ biến nhất và thường xuất hiện sớm ở đường

ruột người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ hay sinh 2 giờ) E coli là loại trực

khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông, di động, không hình thành nha bào,bắt màu Gram âm Trong cơ thể, vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng rẽ,

đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, kích thước 3 – 4 x 6 µm Phần lớn vi khuẩn E coli

có khả năng di chuyển do có lớp lông xung quanh thân, không sinh nha bào, cóthể có giáp mô Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở haiđầu, khoảng giữa nhạt hơn Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc có thể nhuộm thấygiáp mô, nhưng khi soi tươi thì thường không nhìn thấy được

Hình 2.1 E coli trong niêm mạc ruột Hình 2.2 E coli dưới kính hiển

vi điện tử

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, dễ dàng nuôi cấy ở môi

phát triển được từ 5,5 - 8

+ Môi trường nước thịt: E coli phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu

tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường

có mùi phân thối Vi khuẩn E coli hình thành khuẩn lạc dạng S tròn, ướt, nhẵn bóng màutrắng đục, đường kính 2-3 µm khi được nuôi cấy trên môi trường thạch thường Trên cácmôi trường chọn lọc MacConkey, vi khuẩn có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, rìagọn, không làm chuyển màu môi trường hoặc khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trườngTryptone Bile Glucuronic Agar (TBX)

Môi trường thạch máu: vi khuẩn phát triển tốt, khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt

đỏ mận chín, có màu hoặc không có màu ánh kim

khuẩn lạc có màu xanh tím, hơi lồi, trơn nhẵn

khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ

có màu tím đen, có ánh kim

lồi, nhẵn bóng, có màu vàng ngà

thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh

Các phản ứng sinh hoá: Indol (+); MR(+); VP(-); H2S (-) Khử nitrat thànhnitrit

2.1.4 Đặc tính sinh hóa

Phản ứng lên men đường: vi khuẩn E coli lên men sinh hơi các loại đường

Lactose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose Khi lên men đường Glucose vàLactose sẽ cho phần thạch đứng và thạch nghiêng đều chuyển sang màu vàng, vàđồng thời sinh hơi sẽ đẩy thạch lên cao hoặc làm nút thạch… Đặc điểm quan trọng

để phân biệt giữa Salmonella và E coli chính là phần thạch nghiêng chuyển màu vàng nhanh là do E coli có lên men Lactose còn Salmonella thì không lên men

Lactose nên không làm chuyển màu phần thạch nghiêng

Một số phản ứng sinh hóa khác: phản ứng sinh Indol dương tính xuất hiệnmàu hồng khi nhỏ thuốc thử Kovac vào và MR dương tính xuất hiện màu hồng cánhsen trong môi trường khi thử phản ứng MR Phản ứng H2S, VP và Urea âm tính

2.1.5 Đặc tính gây bệnh và sức đề kháng

Vi khuẩn E coli gây bệnh bởi tổng hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và

có yếu tố không phải là độc tố Khả năng bám dính và khả năng tạo colicin V vàkhả năng sản sinh độc tố

Nghiên cứu độc tố đường ruột của E coli cho thấy E coli nhóm ETEC (Enterotoxingenic E coli) có 2 loại độc tố đường ruột:

1 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, bị há hủy nhanh khi bị hấp cao áp

Vi khuẩn E coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, bao gồm kháng

nguyên thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên K và kháng nguyên bámdính F Kháng nguyên F (Fimbriae hay Pilus): Chức năng của kháng nguyên này

là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể (màng nhầy của đường tiêu hoá) hay còn gọi

là bám dính

khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh E coli gây bệnh, bám dính lên

niêm mạc ruột non nhờ một hay nhiều yếu tố bám dính Có 4 loại yếu tố bám dính đặcbiệt quan trọng là: F4 (K88), F5 (K99), F6 (K987p) và F41

ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác E coli sản sinh colicin V thông qua plasmid col Theo Brown (1981), trong hầu hết các chủng E coli gây bệnh đều có một

loại plasmid có chứa gen sản xuất colicin V

tố Sản sinh độc tố được xem như là một khả năng đặc biệt quan trọng của E coli Cũng giống như khả năng bám dính, khả năng sản sinh độc tố là một nhân tố gây bệnh của vi khuẩn E coli.

2.2 TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN E COLI

2.2.1 Thuốc kháng sinh là gì

Kháng sinh còn được gọi là Trụ sinh là những chất được chiết xuất từ các visinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩnhay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu

Thuốc kháng sinh là những chất có cấu tạo phức tạp, phần lớn trong các số

đó lúc đầu là xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra Với nồng độ thấp đã có tác dụng

ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh nhưng không hoặc gây ra rất ít độc chocon người, gia súc, gia cầm (Bùi Thị Tho, 2003)

2.2.2 Phân loại kháng sinh

Phân loại theo cấu trúc hóa học

+ Nhóm β - Lactamin: gồm 3 phân nhóm:

- Penicillin tự nhiên: Penicillin G, Penicillin O, Penicillin K, Penicillin V,…

Cephalosporin: được chia làm các thế hệ:

Thế hệ 1: Cephalexin, Cephalothin, Cefapirin,…

Thế hệ 2: Cefuroxime, Cefoxitin, Cefamandole,…

Thế hệ 3: Cefotaxime, Ceftriaxone, Ceftazidime, Cefpodoxime …

Thế hệ 4: Cefepime, Cefpirome, Cefozopran,…

Thế hệ 5: Ceftobiprole, Ceftaroline fosamil

Kanamycin,…

Tetracycline thiên nhiên: Oxytetracycline, Chlotetracycline,

Tetracycline bán tổng hợp: Doxycyllin, Tetralisan,…

Norfloxacin,…

+ Nhóm Sufamid và Nitrofurantoin và dẫn xuất của nó: Sulfathiazole,Sulfamethizole, Nitrofuran, Nitrofurazone,… Các thuốc này được tổng hợp hoàn toàn,

có tác dụng kìm khuẩn nhưng yếu hơn các nhóm trên

2.2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh được biểu diễn qua sơ đồ sau:

Hình 2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Mô hình trên cho thấy, cơ chế tác dụng của kháng sinh diễn ra trên 2 thànhphần:

+ Kháng sinh tác dụng lên tế bào

- Kháng sinh tác dụng lên quá trình tạo thành tế bào của vi khuẩn như cácthuốc thuộc nhóm β- lactamin, nhóm glycopeptide (vancomycin), nhómpolymycine (baxitracin)

hướng hoạt động của màng như nhóm polymycine (colistin)

+ Kháng sinh tác dụng lên hệ phi bào

không cần thiết cho sự nhân lên của tế bào Nhóm aminoglucozid + tetracyclin gắn vàotiểu phần 30s của ribosome làm cho quá trình dịch mã không

chính xác; các macrolid (erythromycin), lincosamid và phenicol gắn vào tiểuphần 50s của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiêncủa chuỗi polypeptide.

Kháng sinh tác dụng ức chế tổng hợp nhân tế bào (axit nucleic) cả AND vàARN của nhân và nguyên sinh chất trong tế bào Các quinolon thế hệ mới ức chếtác dụng của Enzyme ADN gyrase (nối giữa các ADN) làm cho hai mạch đơncủa ADN không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của ADN Nhómsulfamide có cấu trúc giống PABA (para aminobenzonic acid là một loại sinh tốnhóm B phức tạp) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợpacxit nucleotid Nhóm imidazol; nhóm trimethoprim tác động vào enzymedihydrofolat reductase (DHF) xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chếquá trình tạo axit nucleic (Lê Thị Ngọc Diệp, 1999)

Như vậy, có thể thấy kháng sinh có vai trò đặc biệt quan trọng trong phòng

và trị bệnh cho người và động vật nuôi Hiện tại, ở nước ta đã có tới hơn 60 –70% tổng giá trị các thuốc đang dùng để phòng, trị bệnh cho động vật nuôi làthuốc hóa học trị liệu trong đó chủ yếu là kháng sinh Kháng sinh là thuốc trị cănnguyên gây ra bệnh nhiễm trùng nên luôn là thuốc kê hàng đầu, quan trọng nhấtkhông thể thiếu được trong khi trị bệnh truyền nhiễm do vi trùng hay khi cơ thể

có nguy cơ bị nhiễm trùng: Trong phẫu thuật, trong thiến hoạn gia súc và trị vếtthương ngoại hay sản khoa của vật nuôi Hiện nay để khống chế các bệnh nguyhiểm, đặc biệt là các bệnh chung giữa người và vật nuôi do vi khuẩn không thểthiếu vai trò của kháng sinh được (Nguyễn Hữu Hồng, Nguyễn Thị Vinh, 2007).Các kháng sinh thông dụng chỉ có tác dụng với vi khuẩn mà không, hay rất

ít có tác dụng đặc hiệu với một số loại vi khuẩn gây bệnh nhất định Việc hỏibệnh, chẩn đoán đúng bệnh tất nhiên sẽ chọn đúng thuốc

2.2.4 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn

a Lịch sử:

Ngày 3/9/1928, Alexander Fleming là thầy thuốc xứ Scotland phát hiện rakháng sinh Penicillin từ nấm Penicillin notatum Năm 1941, kháng sinh này xuấthiện trên thị trường Mỹ nhưng chỉ ít lâu sau y giới đã quan sát thấy các ca đầutiên vi khuẩn kháng lại kháng sinh

Năm 1943, nhà khoa học Mỹ gốc Nga S.Waksman tìm ra Streptomycin,một loại kháng sinh mới Đáng buồn là đến năm 1944 chính Fleming lên tiếng

cảnh báo về hiện tượng kháng thuốc kháng sinh Năm 1947, ở Pháp đã có mạnglưới chính thức giám sát thuốc kháng sinh bị kháng.

Ngày 12/6/2000, một báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã ướctính: Trong vòng 20 năm, bệnh lao có thể trở thành bệnh nan y do thuốc khángsinh không còn hiệu lực Cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân hiện nay không còn ai giữđược niềm phấn khởi như Bộ trưởng Bộ Y tế Mỹ tuyên bố năm 1969 là nhân loại

đã gần đi tới việc “đóng lại cuốn sách về các bệnh nhiễm khuẩn” Đã 20 nămnay, các hiệp hội thầy thuốc tổ chức mạng lưới phát hiện vi khuẩn kháng thuốckháng sinh, hầu hết các nước Châu Âu có mạng lưới này ở cấp quốc gia

Như vậy, vi khuẩn kháng thuốc đã được quan tâm từ rất sớm

b Khái niệm:

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (Phước, 1976), một cá thể hoặc một loài vikhuẩn thuộc một loài nhất định được gọi là kháng thuốc nếu có thể sống và sinhsản trong môi trường có nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ ức chế sự sinh sảncủa phần lớn những cá thể khác trong cùng một canh khuẩn hoặc những cá thểkhác cùng loài

Vi khuẩn kháng nhiều loại kháng sinh được gọi đa kháng (MDR) Tại Mỹ,Trung tâm kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh tật đã xác định được 18 loại vi trùng

và nấm đã trở thành loại kháng thuốc kháng sinh và hiện nay đang đe dọa sứckhỏe cộng đồng

bị ức chế ra khỏi cơ thể, vì thế khi không còn thuốc kháng sinh vi khuẩn sẽ phụchồi và phát triển trở lại

Đề kháng thật

Kháng kháng sinh có thể chia làm hai loại: kháng tự nhiên và kháng thu được

Kháng tự nhiên

Kháng tự nhiên là tình trạng giống hoặc loài vi khuẩn nào đó không nhạycảm với tác nhân diệt khuẩn Điều này có thể do vi khuẩn thiếu cấu trúc đích cho tácđộng của kháng sinh Ví dụ: vi khuẩn không có thành tế bào như Mycoplasma thì đềkháng tự nhiên với kháng sinh nhóm β-lactam Ngoài ra, kháng tự nhiên còn có thể

do thành tế bào không cho kháng sinh thấm qua Ví dụ: vi khuẩn G- đề kháng tựnhiên với glycopeptide vì phân tử thuốc quá lớn, không qua màng vi khuẩn

Kháng thu được

Sự đề kháng với tác nhân kháng khuẩn có thể là do thay đổi thông tin ditruyền “nội sinh” bởi biến đổi nhiễm sắc thể, hoặc là do thu nhận một vật liệu ditruyển “ngoại sinh” như các plasmid hay transposon

Biến dị: một số kháng sinh có thể bị đề kháng do vị tri tác dụng (đích vikhuẩn) bị ảnh hưởng bởi biến đổi nhiễm sắc thể như: β-lactamin,Chloramphenicol, Quinolon, Erythromycin,

Plasmid: đó là những phân tử ADN mạch kép, đóng vòng, ngoài nhiễmsắc thể, có thể tự sao chép, chuyển giao ổn định qua các thể hệ và thường khôngthiết yếu cho những chức năng sinh tồn của vi khuẩn Chúng là nguyên nhân của

sự đề kháng với một hay nhiều kháng sinh thuộc những họ khác nhau Việc thunhận vật liệu di truyển mới này dẫn đến việc tổng hợp các protein mới và việc đềkháng có thể là do nhiều cơ chế sinh học Cuối cùng, các cơ chế khác nhau có thểphối hợp: nhiều plasmid khác nhau có thể trùng hợp trong cùng một vi khuẩn vàphối hợp với một đề kháng nội tại, dẫn đến đa đề kháng

Transposon: các plasmid đề kháng có thể tiến triển invitro do tiếp thu haymất đi lần lượt những đặc tính đề kháng, hệ quả của tính chất chuyển giao đượccủa phần lớn các gen Các transposon là hệ quả của ADN có thể đổi chỗ cácreplicon lẫn nhau (chuyển vị nội phân tử) hay tại một nơi khác của cùng mộtreplicon (chuyển vị ngoại phân tử), mặc dù không có sự tương đồng giữa cácADN mà chúng tác dụng (Dang 2016)

Sự kháng chéo: vi khuẩn kháng một loại thuốc nào đó cũng có thể kháng vớinhững thuốc khác có cùng cơ chế tác động Mối liên hệ như vậy thường gặp ở nhữngthuốc có thành phần hoá học gần giống nhau (VD: Polymycin B-Colistin,Erythromycin-Oleandomycin, Neomycin-Kanamycin) nhưng cũng có thể thấy giữanhững thuốc không liên hệ hoá học (VD: Erythromycin-Lincomycin)

2.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

b Giảm tính thẩm thấu của tế bào vi khuẩn

Các vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bảo, mang tế bào chất phân cách tế bàochất với môi trường bên ngoài Các vi khuẩn gram âm còn được trang bị thêmmột vỏ bên ngoài, gọi là thành ngoài có tác dụng như một hàng rào che chở Chấtdinh dưỡng và kháng sinh phải đi qua lớp vỏ ngày để thẩm thấu vào bên trong vikhuẩn theo cách thức khuếch tán thụ động ngang qua các kênh Sự giảm sự thẩmthấu của tế bào làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác dụng

Sự biến đổi của lớp thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thể làm giảm hoặc ngăncản sự khuếch tán của kháng sinh vào vị trí tác dụng

Các đột biến của các lỗ đóng vai trò quan trọng trong việc phát tán đềkháng, đặc biệt tiếp theo sự giảm kích thước lỗ hoặc giảm số lượng các lỗ Tínhthấm liên quan đến các lỗ thường phối hợp với việc tổng hợp các beta-lactamases

và tạo nên sự đề kháng cho vi khuẩn Đôi khi, có vi khuẩn chỉ trở nên đề khángkhi xãy ra đồng thời hai hiện tượng trên Ví dụ, với vi khuẩn Enterobacter sp và

thấm tế bào và tăng tổng hợp các men beta-lactamases ở nhiễm sắc thể (Knothe, Shah

et al., 1983; Pitout, Hanson Church and Laupland, 2004).

c Biến đổi vị trí gắn kết

Hiện tượng này là do nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hoặc plasmide, theo cơ chế làm giảm độ ái lực của kháng sinh tại vị trí tác dụng Ví dụ:

PBP với các thuốc nhóm beta-lactamines có thể do đột biến gene ở nhiễm sắc thể,hoặc do mắc phải gene bên ngoài có các PBP mới Cơ chế này thường gặp với các cầukhuẩn gram dương, như Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumonia, nhưngrất hiếm gặp ở vi khuẩn gram âm

đơn vị ribosom đích có thể làm giảm hoạt tính của kháng sinh macrolides,clindamycine, nhóm aminosides, hoặc chloramphenicol Sự biến đổi này làm chokháng sinh không đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của vi

khuẩn, do không thể gắn kết vào vị trí tác dụng ở ribosom(Pitout et al., 2004; Yamashita et al., 2000).

-Biến đổi men DNA-gyrase và men topoisomerase: DNA-gyrase là men cầnthiết cho hoạt tính của các quinolone Sự đột biến nhất thời ở độc nhất một acidamine của DNA-gyrase gây ra đề kháng Tương tư như thế đối với các đột biến ở

men topoisomerase (Bennett et al., 2014; Pitout et al., 2004; Yamashita et al., 2000).

-Biến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào vi khuẩn: Hiện tượng này có thể

bị xảy ra khi dùng vancomycine, như trường hợp các cầu khuẩn đề kháng vớivancomycine

-Biến đổi các enzyme đích: Sự biến đổi của men dihydropteroate synthetasekháng lại sự gắn kết với sulfamide và của men dihydropteroate reductase làm mấtnhạy cảm với trimetoprime đồng thời gây ra kháng thuốc Sự đề kháng của các vikhuẩn gram âm đối với các sulfamide là do plasmide tạo các enzyme đề kháng

d Bơm đẩy

Kháng sinh không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩykháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn (efflux) Các chất vận chuyển đẩy thuốc ra làcác thành phần bình thường của tế bào vi khuẩn và góp phần lớn cho tính đềkháng nội sinh của vi khuẩn chống lại nhiều thuốc kháng sinh Các bơm này cầnnăng lượng Việc tiếp xúc với thuốc kháng sinh làm thuận lợi cho việc tăng sốlượng bơm do đột biến các chất mang, làm tăng mạnh tính đề kháng của vikhuẩn Đây cũng có thể là nguyên nhân gây đề kháng chéo Ví dụ, ciprofloxacine

có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với cephalosporine theo cơ chế bơmđẩy Các vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên lâm sàng có mang bơm đẩy gây

kháng thuốc là E coli và Shigella Staphylococcus aureus có thể cũng có bơm đẩy làm cho vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm Macrolides (Bennett et al., 2014; Pitout et al., 2004; Yamashita et al., 2000)

Hình 2.4 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.2.6 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli và một số nghiên cứu

Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh của E coli nằm trong plasmid.

Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột nói chung và

E coli nói riêng có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi

khuẩn Do vậy, nó có tính chất hết sức quan trọng trong việc gieo rắc tính kháng

thuốc Sử dụng một loại thuốc hóa học trị liệu nào điều trị E coli trong một thời

gian dài thì vi khuẩn đó sẽ có khả năng kháng không chỉ thuốc đó mà cả cácthuốc khác nữa

Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho (1996) trong 20 năm từ 1975 - 1995 đã

cho thấy các chủng E coli kháng thuốc tăng lên nhanh Với chloramphenicol, từ

0% năm 1975 lên 34% năm 1985 và năm 1995 đã là 62,84% Streptomycin từ40% năm 1975 lên 52% năm 1985, năm 1995 là 77,05% Theo nghiên cứu của

Bùi Thị Tho và cs., 2006 cho thấy 77,24% các chủng E coli kháng streptomycin

và 89,10% E coli kháng sulfamid Ngoài nguyên nhân của việc sử dụng kháng

sinh một cách rộng rãi trong điều trị y học, nhóm nghiên cứu GARP - Việt Nam(2010) đã nhấn mạnh đến ý nghĩa của việc sử dụng kháng sinh trên động vật ngàymột rộng rãi mà chưa bị phát hiện về vai trò đối với các căn nguyên gây bệnh ởtrên người Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy ở bệnh

viện Bạch Mai, tỉ lệ E coli kháng kháng sinh tăng tử 18% năm 2005 đến 42%

năm 2008 và cho thấy mức độ kháng kháng sinh Tetracycline là 88,6%,Ciprofloxacine là 82,3%

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

E COLI

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu, đặc biệt là ở các nướcđang phát triển với các bệnh truyền nhiễm còn chiếm tỷ lệ cao trong cơ cấu bệnhtật như: nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền quađường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện… đang là gánh nặng thực sự vì sự giatăng chi phí do phải bắt buộc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mớiđắt tiền Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của

sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Xu hướng kháng lại các thuốc kháng sinh thường dùng, làm cho thuốc đókhông còn tác dụng trên lâm sàng, không còn tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gâybệnh Khi đó thuốc kháng sinh đang dùng điều trị cho người bệnh không tiêu diệtđược vi khuẩn gây bệnh Ngay cả khi chúng ta sử dụng kháng sinh với nồng độcao, thời gian kéo dài Việc kháng thuốc kháng sinh là một mối hiểm họa to lớnbởi lẽ vi khuẩn gây bệnh sẽ thoải mái lộng hành, phát triển mà không còn sợ hãitrước các vũ khí của con người Những vi khuẩn kháng thuốc sẽ nhân lên nhanhchóng, lây lan, gây bệnh trước sự bất lực của các bác sỹ

Theo báo cáo của trung tâm phòng chống bệnh tật Châu Âu (ECDC), hằngnăm ở Châu Âu có trên 25.000 bệnh nhân chết vì nhiễm phải vi khuẩn đa khángthuốc Các vi khuẩn kháng thuốc như MRSA, vi khuẩn tiết ESBL… tăng lên rõrệt hằng năm Cũng theo ECDC, vi khuẩn tiết ESBL đã tăng 6 lần trong vòng 4năm từ 2005 đến 2009

Gần đây, đã có sự lây lan một cách nhanh chóng của các vi khuẩn Gram âmmang gen kháng kháng sinh mới: gen New Delhi Metallo Beta lactamase 1(NDM-1) kháng lại được nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay và là lựa chọncuối cùng mà con người đang có khi xuất hiện vi khuẩn đa kháng thuốc đó lànhóm carbapenem Lúc đầu các chủng vi khuẩn có gen NDM-1 chỉ có ở Ấn Độ,nhưng đến này người ta đã phát hiện được ở nhiều nước trên thế giới như Anh,

Mỹ, Nhật Bản

2.3.1.1 Tính đa kháng kháng sinh của E coli trên thế giới

Kháng đa kháng sinh ở E coli đã trở thành một vấn đề đáng lo ngại ngày càng được quan sát thấy ở người mà cả trong thú y trên toàn thế giới E coli về

bản chất nhạy cảm với hầu hết tất cả các chất chống vi trùng có liên quan đến lâmsàng, nhưng loài vi khuẩn này có khả năng tích lũy các gen kháng thuốc, chủ yếu

thông qua chuyển gen ngang Các cơ chế có vấn đề nhất ở E coli tương ứng với

việc thu nhận các gen mã hóa cho β-lactamase phổ mở rộng (tạo ra tính khángvới các cephalosporin phổ rộng), carbapenemase, kháng methyl 16S rRNA Các

gen PMQR (tạo ra tính kháng với quinolones) và gen mcr (tạo ra tính kháng với

polymyxin)

Mặc dù sự lan truyền của gen carbapenemase chủ yếu được công nhậntrong lĩnh vực của con người nhưng được công nhận kém ở động vật, kháng

colistin ở E coli dường như có liên quan đến việc sử dụng colistin trong thú y

trên phạm vi toàn cầu Đối với các đặc điểm kháng thuốc khác, sự chuyển đổichéo giữa người và động vật vẫn còn gây tranh cãi mặc dù các nghiên cứu về bộgen chỉ ra rằng các nhà sản xuất-lactamase phổ mở rộng gặp ở động vật khác với

những người ảnh hưởng đến con người Ngoài ra, vi khuẩn E coli có nguồn gốc

động vật cũng thường cho thấy sự kháng thuốc với các chất khác chủ yếu làthuốc chống vi trùng, bao gồm tetracycline, phenicols, sulfonamid, trimethoprim

và fosfomycin Các plasmid, đặc biệt là các plasmid đa kháng, mà cả các yếu tố

di truyền khác, chẳng hạn như transpose và băng gen trong các integron lớp 1 và

2, dường như đóng vai trò chính trong việc phổ biến gen kháng thuốc

Các nhà khoa học Liên Xô (1973), khi kiểm tra tính mẫn cảm và tính

kháng thuốc của các chủng E coli gây bệnh trên bê, các tác giả trên cho thấy: Đã

có 15 chủng (88%) đa kháng với 2 loại thuốc chlotetraxiclin và oxytetracyclin;

14 chủng (82%) kháng với steptomycin; 7 chủng (41%) kháng vớichloramphenicol; 6 chủng (35%) kháng với furazolidon; 23 % kháng lạipolimycin; 18% kháng lại neomycin

2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Mặc dù Việt Nam là nước nông nghiệp và nằm trong khu vực có nguy cơlây lan rộng rãi của enzyme ESBL (Hawkey, 2008) nhưng những nghiên cứu về

nguồn lưu trữ vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh men ESBL có nguồn gốc từ

vật nuôi và sản phẩm vật nuôi (trứng, thịt, sữa) còn hạn chế

2.3.2.1 Một số nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli

Theo tác giả Trần Thị Thùy Giang và cộng sự (Giang, Nguyệt, & Trí), vi

khuẩn E coli được phân lập từ thực phẩm tại viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh cũng

kháng với nhiều loại kháng sinh, trong đó Cotrimoxazol (58,3 %),Ampicillin(55%), Tetracyline(53,3%), Gentamicin(30%), Piperacillin (13,3%),Cephalexine(12,5%), Amoxicillin/clavunanic (11,7%), Nitrofurantoin (10%),Mecillinam (10%), Ciprofloxacin (8,3 %), Colistin (3,3%), Ceftazidime (1,7%)

Theo tác giả Lê Văn Lê Anh và Lý Thị Liên Khai (V L A Lê & Lý,

2017) vi khuẩn E coli được phân lập từ vịt tại Thành Phố Cần Thơ cũng kháng

với nhiều loại kháng sinh, trong đó Ampicillin (75,16%), Bactrim (64,71%),Steptomycin ( 56,2%), Florfenicol (47,06%)

Theo tác giả Lê Thị Thùy Trang và cộng sự (Lê Thị Thùy Trang và cs.,

2017) vi khuẩn E coli được phân lập từ vịt tại tỉnh Hậu Giang cũng kháng với

nhiều loại kháng sinh, trong đó Steptomycin (95%),Sulfamethoxuazole/trimethoprim (98%), Ampicillin (79%)

2.3.2.2 Tính đa kháng kháng sinh của E coli ở Việt Nam.

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt Nam vào nhóm các nước có tỉ

lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới Hiện tại, Việt Nam cũng như nhiều nước

đã xuất hiện vi khuẩn đa kháng (kháng 2 nhóm kháng sinh) và toàn kháng (khángvới tất cả kháng sinh) Đó là lí do vì sao, nhiều nước phát triển sử dụng khángsinh thế hệ 1 vẫn điều trị hiệu quả thì tại Việt Nam đã phải dùng kháng sinh thế

hệ 3 và 4 Tỷ lệ đa kháng của E coli tại nước ta khoảng 20-25%, tỷ lệ tử vong

cao Các bác sĩ từng ghi nhận trường hợp khuẩn này chứa men NDM-1, mà thếgiới gọi là "siêu vi khuẩn" vì kháng nhiều loại kháng sinh

Đơn cử như tỉ lệ kháng thuốc của nhóm vi khuẩn gram âm như E coli (vi

khuẩn đường ruột) đã lên tới 30-40%, kháng luôn cả kháng sinh mạnh nhất là

colistin Thậm chí, tại một số tỉnh phía nam, tỉ lệ kháng thuốc của E coli còn lên

tới hơn 74%; tỉ lệ kháng của vi khuẩn gây nhiễm trùng K pneumoniae lên tới gần60%; vi khuẩn A.baumannii (gây nhiễm khuẩn bệnh viện) có tỉ lệ kháng với hầuhết các loại kháng sinh ở mức trên 90%

trị, song việc đi sâu nghiên cứu về quy luật kháng thuốc, mức độ đa kháng của từngloại vi khuẩn ở người và động vật nuôi thì chưa có nghiên cứu và thông báo

cụ thể Nhìn chung, các đề tài nghiên cứu đều chỉ nhằm mục đích kiểm tra mức

độ mẫn cảm của vi khuẩn với thuốc, để tìm ra các thuốc điều trị đặc hiệu đối vớitừng loại bệnh mà thôi

Nghiên cứu tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của E coli Phạm Khắc Hiếu và

cs (1980) phân lập từ bệnh lợn con phân trắng, đã công bố kết quả: Có 40% E coli

kháng streptomycin, 50% kháng sulfamid, 12% kháng chlotetracyclin và có 2,2%kháng chloramphenicol Về hiện tượng đa kháng, các tác giả trên cũng cho biết: Đã

có 17,5% E coli đa kháng với 2 loại thuốc streptomycin và sulfamid, 6,5% E coli

đa kháng với 3 loại streptomycin, sulfamid và chlotetracyclin

Vào những năm 1990, khả năng của các chủng E coli (phân lập từ heo con

bị cọ xát) đã được biết là có được E coli kháng nhiều loại kháng sinh.

Bảng 2.1 Kết quả xét nghiệm vi khuẩn E coli kháng nhiều loại kháng sinh

Số lượng thuốc đã bị Số chủng đã thử Số chủng nhân Tỷ lệ phần trăm

Nguồn: Bùi Thị Tho (1996)

Tỷ lệ cao nhất là E coli kháng 3 thuốc (23,64%), tiếp theo là 4 chủng kháng thuốc (21,23%) Mặc dù với tỷ lệ thấp (5,12% và 7,75%), E coli kháng thuốc 7

và 6 đã thực sự xuất hiện (Bùi Thị Tho 1996) Trong thế kỷ 21, nhiều loại khángthuốc (kháng với ít nhất ba nhóm thuốc kháng sinh khác nhau) cao hơn nhiều.Trong một nghiên cứu khác, bốn mươi ba (91,5%) trong số 47 phân lập thu được

từ Việt Nam cho thấy khả năng kháng đa kháng sinh, và các phân lập này kháng

với 2 loại thuốc kháng sinh khác nhau (10%) (Usui, Ozawa et al 2014).

Vượt ra khỏi cấp độ trang trại, E coli phân lập từ chuột bị nhốt trong các

trang trại có mức độ kháng kháng sinh tương đối cao và tỷ lệ nhiễm cao hơn mộtcách rõ rệt đến (8 lần) trong số các chủng phân lập từ các địa điểm nuôi bên

ngoài (Nhung, Cuong và cs., 2015) Hơn nữa, hồ sơ kháng kháng sinh từ chuột bịnhốt trong các trang trại và những người từ động vật nuôi giống nhau hơn so vớiđộng vật nuôi và chuột bị nhốt trong tự nhiên Kết quả ngụ ý rằng tình trạngkháng kháng sinh tại các trang trại là động lực chính của kháng kháng sinh môitrường, đặc biệt là ở những khu vực phân được thải trực tiếp vào ao hoặc đườngthủy (Nhung, Cuong và cs., 2015).

2.3.3 Tình hình kháng kháng sinh đối với vi khuẩn E coli trên gà.

Bệnh do vi khuẩn E coli gây ra ở gia cầm (Colibacillisis) là một trong

những bệnh phổ biến nhất và gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành

chăn nuôi gia cầm Vi khuẩn E coli gây bệnh cho gia cầm (Avian pathogenic

Escherichia Coli – APEC) có mang các yếu tố động lực đặc hiệu và có khả năng

gây bệnh ở gia cầm

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn E coli là yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh của E coli nằm trong plasmid Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột nói chung và E coli nói riêng có khả năng

tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi khuẩn

Nghiên cứu hiện tại được thực hiện để sàng lọc và phân tích các đặc điểm di

truyền của tình trạng kháng kháng sinh ở các chủng E coli phân lập từ thịt gà

được bán ở các thị trường địa phương của khu vực Taif ở Ả Rập Saudi Tổngcộng có 119 mẫu được mua từ các siêu thị khác nhau và kiểm tra sự nhiễm vi

khuẩn với vi khuẩn E coli kháng thuốc Ba mươi bảy chủng E coli được đánh

giá về tính mẫn cảm với kháng sinh và sự hiện diện của các integron loại 1 và gen

kháng kháng sinh Kết quả của kháng sinh cho thấy các chủng vi khuẩn E coli đã kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh được thử nghiệm Kháng thuốc được

quan sát thường xuyên nhất đối với sulphafurazole (89,2%), ampicillin (78,4%),axit nalidixic (70,3%), streptomycin (48,6%), chloramphenicol (32,4%) và

gentamicin (24,3%) Mười lăm chủng vi khuẩn E.coli có kiểu hình đa kháng

thuốc và chứa ít nhất ba gen kháng kháng sinh Các gen mã hóa kháng bla (TEM)(beta-lactamase) và sul (sulfonamide) đã được phát hiện trong tất cả các phân lậpđược thử nghiệm Sàng lọc phản ứng chuỗi polymerase đã phát hiện các integron

loại 1 trong tất cả các chủng E coli đa kháng Nghiên cứu hiện tại cung cấp một đánh giá về sự xuất hiện kháng đa chủng của E.coli từ thịt gà sống được thu thập

từ các thị trường địa phương

Trong số 101 chủng vi khuẩn E coli gây bệnh, hơn 55% kháng với ít nhất

một hoặc nhiều hợp chất được thử nghiệm và 36,6% các chủng phân lập cho thấynhiều kiểu hình kháng thuốc Các điện trở phổ biến nhất được quan sát là chốnglại tetracycline (45,5%), trimethoprim-sulphamethoxazole (26,7%), axit nalidixic(25,7%), ampicillin (25,7%) và streptomycin (20,8%) Kháng với ciprofloxacin(12,9%), chlormaphenicol (8,9%), nitrofurantoin (2%) và gentamicin (2%) cũng

đã được quan sát và không có chủng nào có khả năng kháng tigecycline cũng nhưbeta-lactamase mở rộng (ESBL) nhà sản xuất Một chủng đã kháng vớicefuroxime (1%), cefadroxil (1%) và mecillinam (1%) nhưng không phải là nhàsản xuất ESBL

Tại Việt Nam, vi khuẩn E coli kháng kháng sinh được tìm thấy ở các động vật lấy thịt khác nhau, hầu hết là gà (Nguyen, Nguyen et al., 2016);vịt (Dang 2016) và lợn (Dang, Bortolaia et al., 2018); Mối quan tâm về tình trạng kháng kháng sinh của E coli bắt đầu khá sớm.

Trong khoảng thời gian 20 năm, độ nhạy của ampicillin với E coli đã giảm

đáng kể từ 100% xuống 43,9% Xu hướng tương tự đã được quan sát đối với

neomycin Ngược lại, việc giảm độ nhạy của furazolidon đối với E coli giảm chậm,

từ 100% (1975-1976) xuống 89,6% (1995-1996) (Bùi Thị Tho, 1996) Khả năng

kháng kháng sinh của E.coli cũng được chứng minh trong các thí nghiệm in vitro.