Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng.

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng.Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng.Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng.Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng.Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Bùi Xuân Nguyên TS Nguyễn Việt Linh Hà Nội, 2021 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Xn Ngun, Ngun Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Công nghệ sinh học TS Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, bảo, hỗ trợ kĩ thuật tạo điều kiện tốt giúp tơi thực hồn thành luận án Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn ơn thầy cô giáo, cán Học viện Khoa học Công nghệ bảo, hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu hoàn thành thủ tục liên quan đến luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc TS Nguyễn Thị Ước, Phịng cơng nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học bảo, hướng dẫn kĩ thuật giúp đỡ từ ngày đầu làm việc nay, giúp đỡ TS Nguyễn Thị Ước góp phần lớn không kết luận án mà cịn suốt thời gian làm việc tơi Tơi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên Phịng nghiên cứu sinh sản chăn nuôi, Viện chăn nuôi khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp thực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ Thị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản hướng dẫn kĩ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ để thực luận án Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơng nghệ sinh học cán Phịng cơng nghệ Phơi, Viện cơng nghệ sinh học có góp ý để tơi hồn chỉnh luận án Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh tận tình hướng dẫn tơi hồn thành thủ tục suốt trình học tập làm nghiên cứu sinh học viện Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng hỗ trợ tạo điểu kiện tốt cho tơi chun tâm làm việc hồn thành luận án Cuối cùng, xin cảm ơn bạn bè đồng nghiệp ủng hộ, cổ vũ động viên tơi lúc khó khăn để hồn thành tốt luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn./ Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS Nguyễn Thị Nhung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS Nguyễn Thị Nhung MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ĐOAN .iii MỤC LỤC .iv DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Cấu tạo buồng trứng, thành thục trứng, trình thụ tinh phát triển phôi in vivo lợn 1.1.1 Cấu tạo buồng trứng thành thục in vivo trứng lợn .4 1.1.2 Sự thụ tinh phát triển phôi lợn in vivo 1.1.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến hoạt động sinh sản lợn 12 1.2 Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro .15 1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng nguồn nguyên liệu trứng điều kiện nuôi thành thục 15 Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi bảo quản phôi 19 1.2.3 Tạo phôi lợn kĩ thuật NBVT 26 1.3 Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro 32 1.3.1 Một số đặc điểm hình thái sinh sản lợn Bản 32 1.3.2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng tạo phôi lợn Bản Việt Nam 33 1.2.2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35 2.1 Vật liệu, hoá chất nghiên cứu 35 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 35 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 36 2.1.3 Hóa chất thiết bị 36 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 36 2.1.5 Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản 37 2.2 Phương pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Phân loại tháng theo mùa 37 2.2.2 Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng 37 2.2.3 Phương pháp đo kích thước khối lượng buồng trứng 2.2.4 Phương pháp phân chia nhóm nang 37 2.2.5 Phương pháp thu trứng 2.2.6 Phương pháp phân loại chất lượng trứng 38 2.2.7 Phương pháp đo kích thước trứng lợn 39 2.2.8 Phương pháp nuôi trứng 39 2.2.9 Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi 40 2.2.10 Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh 40 2.2.11 Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước sau đông lạnh 42 2.2.12 Phương pháp TTON 43 2.2.13 Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh 44 2.2.14 Phương pháp đông lạnh phôi 44 2.2.15 Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn 45 2.2.16 Phương pháp nhân nuôi tế bào 45 2.2.17 Phương pháp đông lạnh tế bào 46 2.2.18 Phương pháp NBVT (NBVT) 2.2.19 Phương pháp nuôi phôi 49 2.2.20 Phương pháp nhuộm Hoechst 49 2.2.21 Phương pháp nhuộm Orcein 2.2.22 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 50 37 38 46 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Đặc điểm hình thái buồng trứng tiềm khai thác trứng lợn Bản theo mùa 54 3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54 3.1.2 Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản 56 3.1.3 Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa kích thước trứng 59 lợn Bản 3.2 Kết nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản 65 3.2.1 Ảnh hưởng mùa vụ lên kết nuôi thành thục trứng lợn Bản 65 3.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết nuôi thành thục 68 trứng lợn Bản 3.3 Kết tạo phôi lợn Bản TTON 72 3.3.1 Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản 73 3.3.2 Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu 78 3.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi thành thục lên thụ tinh phát triển phôi 84 3.3.4 Đông lạnh phôi TTON 89 3.4 Kết nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT 91 3.4.1 Kết nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace 91 3.4.2 Kết nuôi thành thục trứng lợn Landrace 94 3.4.3 Tạo nguồn tế bào cho nhân NBVT 96 3.4.4 Kết tạo phôi lợn Bản NBVT 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54 Bảng 3.2 Số lượng nang trung bình theo kích thước 57 Bảng 3.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản 60 Bảng 3.4 Kích thước trứng lợn Bản (µm) 62 Bảng 3.5 Sự thành thục trứng lợn Bản 66 Bảng 3.6 Kết nuôi thành thục trứng lợn Bản 67 Bảng 3.7 Chất lượng tinh sau thu 73 Bảng 3.8 Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh 74 Bảng 3.9 Thử nghiệm khả tạo phôi tinh trùng sau đông lạnh 77 Bảng 3.10 Đánh giá trạng thái thụ tinh trứng 79 Bảng 3.11 Ảnh hưởng lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh lợn Bản 80 Bảng 3.12 Trạng thái thụ tinh trứng môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác thời gian thụ tinh khác .81 Bảng 3.13 Sự thành thục khả thụ tinh trứng lợn Bản sau nuôi 85 Bảng 14 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên phát triển phôi lợn Bản sau thụ tinh 86 Bảng 3.15 Ảnh hưởng môi trường nuôi phôi lên phát triển phôi lợn Bản sau thụ tinh 86 Bảng 3.16 Kết đông lạnh phôi TTON 89 Bảng 3.17 Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace 913 Bảng 3.18 Khả thành thục trứng lợn Landrace loại môi trường nuôi 94 Bảng 3.19 Ảnh hưởng loại tế bào cấy lên phát triển phôi lợn NBVT 96 Bảng 3.20 Sự phát triển phôi lợn Landrae phôi lợn Bản NBVT môi trường nuôi 97 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng phát triển nang, trứng động vật có vú Hình 1.2 Sự phát triển nang, tế bào trứng lợn thơng qua q trình giảm phân Hình 1.3 Quá trình thành thục trứng lợn Hình 1.4 Trứng lợn sau thụ tinh quan sát kính hiển vi với nhiều tinh trùng vùng màng 10 sáng Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển phôi lợn 11 Hình 1.6 Sự phát triển phơi lợn từ ngày đến ngày 10 12 Hình 1.7 Sự phát triển nang, phát triển tế bào cận noãn thành thục trứng động vật có vú 19 Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic 24 Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT 27 Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng 43 Hình 2.2 Bố trí dầu kim 47 Hình 2.3 Đĩa mơi trương thao tác loại nhân tế bào trứng 47 Hình 2.4 Micro pipet trứng thao tác hút cấy nhân 47 Hình 2.5 Đĩa mơi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng 48 Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân 49 Hình 3.1 Kích thước khối lượng buồng trứng lợn Bản: 55 Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 57 Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau thu phân loại A,B,C 59 Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu tách tế bào cận noãn 62 Hình 3.5 Mối tương quan số lượng nang > mm số trứng 64 ... nhóm nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên... nhiên, nghiên cứu ứng dụng tiến công nghệ sinh học sinh sản tiến hành chủ yếu giống lợn ngoại, nghiên cứu tương tự bắt đầu giống lợn địa Các kết nghiên cứu tạo phôi giống lợn mini địa Việt Nam số. .. 19 1.2.3 Tạo phôi lợn kĩ thu? ??t NBVT 26 1.3 Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro 32 1.3.1 Một số đặc điểm hình thái sinh sản lợn Bản 32 1.3.2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng tạo