Nghiên cứu nhân giống thông caribê pinus caibaea morlet bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

1 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN VĂN PHONG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP HÀ NỘI - 2009 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP - NGUYỄN VĂN PHONG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60 62 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS CHU HOÀNG HÀ HÀ NỘI - 2009 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc nâng cao chất lượng rừng, sử dụng lồi có giá trị kinh tế mơi trường, sinh trưởng nhanh, thích ứng nhiều điều kiện sinh thái, lập địa không tốt chiến lược phát triển ngành Lâm nghiệp từ năm 2010 đến 2020 Bên cạnh việc lựa chọn loài địa cho trồng mới, khoanh nuôi làm giàu rừng, công tác nghiên cứu, khảo nghiệm trồng thử loài ngoại lai đóng vai trị quan trọng (Quyết định số 18/2007/QĐ-TTg ngày tháng năm 2007 thủ tướng phủ) [1] Hiện nay, Thơng caribê (Pinus caribaea Morelet), loài lâm nghiệp quan tâm phát triển [11], [19] Thông caribê thuộc họ thông (Pinaceae) với biến chủng là: Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis Pinus caribaea var bahamensis có phân bố tự nhiên vùng Trung Mỹ Thông caribê du nhập vào nhiều nước khác nhau, chủ yếu nước thuộc vùng nhiệt đới nhiệt đới Ở Việt Nam, Thông caribê đưa vào trồng khảo nghiệm từ năm 1963 vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 2003) Đây lồi kim sinh trưởng nhanh, thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ Thông Ba lá, Thông Mã vĩ Thông nhựa, gỗ có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường sử dụng làm ván ép (Bredenkamp Van Vuuen, 1987) Ngồi Thơng caribê cịn sử dụng làm gỗ xây dựng, gỗ trụ mỏ, ván dăm, ván ép, bột sợi giấy dai, gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ, gỗ đóng nội thất, lấy nhựa… Thơng caribê cịn có lợi khác có khả thích ứng với nhiều vùng sinh thái khác nước ta [3], [9], [11], [19] Khả gây trồng Thông cairibê nước ta công bố tiêu chuẩn ngành (04TCN 68 - 2004) Theo định số 62/2006 QĐ-BNN, ngày 16/8/2006 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp & PTNT chiến lược phát triển giống lâm nghiệp giai đoạn 2006 - 2020, nhu cầu lượng giống Thông caribê cần hàng năm giai đoạn 2006 – 2015 14.000.000 cây/năm Đây số lượng giống cần lớn, Thông caribê trồng hạt sinh trưởng nhanh Tuy vậy, việc nhân giống sinh dưỡng, đặc biệt nhân giống hom nuôi cấy mô sở để tạo nguồn giống có chất lượng di truyền đồng đều, giữ đặc điểm di truyền lấy mẫu, làm sở cho cơng tác khảo nghiệm dịng vơ tính trội chọn lọc Nhân vơ tính dễ dàng chủ động nguồn giống, khơng bị ảnh hưởng mùa vụ thời tiết Nhân giống sinh dưỡng Thông caribê nhiều nhà khoa học nước quan tâm nghiên cứu bước đầu thu số kết khả quan như: nhân giống hom tạo lượng lớn giống với tỉ lệ hom rễ 93,3%… Ở Việt Nam, nghiên cứu thăm dò nhân giống in vitro Thông caribê số nơi nghiên cứu [7], [23] đạt hệ số nhân chồi thấp 1,7 lần (Phạm Thị Kim Thanh, 2007) chưa xây dựng quy trình để ứng dụng sản xuất Xuất phát từ sở trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) phương pháp nuôi cấy in vitro” Với mục tiêu nghiên cứu sau: + Tạo nguồn mẫu đủ lớn từ loại nguyên liệu (hạt chín, chồi cành từ thực địa) + Phát triển quy trình nhân nhanh chồi in vitro hiệu quả, hệ số nhân chồi cao Nội dung nghiên cứu + Tạo mẫu từ hạt chồi cành Thông caribê + Tạo đa chồi điều kiện nuôi cấy in vitro + Thử nghiệm khả tạo rễ in vitro Thông caribê Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Thông caribê 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại phân bố Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) loài nhiệt đới, họ thông (Pinaceae) nằm thông (Coniferales) ngành hạt trần (Gynospermae) [3] Thơng caribê lồi thơng địa vùng Trung Mỹ Dựa vào phân bố tự nhiên loài vùng địa lý khác nhau, Thông caribê chia thành biến chủng (Luckhof, 1964; Lamb, 1973) sau: - Pinus caribaea var hondurensis (PCH) phân bố dọc bờ biển Đại Tây Dương vùng Trung Mỹ, từ Belize tới bắc Nicaragua, từ 120 đến 180 vĩ độ Bắc, từ 83030’ tới 89025’ kinh độ Tây PCH mọc tự nhiên Belize, Guatemala, Honduras Nicaragua độ cao 1000m so với mặt nước biển Cây trưởng thành cao tới 35 - 40m, sinh khối đạt khoảng 10 - 40m3/ha/năm - Pinus caribaea var bahamensis (PCB) phân bố quần đảo Bahamas Caicos (240 - 270 vĩ độ Bắc, 71040’ - 790 kinh độ Tây) Cây mọc độ cao gần 12m so với mặt nước biển, trưởng thành cao khoảng 15 - 20m - Pinus caribaea var caribaea (PCC) phân bố phía tây Cuba đảo thơng (220 - 230 vĩ độ Bắc, 82020’ - 84015’ kinh độ Tây) Cây mọc tự nhiên độ cao 280m so với mặt nước biển Vùng phân bố tự nhiên PCH từ bờ biển vào sâu lục địa nên biến động yếu tố khí hậu lớn Ví dụ nhiệt độ mùa đơng nội địa Belize xuống tới 50C, mùa hè nóng tới 370C Tuy nhiên, nhiệt độ khơng xuống tới mức đóng băng Lượng mưa phân bố không vùng, biến động từ 1.500mm/năm núi thông (Belize) tới 3.900 mm/năm Bluefields (Nicaragua) Những lâm phần thông sâu lục địa có lượng mưa thấp so với ven biển Lượng mưa hàng năm thung lũng sông Choluteca Hunduras xuống tới 660mm với tháng lượng mưa khơng vượt q 40mm/tháng Vì phân bố vùng Trung Mỹ, PCH thích hợp với nhiều loại đất, từ đất cát xốp, thoát nước tốt, đất phù sa dọc bờ biển Đại Tây Dương tới loại đất lục địa hình thành từ loại đá mẹ phiến thạch, granite, schist đá cát với độ PH từ đến 5, tầng đất từ dày tới mỏng Đất sét chặt bí, nước khơng tốt khơng thích hợp với Thơng caribê [6] Quần đảo Bahamas Caicos, nơi PCB mọc tự nhiên có khí hậu ấm áp, mùa đơng khơ khơng có sương muối Biến động nhiệt độ không lớn mùa năm Nhiệt độ trung bình dao động từ khoảng 220C tháng lạnh tới 280C tháng nóng Lượng mưa trung bình năm 1.185mm tập trung chủ yếu tháng 10 Lượng mưa biến động từ khoảng 177mm tháng có lượng mưa nhiều tới 32mm tháng khô Mùa khô từ tháng 11 tới tháng năm sau PCB nơi nguyên sản mọc tốt đất phong hoá từ đá vơi san hơ, nước tốt Loại đất nông, nghèo dinh dưỡng chứa đựng nhiều ơxít sắt bị rửa trơi từ tầng đá vơi Vì hình thành từ đá vơi nên có tính kiềm cao, độ PH = 8,4 cao Tuy nhiên, nấm cộng sinh rễ PCB phát triển tốt đất có tính kiềm cao nguyên nhân chủng không gây trồng nhiều nơi phân bố tự nhiên chúng PCC sinh trưởng điều kiện biến động lớn nhiệt độ phát triển Nhiệt độ thấp cao Cuba từ 120C tới 340C Lượng mưa biến động từ 1.060mm/năm bờ biển phía Nam tới 1.794mm/năm đảo thơng Vùng phân bố PCC có mùa đơng khơ lượng mưa tập trung vào số tháng mùa hè PCC nơi nguyên sản thích hợp với đất phát triển đá mẹ phiến thạch đá cát, thoát nước tốt, độ PH < PCC không sinh trưởng đất đá vơi dạng đất có nhiều Cuba [10] 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái học Thông caribê cao 15 - 40m, đường kính 100cm Thân thẳng tán hình tháp Cành nghiêng sau xoè rộng Vỏ màu nâu nhạt, nứt dọc sau bong mảng dài Chồi hình trụ trịn màu nâu thẫm Lá hình kim mọc cụm đầu cành ngắn, cụm lá Lá dài 15 - 25cm đường kính 1,5mm màu xanh vàng, hai mặt có dải phấn trắng, mép có cưa nhỏ Bẹ bao quanh gốc cụm dài 10 - 20mm màu nâu nhạt gồm nhiều hình vẩy suốt, sống lâu Nón đực hình trụ, dài 1,3 - 3,2cm Nón đầu cành non hình viên chuỳ dài - 10cm, đường kính 2,5 - 3,8cm Nón chín năm, lúc đầu màu tím hồng sau màu xanh, chín hố gỗ màu nâu Nón có cuống ngắn thuờng vẹo quặp phía cành Vẩy nón hình thoi, mặt vẩy mỏng lồi, có gai nhọn gần 1mm Hạt hình trứng dài 6mm, đường kính 3mm Vỏ hạt nâu có nhiều chấm trịn Hạt có cánh mỏng dài - 2,5cm Hệ rễ hỗn hợp, nơi tầng đất dày rễ cọc ăn sâu, nơi tầng đất mỏng hệ rễ bên phát triển Là ưa sáng, nhạy cảm với sương giá lửa, loài kim mọc nhanh giới, lập địa thích hợp 15 tuổi tăng trưởng bình qn năm đạt 1,5m chiều cao 2,5cm đường kính Ra nón tháng - Nón chín tháng - năm sau 1.1.3 Giá trị sử dụng Gỗ màu vàng nhạt, lõi màu đỏ, có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường dùng làm ván ép Thân thẳng, dễ cưa xẻ phụ thuộc nhiều vào độ tuổi tương đối cứng tỉ trọng 0,5 - 0,7 Có thể dùng xây dựng, làm trụ mỏ, tiện khắc bột sợi giấy dai, gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ, gỗ đóng đồ nội thất…và cho nhiều nhựa chất lượng cao [3] Với tốc độ sinh trưởng nhanh khả thích ứng rộng với vùng sinh thái khác giới, đáp ứng nhiều mục tiêu kinh tế Vì Thơng caribê lồi rừng đặc biệt để trồng rừng công nghiệp, nhiều nước nhập giống gây trồng, chủ yếu nước thuộc vùng nhiệt đới nhiệt đới Việt Nam nước nhiệt đới có điều kiện địa lý tương đồng với phân bố tự nhiên Thơng caribê Do mà lồi Thơng caribê đưa vào trồng khảo nghiệm nước ta từ năm 1963 có thành cơng định [10], [19] 1.1.4 Tình hình sản xuất, gây trồng ngồi nước * Ở ngồi nước: Thơng caribê dẫn nhập gây trồng 65 nước giới Giới hạn vĩ độ vùng trồng mở rộng đáng kể so với nơi nguyên sản, từ vĩ độ 550 nam Argentina tới 330 vĩ độ bắc Ấn độ Giới hạn kinh độ mở rộng từ 1800 kinh độ Đông fiji tới 1580 kinh độ Tây Hawaii Độ cao vùng trồng biến động từ mặt nước biển tới 1200m Zaire, 1220m Nigeria, 1820m Uganda 2400m Kenya [11] Như vậy, Thông caribê gây trồng tất dạng khí hậu nước nhiệt đới cận nhiệt đới Vùng phân bố rừng trồng loài mở rộng độ vĩ độ kinh, từ vùng có khí hậu miền núi tới khí hậu cận miền núi vùng ven biển Ở Malaysia, Thơng caribê trồng diện tích lớn cho sinh khối bình quân khoảng 17m3/ha/năm Ở Đặc khu miền Bắc Australia, xuất xứ tốt PCH sau 10 năm sinh trưởng nhanh, cho sinh khối bình quân 22m3/ha/năm Ở bang Queensland (cũng thuộc Australia), 9,5 tuổi, PCH đạt 16 - 18m3/ha/năm biến chủng PCB đạt khoảng 14,8m3/ha/năm [38] * Ở nước: Thông caribê dẫn nhập vào nước ta năm 1963 để trồng thử nghiệm Lang Hanh Lang Linh thuộc tỉnh Lâm Đồng (Lê Đình Khả, 1990; Phí Quang Điện, 2001) Lồi thơng trồng thử Vĩnh Yên, Phú Thọ, Ninh Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Đà Nẵng, gần trồng Đông Nam Tây Nguyên Kết bước đầu cho thấy gây trồng cho hiệu kinh tế số địa phương Sau Trung tâm nghiên cứu Giống rừng (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam), Trung tâm nghiên cứu nguyên liệu giấy Phù Ninh phối hợp với nhiều quan bố trí khảo nghiệm Thông caribê nhiều vùng sinh thái khác nước, như: Đại Lải (Vĩnh Phúc), Ba Vì (Hà Nội), Yên Thế (Bắc Giang), Yên lập (Quảng Ninh), Đại Huệ (Nghệ An), Đông Hà (Quảng Trị), Tiền Giang (Thừa Thiên Huế), Sơng Mây (Đồng Nai), Hàm Thuận Nam (Bình Thuận)… Các kết bước đầu cho thấy lồi sinh trưởng nhanh, thích nghi sinh thái rộng, có nhiều triển vọng để gây trồng nhiều dạng lập địa nước ta, đặc biệt biến chủng PCH (Stahl, 1984; Phí Quang Điện, 1989, 2001) Ví dụ, lập địa nghèo kiệt Yên Lập (Quảng Ninh) Thông caribê cho suất khoảng - 10m3/ha/năm Ở Đại Lải (Vĩnh Phúc), chủng PCH trồng đất feralít tầng trung bình, phát triển đá mẹ phiến thạch sét, thoát nước tốt, tuổi 15 đạt 16 - 18m3/ha/năm Thông caribê biến chủng PCH trồng năm 1984 Đơng Hà (Quảng Trị) cho sinh trưởng bình qn 2m/năm chiều cao 2,7cm/năm đường kính Có nhiều nơi, Thông caribê sinh trưởng tốt mà hoa kết hạt từ tuổi 14 - 15 trở đi, thu hái, gieo ươm tạo Đại Lải (Vĩnh Phúc), Tiền Phong (Thừa Thiên Huế), Đơng Hà (Quảng Trị)… Ví dụ, hạt giống PCH Đại Lải đạt tỉ lệ nảy mầm tới 90%, tạo từ nguồn hạt sinh trưởng tốt, sâu bệnh Cây tuổi rừng trồng đạt chiều cao trung bình 1,17m, đường kính gốc đạt 1,8cm Từ đến tuổi, sinh trưởng nhanh đạt chiều cao trung bình khoảng 1,8 - 2m/năm, đường kính D1,3 = 1,6 - 1,8cm/năm Từ thấy - tuổi sinh trưởng tốt vùng địa lý - lập địa khác nhau, từ tuổi PCH sinh trưởng vượt PCC, sâu đục bắt đầu xuất (tỉ lệ từ 2,5 - 3%), PCH nhiều PCC Là loài chủ lực trồng rừng tổ đất nghèo xấu phổ biến Việt Nam (Đại Lải Đông Hà khu vực điển hình), kinh nghiệm có với kết nghiên cứu tiến hành, nghiên cứu luận văn mong góp phần giúp sở trồng rừng sản xuất Thông caribê đạt kết tốt nhất, thiết thực đóng góp chương trình trồng triệu rừng đất nước kế hoạch phát triển nghề rừng đến năm 2020 [6] 1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng Sự biệt hoá phản biệt hố với tính tồn tế bào thực vật sở lý luận vững để nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nuôi cấy in vitro phương thức nhân giống dựa sở phân bào nguyên nhiễm, lối phân bào khơng có tổ hợp lại thể nhiễm sắc trình phân chia, phương thức nhân giống truyền đạt biến dị di truyền mẹ cho in vitro Cây in vitro khơng giữ hình thái giải phẫu mẹ, giữ biến di truyền mong muốn mà giữ biến dị di truyền sinh trưởng nhanh cho suất cao chúng Nhân giống in vitro phương thức giữ ưu lai đời F1 khắc phục tượng phân ly đời F2, nhân giống in vitro làm rút ngắn chu kỳ sinh sản, rút ngắn thời gian thực chương trình cải thiện giống rừng phương thức nhân nhanh loài quí bị khai thác cạn kiệt Đây phương thức góp phần bảo tồn nguồn gen rừng nhân giống bổ sung cho loài khó thu hái bảo quản hạt [12], [8], đặc biệt nhân nhanh số lượng lớn nguồn giống tốt phục vụ chương trình trồng rừng 45 3.2.2 Tác dụng BAP đến khả cảm ứng tạo đa chồi từ đoạn thân in vitro Để nghiên cứu khả cảm ứng đa chồi từ đoạn thân mầm, chúng tơi tiến hành bố trí cơng thức thí nghiệm cảm ứng đa chồi từ đỉnh chồi, với chất điều hoà sinh trưởng BAP nồng độ khác Các đoạn thân mầm cắt thành đoạn nhỏ với kích thước 0,5 cm đặt lên môi trường cảm ứng tái sinh chồi với chất điều hoà sinh trưởng BAP nồng độ khác Sau tuần nuôi cấy, quan sát, thu thập xử lý số liệu, kết thu ghi bảng 3.4 Bảng 3.4 Tác dụng BAP đến khả tạo đa chồi từ đoạn thân mầm Công thức Nồng độ Số mẫu cấy Tỉ lệ tạo đa Số chồi thí nghiệm (mg/l) (mẫu) chồi (%) TB/mẫu (chồi) ĐC 90 0,0 1,2 ± 0,02 P5 90 77,8 3,9 ± 0,04 P6 90 88,9 5,2 ± 0,05 P7 90 78,9 4,6 ± 0,04 P8 7,5 90 76,7 3,4 ± 0,06 Khác với đỉnh chồi, đoạn thân mầm Thông caribê cảm ứng với BAP chậm Sau tuần đầu nuôi cấy, đa số đoạn thân mầm cảm ứng mơ sẹo hố mạnh, sau hình thành chồi, số lượng chồi tạo cao Sau tuần nuôi cấy, quan sát thấy hầu hết mơ sẹo hình thành chồi cơng thức mơi trường thí nghiệm từ P5 đến P8 với tỉ lệ mẫu tạo đa chồi từ 76,7 – 88,9%, cịn ngược lại cơng thức đối chứng (khơng bổ sung chất điều hoà sinh trưởng), tỉ lệ mẫu tạo đa chồi 0% Ở công thức môi trường P7 P8 có số mẫu cấy bị chết nhiều mơ hình thành, ngun nhân đoạn thân mầm non, cảm ứng với nồng độ BAP cao nên bị chết Màu xanh 46 chồi nhạt hơn, bị kích thích chồi mạnh, số chồi hình thành có xu hướng giảm dần Kết bảng 3.4 cho thấy rằng, đoạn thân mầm nuôi cấy môi trường chất điều hồ sinh trưởng có khả tái sinh chồi, với tỉ lệ thấp 1,2 lần Khi sử dụng đơn lẻ BAP từ nồng độ mg/l đến mg/l cho tạo đa chồi từ thân mầm kết cho thấy nồng độ mg/l có tỉ lệ tái sinh chồi đạt 5,2 ± 0,05 lần cao so với nồng độ khác Đối với nghiên cứu gần Thông caribê cơng bố tỉ lệ nhân chồi 1,7 lần mơi trường ¼ MCM bổ sung 0,5 mg/l BAP (Phạm Thị Kim Thanh, 2007), cho thấy tỉ lệ tái sinh chồi luận văn cao 3,5 lần Điều chứng tỏ BAP nồng độ 4m/l phù hợp với tạo đa chồi đoạn thân mầm Thơng caribê Kết dùng tốn thống kê để kiểm tra phụ biểu, với xác suất Ftính < 0,05 cho thấy cơng thức nghiên cứu có sai khác rõ rệt với lần lặp, kết thí nghiệm đảm bảo độ tin cậy 95% Tỉ lệ (%) Nồng độ BAP (mg/l) Biểu đồ 3.4 Tác dụng BAP tới tỉ lệ tạo đa chồi số chồi TB/mẫu từ đoạn thân mầm So sánh kết cảm ứng tạo đa chồi từ đoạn thân mầm chồi đỉnh mầm cho thấy: Ở cơng thức mơi trường khơng có chất điều hồ sinh trưởng đỉnh chồi đoạn thân mầm khả tạo đa chồi, 47 (tỉ lệ mẫu tạo đa chồi 0,0%) Nhưng ngược lại, cơng thức mơi trường có bổ sung chất điều hồ sinh trưởng BAP, tỉ lệ tái sinh chồi từ đoạn thân mầm thấp so với tạo đa chồi từ đỉnh chồi mầm Thực tế nghiên cứu cho thấy, sau khoảng tuần nuôi cấy môi trường cảm ứng tạo đa chồi, đỉnh chồi mầm hầu hết tạo đa chồi, đoạn thân mầm cơng thức có nồng độ BAP cao 7,5 mg/l mơ sẹo chưa tạo chồi, có lác đác số có chồi đơn Mặt khác, đa số đoạn thân mầm tạo mô sẹo có màu nâu vàng, tạo mơ sẹo xốp có màu trắng khơng có khả hình thành chồi (hình 3.4-A) Như vậy, mơi trường có chất điều hồ sinh trưởng, Mơi trường P6 có khả cảm ứng tạo đa chồi có tỉ lệ tạo chồi cao so với khả tạo đa chồi từ công thức nghiên cứu Công thức môi trường P6: M16 + vitamin (B5) + 4mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar, mơi trường thích hợp cho việc cảm ứng tạo đa chồi mầm Thơng caribê in vitro (hình 3.4-B) P5 ĐC A P6 P7 P8 B Hình 3.4 Tác dụng BAP tới tạo đa chồi từ đoạn thân mầm A: Đoạn thân mầm (0,5 cm) cấy công thức môi trường sau tuần B: Đoạn thân mầm (0,5 cm) cấy môi trường P6 sau tuần nuôi cấy 3.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kích thước đoạn thân in vitro Thơng caribê tới việc tạo đa chồi 48 Nhân nhanh chồi bước định hiệu trình nhân giống Do bước tạo số lượng lớn nguồn vật liệu in vitro để tạo hoàn chỉnh Sau nghiên cứu tìm cơng thức mơi trường tạo đa chồi tốt phần (P6), để tối ưu hố quy trình tạo đa chồi Chúng tơi tiến hành nghiên ảnh hưởng kích thước đoạn thân kích thước: 0,3; 0,5; 0,7 1,0 (cm) Sau tuần nuôi cấy dàn đèn, tiến hành thu thập phân tích số liệu kết thu trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kích thước đoạn thân đến hệ số nhân chồi Kích thước đoạn thân mầm (cm) Số mẫu cấy (mẫu) Tỉ lệ mẫu tạo đa chồi (%) Số chồi TB/mẫu (lần) 0,3 0,5 0,7 90 90 90 75,6 88,9 88,9 3,0 ± 0,04 5,5 ± 0,06 6,1 ± 05 1,0 90 90,0 7,2 ± 0,06 Đây bước nghiên cứu tối ưu hố kỹ thuật ni cấy in vitro Thơng caribê, qua cơng trình ngồi nước cơng bố, chúng tơi chưa thấy tác giả đề cập đến công đoạn này, nước ta cơng trình nghiên cứu Trần Trung Hiếu cộng [7], Phạm Thị Kim Thanh Huỳnh Đức Nhân [23] khơng đưa cụ thể kích thước đoạn chồi thân Thông in vitro thí nghiệm Kích thước đoạn thân in vitro ảnh hưởng lớn đến kết thí nghiệm như: hệ số nhân chồi, tỉ lệ tạo đa chồi… nghiên cứu kích thước đoạn thân giúp người sản xuất giống in vitro tạo số lượng nhiều mô thời gian cấy chuyển, từ mang lại suất lao động người sản xuất mô cao Từ kết số liệu bảng cho thấy: tất công thức cho hệ số nhân tỉ lệ mẫu tạo đa chồi tăng dần, tỉ lệ thuận với kích thước đoạn thân mầm tăng lên, kích thước mẫu cấy từ 0,3; 0,5; 0,7 1,0 (cm) có hệ số nhân tương ứng 3,3 lần; 5,5 lần; 6,1 lần; 7,2 lần với tỉ lệ mẫu tạo đa chồi cao tương ứng 75,6; 88,9; 88,9; 90% Độ dài đoạn thân 0,5 cm 49 có hệ số nhân gấp 1,5 lần đoạn thân 0,3 cm, độ dài đoạn thân lớn 1,7 lần Vì vậy, hiệu sử dụng kích thước đoạn 0,5 cm có hệ số nhân chồi cao kích thước đoạn thân mầm 0,3 cm Đối với đoạn có kích thước 0,7 cm 1,0 cm có độ dài lớn 0,5 cm tương ứng 1,4 lần; lần lại có hệ số nhân chồi lớn 1,1 lần 1,3 lần Điều chứng minh cho ta thấy sử dụng đoạn 0,5 cm (hình 3.5-B) dùng để nhân nhanh tốt nhất, sử dụng đoạn 0,5 cm dễ làm, thao tác nhanh…làm rút ngắn thời gian cắt mẫu mà hiệu nhân chồi lại cao nhất, bên cạnh tỉ lệ tạo đa chồi biến động khơng lớn Nhằm tăng độ tin cậy kết nghiên cứu, chúng tơi tiến hành phân tích phương sai phụ biểu, với xác suất Ftính < 0,05 cho thấy cơng thức nghiên cứu có sai khác rõ rệt với lần lặp, kết thí nghiệm đảm bảo độ tin cậy 95% Điều thể trực quan qua biểu đồ Hệ số nhân chồi Kích thước đoạn thân mầm (cm) Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng kích thước đoạn thân mầm tới số chồi TB/mẫu 50 B A Hình 3.5 Tạo đa chồi từ kích thước thân mầm mơi trường P6 A: Kích thước 0, cm B: Kích thước 0,5 cm 3.3 Kết tạo rễ in vitro Thơng caribê Giai đoạn tạo hồn chỉnh (cây có đầy đủ thân, rễ) giai đoạn quan trọng quy trình nhân giống in vitro, có rễ khoẻ mạnh có khả sống sinh trưởng tốt đưa từ điều kiện phịng thí nghiệm trồng nhà lưới Nhiều quy trình nhân giống lồi lâm nghiệp không thành công chồi nuôi cấy in vitro khả rễ tỉ lệ rễ thấp (cây Dó trầm, Bách xanh, Pơmu, Trẩu ) Do vậy, tiến hành thử nghiệm môi trường tạo rễ in vitro Thông caribê hồn chỉnh Trong q trình ni cấy, chồi hình thành phát sinh rễ tự nhiên, thơng thường chồi cần phải cấy chuyển sang mơi trường khác để kích thích tạo rễ Ở số lồi, chồi tạo rễ chuyển trực tiếp đất Mơi trường kích thích tạo rễ thường bổ sung chất điều hồ sinh trưởng thuộc nhóm auxin Auxin nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật sử dung thường xuyên nuôi cấy mô, tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với thành phần khác môi trường dinh dưỡng để kích thích tăng trưởng 51 mơ sẹo, huyền phù tế bào, điều hồ phát sinh hình thái, đặc biệt phát sinh rễ IBA chất kích thích sinh trưởng thường sử dụng ni cấy mơ với mục đích kích thích tạo rễ, nhiều tác giả sử dụng tạo rễ in vitro thông [48], [52] Để nghiên cứu vai trò IBA việc cảm ứng tạo rễ chồi Thơng caribê, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với cơng thức mơi trường có bổ sung IBA với nồng độ khác Chồi Thông caribê đạt chiều dài từ 1,5 cm trở lên (hình 3.6-A) cấy chuyển sang môi trường tiền cảm ứng rễ M16 có bổ sung thêm IBA nồng độ từ 1,0 mg/l – mg/l Thời gian tiền cảm ứng tạo rễ từ - ngày, sau chồi cấy chuyển sang mơi trường dinh dưỡng ½ M16 + vitamin (B5) khơng có chất điều hồ sinh trưởng, ni tiếp thời gian tuần, thu thập phân tích số liệu kết thu thể bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng IBA tới tỉ lệ rễ Thông caribê Công thức IBA (mg/l) ĐC PR1 PR2 PR3 PR4 0,5 1,0 1,5 2,0 Tỉ lệ tạo rễ (%) 0,0 31,1 65,6 55,6 43,3 Số rễ trung bình (rễ) 1,0 ± 0,12 1,0 ± 0,07 1,7 ± 0,05 2,0 ± 0,05 Chất lượng rễ +++ +++ + + Ghi chú: (+) Rễ phình to, đen; (+++) Rễ phát triển nhanh, dài, màu trắng, phân nhiều rễ cấp Quan sát tỉ lệ hình thành rễ chồi sau thời gian tuần nuôi cấy, thấy cơng thức (ĐC) khơng bổ sung IBA, khơng thấy hình thành rễ, cịn cơng thức thí nghiệm bổ sung thêm IBA có tỉ lệ chồi Thơng caribê rễ đạt từ 31,1 đến 65,6%, cao công thức PR2 (1mg/l) thấp công thức môi trường PR1 (0,5 mg/l), tỉ lệ rễ giảm xuống xuất dạng mô sẹo nhỏ, rễ phình to, đen chậm kéo 52 dài Khi tăng dần nồng độ IBA bổ sung vào môi trường tiền cảm ứng rễ số rễ hình thành từ chồi in vitro tăng dần lên cho số lượng rễ cao công thức PR4 (2mg/l), với điều kiện tỉ lệ dị hình tăng theo, hầu hết rễ phát sinh từ khối mơ sẹo hình thành phần gốc in vitro nên dễ bị đứt gãy Mặc dù số rễ tạo nhiều dị dạng (phình to, xốp khơng có khả kéo dài), phần rễ cịn lại khơng bị dị hình phát triển chậm, đen, dễ gãy không phân nhánh, không xuất rễ cấp Kết phù hợp với báo cáo Konstantin cộng (2003) [52], Trần Trung Hiếu cộng (2003) [7], Đỗ Tiến Phát (2009) [18] Khi nghiên cứu rễ cho chồi thông, sử dụng IBA nồng độ thấp 0,2mg/l tỉ lệ chồi rễ đạt 17% công thức rễ tốt qua kết Phạm Thị Kim Thanh [23] 34,38% nồng độ 2mg/l IBA Như vậy, qua kết thí nghiệm, vào tỉ lệ rễ chất lượng rễ in vitro công thức trên, thấy nồng độ 1mg/l IBA phù hợp cho việc tạo rễ chồi Thông caribê in vitro, số rễ tạo chất lượng rễ tốt (rễ dài, phát triển nhanh, màu trắng phân nhiều rễ cấp 1; hình 3.6-D) Chúng tơi tiến hành phân tích phương sai phụ biểu, với xác suất Ftính < 0,05 cho thấy cơng thức nghiên cứu có sai khác rõ rệt với lần lặp, kết thí nghiệm đảm bảo độ tin cậy 95% Kết qua trình nghiên cứu tạo rễ thể qua hình 3.6 Qua trình nghiên cứu thực thí nghiệm, chúng tơi hồn thành mục tiêu đặt luận văn Nhằm mô tổng hợp kết đó, chúng tơi mơ qua sơ đồ số 02 53 A A C C B C D C Hình 3.6 Tạo hồn chỉnh A: Cây Thơng caribê in vitro đủ tiêu chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ; B: Cây Thông caribê in vitro chuyển sang môi trường tạo rễ; C: Cây Thông caribê in vitro chuyển sang môi trường tạo rễ sau tuần; D: Rễ Thông caribê in vitro tạo sau tuần 54 Cây trội Thông caribê Chồi cành Hạt 15 phút Khử trùng Javen 60% 08 phút Khử trùng HgCl2 (0,1%) Tạo đa chồi: từ chồi đỉnh dài 0,5cm (P2), từ đoạn thân dài 0,5cm (P6) (5 tuần nuôi cấy) tuần Tạo Thơng caribê hồn chỉnh Sơ đồ 02 Tóm tắt kết nhân giống in vitro Thông caribê 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận * Đối với tạo mẫu sạch: Đã tạo mẫu đủ lớn tìm cơng thức tốt + Sử dụng Javen 60% với thời gian khử trùng 15 phút mẫu phôi hạt, đạt hiệu khử trùng tốt với tỉ lệ mẫu tạo 96%, tỉ lệ nảy mầm đạt 82,7% + Sử dụng HgCl2 0,1% với thời gian phút khử trùng chồi cành thu từ thực địa, cho kết tạo mẫu tốt 68,6% * Tạo đa chồi: + Tạo đa chồi từ đỉnh sinh trưởng có tỉ lệ chồi cao mơi trường P2, có hệ số nhân chồi 6,5 ± 0,33 lần, tỉ lệ tạo đa chồi 86,7% + Số chồi thu đoạn thân mầm mơi trường P6: Mơi trường M16 có bổ sung 4mg/l BAP cho hệ số nhân cao (5,2 ± 0,05 lần) có chất lượng mầm tốt sau tuần nuôi cấy * Nhân nhanh chồi: Xây dựng kỹ thuật tạo đa chồi in vitro Thông caribê đạt hiệu suất cao: Với đỉnh chồi mầm tỉ lệ tạo đa chồi đạt 86,7% trung bình 6,5 ± 0,33 chồi/cụm ni cơng thức mơi trường P2 Với đoạn thân mầm kích thước 0,5 cm có hiệu kinh tế cao nhất, tỉ lệ tạo đa chồi 88,9% trung bình 5,5 chồi/cụm ni cơng thức mơi trường M16 có bổ sung 4mg/l BAP(P6) * Kết tạo rễ Thông caribê in vitro: Tỉ lệ chồi rễ đạt 65,6% nuôi công thức môi trường PR4 tiền cảm ứng ngày, sau cấy chuyển sang mơi trường ½ M16 bổ sung vitamin(B5) Tổng thời gian tính từ vào mẫu đến trồng nhà lưới 06 tháng 56 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu giai đoạn như: tiếp tục lấy chồi tái sinh từ mẫu chồi cành để thử nghiệm môi trường tốt xác định cho nuôi cấy mầm từ phôi hạt, huấn luyện đưa môi trường tự nhiên - Hồn thiện kỹ thuật vi nhân giống Thơng caribê, nhân nhanh từ chồi cành để ứng dụng vào sản xuất giống chất lượng tốt phục vụ trồng rừng sản xuất 57 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn .i Danh mục bảng: ii Danh mục hình: iii Danh mục biểu đồ: iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Thông caribê 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại phân bố 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái học 1.1.3 Giá trị sử dụng 1.1.4 Tình hình sản xuất, gây trồng nước 1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng 1.2.1 Phương pháp nhân giống in vitro 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết nuôi cấy in vitro 11 1.2.3 Các bước nhân giống in vitro 15 1.3 Thành tựu nuôi cấy in vitro 17 1.3.1 Thành tựu chung nuôi cấy mô, tế bào thực vật nước 17 1.3.2 Các nghiên cứu Thông caribê 22 1.3.2.1 Ở nước 22 1.3.2.2.Ở nước 23 58 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu 27 2.2 Thiết bị hoá chất 28 2.3 Địa điểm thí nghiệm 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29 2.4.1.1 Tạo mẫu Thông caribê in vitro từ phôi hạt 29 2.4.1.2 Tạo mẫu Thông caribê in vitro từ chồi thực địa 30 2.4.1.3 Tạo đa chồi Thông caribê từ đỉnh chồi mầm 31 2.4.1.4 Tạo đa chồi Thông caribê từ đoạn thân mầm 31 2.4.1.5 Nhân nhanh Thông caribê từ đoạn thân mầm 32 2.4.1.6 Thử nghiệm tạo rễ in vitro Thông caribê 32 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro Thông caribê 35 3.1.1 Tạo nguồn mẫu từ phôi hạt 35 3.1.2 Tạo nguồn mẫu từ chồi cành 38 3.2 Nghiên cứu tạo đa chồi điều kiện in vitro 40 3.2.1 Tác dụng BAP đến khả cảm ứng tạo đa chồi từ đỉnh chồi mầm in vitro 41 3.2.2 Tác dụng BAP đến khả cảm ứng tạo đa chồi từ đoạn thân in vitro 45 3.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kích thước đoạn thân in vitro Thông caribê tới việc tạo đa chồi 47 3.3 Kết tạo rễ in vitro Thông caribê 50 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 1.Kết luận 55 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÓM TẮT LUẬN VĂN PHỤ LỤC ... 1.2.1 Phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro bổ sung cho kỹ thuật nhân giống vơ tính cổ điển như: chiết cành, ghép, giâm hom, tách dòng… Nhân giống in vitro hay vi nhân giống. .. đề tái sinh chồi Thông caribê trực tiếp từ chồi non cách đầy đủ xây dựng quy trình cho loài 26 Do vậy, nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) phương pháp nuôi cấy in vitro. .. phát từ sở trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) phương pháp nuôi cấy in vitro? ?? Với mục tiêu nghiên cứu sau: + Tạo nguồn mẫu đủ lớn từ loại