Nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh chloramphenicol bằng phương pháp hóa miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH HÓA HỌC TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Ngành : Hóa phân tích Mã số ngành : 62 44 29 01 Phản biện 1: PGS.TS Hà Diệu Ly Phản biện 2: TS Đặng Chí Hiền Phản biện 3: TS Đặng Thanh Dũng Phản biện độc lập 1: PGS.TS Hà Diệu Ly Phản biện độc lập 2: TS Đặng Thanh Dũng NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS CHU PHẠM NGỌC SƠN GS.TS TRẦN LINH THƯỚC TP Hồ Chí Minh – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi với giúp đỡ đồng nghiệp 02 giáo sư hướng dẫn Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình trước Tơi xin cam đoan hợp tác, giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn, thơng tin, tài liệu trích dẫn luận án có nguồn gốc rõ ràng Tp HCM, ngày tháng Nghiên cứu sinh Nguyễn Đức Thịnh năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án tơi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh – Ban Giám đốc Viện Y tế Cơng cộng Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến GS.TS Chu Phạm Ngọc Sơn GS.TS Trần Linh Thước Hiệu trưởng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh – Hai người thầy trực tiếp hướng dẫn, hỗ trợ truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghề nghiệp cho suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Phòng đào tạo sau đại học Khoa Hóa học thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh hỗ trợ giúp đỡ tơi trình thực đề tài Cảm ơn TS.DS Nguyễn Thị Nguyệt Thu Ths Dương Ngọc Diễm Phòng Miễn dịch Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh cộng tác giúp đỡ tơi hồn thành luận án Cảm ơn bạn đồng nghiệp Trung tâm Kiểm nghiệm an tồn thực phẩm Khu vực phía Nam – Viện Y tế Cơng cộng Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ giúp đỡ tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối xin gửi tình cảm thân thương tới gia đình người thân giúp đỡ động viên tơi hịa thành luận văn MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chloramphenicol (CAP) 1.1.1 Tổng quan kháng sinh CAP 1.1.2 Độc tính CAP 1.2 Dư lượng kháng sinh thực phẩm 1.2.1 Tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi 1.2.2 Tình hình tồn dư kháng sinh thực phẩm 1.2.3 Ảnh hưởng sức khỏe người sử dụng 1.2.4 Quy định tồn dư kháng sinh thực phẩm 1.2.5 Kiểm soát tồn dư kháng sinh thực phẩm 10 1.3 Các phương pháp xác định tồn dư kháng sinh thực phẩm 10 1.3.1 Xử lý mẫu 11 1.3.2 Xác nhận diện kháng sinh 16 1.4 Phương pháp xác định tồn dư CAP thực phẩm 20 1.4.1 Tách chiết làm mẫu 20 1.4.2 Xác nhận diện CAP 22 1.4.3 Một số tồn phương pháp phân tích CAP sắc ký lỏng ghép khối phổ 25 1.5 Chế tạo cột sắc ký lực miễn dịch dùng cho bước làm CAP 26 1.5.1 Tạo kháng ngun cộng hợp CAP - Protein có tính sinh miễn dịch 26 1.5.2 Tạo kháng thể kháng chuyên biệt CAP 29 i 1.5.3 Tinh chế kháng thể 30 1.5.4 Quy trình tạo cột sắc ký lực miễn dịch 31 1.5.5 Các thông số đánh giá chất lượng cột sắc ký lực miễn dịch 34 1.5.6 Các thông số đánh giá quy trình phân tích sắc ký khối phổ 37 1.6 Tình hình nghiên cứu cột IAC - CAP nước 39 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị 40 2.2 Vật liệu, hóa chất 41 2.3 Mẫu nghiên cứu 42 2.4 Dung dịch chuẩn, thuốc thử 43 2.5 Động vật thí nghiệm 44 2.6 Chế tạo cột IAC - CAP 44 2.6.1 Chế tạo kháng nguyên CAP - BSA 44 2.6.2 Kiểm tra diện CAP CAP - BSA 45 2.6.3 Kiểm tra lượng BSA CAP - BSA 46 2.6.4 Gây đáp ứng miễn dịch thỏ CAP - BSA 46 2.6.5 Xác định diện kháng thể kháng BSA 48 2.6.6 Xác định diện kháng thể kháng CAP 48 2.6.7 Tinh chế kháng thể huyết thỏ muối ammonium sulfate bão hòa 49 2.6.8 Loại muối khỏi hỗn hợp kháng thể màng thẩm tích 49 2.6.9 Kiểm tra độ hỗn hợp kháng thể 50 2.6.10 Loại bỏ kháng thể kháng BSA hỗn hợp kháng thể 51 2.6.11 Kiểm tra diện kháng thể kháng BSA 52 2.6.12 Kiểm tra khả tương tác CAP kháng thể 52 2.6.13 Cộng hợp kháng thể kháng CAP vào gel Sepharose CL-4B-CNBr 53 2.6.14 Tạo cột sắc ký lực miễn dịch chuyên biệt CAP (IAC - CAP) 54 ii 2.7 Đánh giá chất lượng cột IAC - CAP 54 2.7.1 Đánh giá khả tương tác CAP 54 2.7.2 Đánh giá hiệu loại bỏ hiệu ứng 56 2.8 Đánh giá quy trình phân tích sử dụng cột IAC - CAP 58 2.8.1 Xác định khoảng tuyến tính 59 2.8.2 Xác định hệ số thu hồi 59 2.8.3 Xác định giới hạn phát 59 2.9 So sánh quy trình phân tích CAP sử dụng cột IAC - CAP MIP - CAP 59 2.10 Quy trình xử lý mẫu 60 2.10.1 Quy trình xử lý mẫu cột IAC - CAP 60 2.10.2 Quy trình xử lý mẫu cột MIP - CAP 60 2.11 Phương pháp phân tích CAP khối phổ 61 2.11.1 Phân tích khối phổ lần LC/MS 61 2.11.2 Phân tích khối phổ hai lần LC-MS/MS 61 2.11.3 Tính tốn kết 62 2.12 Sơ đồ nghiên cứu 63 2.13 Nơi thực đề tài 63 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Chế tạo cột IAC - CAP 65 3.1.1 Tạo cộng hợp CAP - BSA 65 3.1.2 Tạo kháng huyết thỏ kháng CAP 67 3.1.3 Tinh chế kháng huyết thỏ kháng CAP 70 3.1.4 Tạo cột IAC - CAP 74 3.2 Đánh giá chất lượng cột IAC - CAP 76 3.2.1 Đánh giá khả gắn CAP cột IAC - CAP 77 3.2.2 Đánh giá khả loại hiệu ứng cột IAC - CAP 81 3.2.3 Đánh giá độ ổn định cột 90 iii 3.3 Đánh giá quy trình phân tích CAP sử dụng cột IAC - CAP xử lý mẫu 92 3.3.1 Độ chọn lọc 92 3.3.2 Khoảng tuyến tính 92 3.3.3 Độ biến thiên thời gian lưu 94 3.3.4 Hiệu suất thu hồi độ biến thiên 95 3.3.5 Tỷ lệ ion 96 3.3.6 Giới hạn phát 97 3.4 So sánh quy trình phân tích CAP phương pháp LC MS/MS sử dụng cột IAC - CAP với cột MIP - CAP 100 Chương KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 104 4.2 Kiến nghị 104 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 105 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO 107 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CAP Chloramphenicol Chloramphenicol cps counts per second Số đếm giây CSE Centre for Science and Trung tâm Khoa học Môi trường tắt Environment CV Coefficient of Variantion Hệ số biến thiên ECD Electron Capture Detector Đầu dò cộng kết điện tử EDC 1-ethyl-3-(3-dimethyl- 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) aminopropyl) carbodiimide carbodiimide Enzyme-Link Immunosorbent Kỹ thuật hóa miễn dịch gắn men ELISA Assay FAMIC FAO Food and Agricultural Materials Trung tâm Giám sát Thực phẩm Inspection Center Nông sản Nhật Bản Food and Agriculture Tổ chức Lương thực Nông Organization of the United nghiệp Liên Hiệp Quốc Nations FDA Food and Drug Administration Cơ quan Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ FF Florfenicol Florfenicol FID Flame Ionization Detector Đầu dò ion hóa lửa FL Fluorescence Huỳnh quang GC Gas Chromatography Sắc ký khí v GC-MS Gas chromatography - Mass Sắc ký khí - Khối phổ Spectrometry HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao High Performance Liquid Chromatography IAC Immunoaffinity Chromatography Sắc ký lực miễn dịch IARC International Agency for Tổ chức nghiên cứu ung thư Research on Cancer quốc tế International Organization for Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế ISO Standardization The Joint FAO/WHO Expert Ủy ban chuyên gia Committee on Food Additives phụ gia thực phẩm LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng LLE Liquid-Liquid Extraction Chiết tách lỏng-lỏng LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MIP Molecularly Imprinted Polymers Polymer in dấu phân tử MRL Maximum Residue Limit Giới hạn tồn dư tối đa cho phép MRPL Minimum Required Performance Yêu cầu giới hạn tối thiểu hiệu Limit MS Mass Spectrometry Phổ khối MSPD Matrix Solid Phase Dispersion Tách chiết pha rắn phân tán OD Optical Density Mật độ quang OVA Ovalbumin Protein lòng trắng trứng gà PAGE Polyacrylamide Gel Điện di gel polyacrylamide JECFA Electrophoresis PBS Phosphate Buffered Saline vi Đệm phosphate có muối ... HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Ngành : Hóa phân tích Mã số ngành : 62 44 29 01... định dư lượng CAP mẫu thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng khối phổ - Các nội dung nghiên cứu: + Nghiên cứu chế tạo cột sắc ký lực miễn dịch chuyên biệt CAP + Đánh giá chất lượng cột sắc ký lực miễn. .. dịch chuyên biệt CAP + Đánh giá chất lượng quy trình phân tích dư lượng CAP mẫu thực phẩm phương pháp cột sắc ký lực miễn dịch chuyên biệt CAP kết hợp với sắc ký lỏng khối phổ + So sánh kết phân