Đang tải... (xem toàn văn)
Trong nghiên cứu này, đoạn thân non và đỉnh sinh trưởng cây Sa mộc dầu được nghiên cứu khử trùng để tạo vật liệu ban đầu cho nuôi cấy in vitro.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐỒNG THÁP Tạp chí Khoa học số 36 (02-2019) ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI HÓA CHẤT, NỒNG ĐỘ HÓA CHẤT VÀ THỜI GIAN KHỬ TRÙNG ĐẾN KẾT QUẢ TẠO MẪU SẠCH SA MỘC DẦU (Cunninghamia konishii Hayata) y Hồ Ngọc Sơn(*), Nguyễn Thị Thoa(*), Lê Văn Phúc(*) Tóm tắt Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) nguồn gen q xếp vào nhóm có nguy bị tuyệt chủng Sử dụng phương pháp nhân giống in vitro để bảo tồn phát triển loài cần thiết Trong nghiên cứu này, đoạn thân non đỉnh sinh trưởng Sa mộc dầu nghiên cứu khử trùng để tạo vật liệu ban đầu cho nuôi cấy in vitro Thí nghiệm thực với NaClO 20%; 30%; 40% thời gian 10-40 phút; H202 10%, H202 20% thời gian 10-40 phút; Ca(ClO)2 5%; 10%; 15% thời gian 10-20 phút, HgCl2 0,1%, 0,15%, 0,2% thời gian 5-15 phút Kết cho thấy khử trùng với HgCl2 0,1% thời gian 10 phút cho hiệu vơ trùng mẫu cao nhất, đạt 73,33% Từ khóa: Dung dịch; hóa chất; nồng độ; mẫu sạch; khử trùng Đặt vấn đề pháp nuôi cấy mô tế bào đối tượng cần Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) thiết Nuôi cấy mô tế bào tạo cịn có tên khác Ngọc am, Sa mộc quế phong, bệnh, chất lượng tốt, độ đồng cao, hệ số nhân thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae), Thơng lớn giữ đặc tính di truyền mẹ [1] (Coniferales) [2] Sa mộc dầu khơng có ý nghĩa Trong q trình ni cấy mô tế bào thực vật, nguồn mặt khoa học mà cịn có giá trị kinh tế cao vật liệu khởi đầu chế độ khử trùng tạo mẫu Gỗ sa mộc dầu từ xưa ưa chuộng, thường bệnh quan trọng làm quan tài cho vua chúa khả chôn Phương pháp nghiên cứu đất hàng trăm năm không bị mục nát, lại có tinh 2.1 Vật liệu nghiên cứu dầu giữ mùi thơm Gỗ sa mộc dầu có hoa vân, Cây Sa mộc dầu thu thập từ tỉnh Hà màu sắc đẹp nên sử dụng làm đồ mỹ Giang đưa trồng Khu khảo nghiệm giống nghệ, thủ cơng, vật dụng gia đình [4] Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Tinh dầu sa mộc dầu có mùi thơm, chiết 2.2 Hóa chất xuất làm mỹ phẩm, dược phẩm Sa mộc dầu Hóa chất khử trùng: NaClO, Oxy già (H2O2), nguồn gen q xếp nhóm IIA: Thực vật thủy ngân chlorua (HgCl2), Calcium hypochlorite rừng, động vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng (Ca(ClO)2) Mơi trường ni cấy: MS (Murashige mục đích thương mại Nghị định 32/2006/NĐ- & Skoog, 1962) Các hóa chất khác: Đường CP Lồi Sa mộc dầu cịn nằm Danh mục lồi saccarose, Agar, NaOH, HCl nguy cấp, quý ưu tiên bảo vệ Nghị 2.3 Phương pháp nghiên cứu cụ thể định số 160/2013/NĐ-CP ngày 12 tháng 11 năm 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 2013 Chính phủ IUCN Redlist - 2017, Sa mộc Đỉnh sinh trưởng thân non đem rửa dầu xếp vào nhóm có nguy bị tuyệt xà phịng Rửa nước máy chủng: Endangered A2cd; B2ab tráng nước cất lần Sau khử trùng hóa Trên giới, Sa mộc dầu phân bố Đài Loan chất khử trùng Kết thúc cắt phần chết đầu tiếp Lào Ở Việt Nam, chúng phân bố hẹp số xúc với chất khử trùng cấy vào môi trường khởi địa phương như: Hà Giang, Sơn La, Thanh Hóa đầu (1 mẫu/bình) để đánh giá hiệu khử trùng Nghệ An [3], [5] Trong Sách đỏ Việt Nam (2007), - Hóa chất dùng để khử trùng: NaClO, oxy chúng xếp vào thứ hạng bị tuyệt chủng: già, thủy ngân chlorua, Calcium hypochlorite VU A1a,d,C1 Nhận thức vấn đề bảo tồn Ca(ClO)2 phát triển loài Sa mộc dầu, việc ứng dụng phương - Môi trường nuôi cấy: MS (Murashige and Skoog, 1962), bổ sung 30 gram saccarose/lít, (*) Trường Đại học Nơng lâm- Đại học Thái Ngun gram agar/lít, pH= 5,8 94 Tạp chí Khoa học số 36 (02-2019) TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐỒNG THÁP - Các cơng thức thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại 10 mẫu 2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng a Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ thời gian khử trùng NaClO đến hiệu vơ trùng vật liệu ni cấy Thực thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 20%; 30%; 40% đến hiệu vô trùng vật liệu ni cấy Mỗi thí nghiệm thực với 05 công thức với mức thời gian xử lý khác từ 10 đến 40 phút Tổng số mẫu 30 b Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng, thời gian khử trùng H202 đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng H202 10% H202 20% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Thí nghiệm thực với 05 cơng thức với mức thời gian xử lý khác từ 10 đến 40 phút Tổng số mẫu 30 c Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng, thời gian khử trùng Calcium hypochlorite (Ca(ClO)2) đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng Ca(ClO)2 5% Ca(ClO)2 10% đến hiệu vơ trùng vật liệu ni cấy Thí nghiệm thực với công thức với mức thời gian xử lý khác từ 10 đến 40 phút Tổng số mẫu 30 Đồng thời thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng Ca(ClO)2 15% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Thí nghiệm thực với 04 cơng thức (01 công thức đối chứng) với mức thời gian xử lý khác từ 10 đến 20 phút Tổng số mẫu 30 d Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng, thời gian khử trùng HgCl2 đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1%; HgCl2 0,15% HgCl2 0,2% đến hiệu vô trùng vật liệu ni cấy Thí nghiệm thực với 04 cơng thức với mức thời gian xử lý khác từ đến 15 phút Tổng số mẫu 30 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phương pháp thống kê toán học lâm nghiệp để xử lý số liệu chương trình SPSS 20.0 phần mềm Excel 7.0 Phân tích phương sai nhân tố kiểm tra sai dị lớn theo tiêu chuẩn Duncan phần mềm SPSS 20.0 theo trình lệnh: Analyz/Compare Means/One-way Anova, theo tài liệu Nguyễn Hải Tuất cộng (2005) [6] Kết nghiên cứu 3.1 Ảnh hưởng nồng độ thời gian khử trùng NaClO đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy 3.1.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 20% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch NaClO 20% với mức thời gian khác đến hiệu qukhử trùng Ca(ClO)2 10% đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy Ảnh hưởng thời gian khử trùng Ca(ClO)2 10% thể Bảng 7: 98 Bảng Kết khử trùng mẫu Ca(ClO)2 10% Tỷ lệ Tổng mẫu sống số không mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) CT Thời gian (phút) ĐC Không xử lý 30 100 10 30 20,0 73,33 6,67 15 30 30,0 56,67 13,33 20 30 53,33 30,0 16,67 Kết Bảng cho thấy, khử trùng Ca(ClO)2 10% cho tỷ lệ mẫu cao, cơng thức thí nghiệm khử trùng Ca(ClO)2 10% thời gian 20 phút cho hiệu vô trùng mẫu cao nhất, tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 53,33% Vậy thời gian khử trùng với Ca(ClO)2 10% ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu sống không nhiễm bệnh Để thể rõ ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống không nhiễm bệnh, tiến hành phân tích phương sai nhân tố lần lặp lại phần mềm SPSS, kết cho thấy, xác suất tỷ lệ mẫu sống không nhiễm bệnh cơng thức thí nghiệm 0,0020,05, điều nói lên tỷ lệ mẫu sống khơng nhiễm bệnh cơng thức thí nghiệm khác khơng có khác rõ rệt Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để kiểm tra sai dị trung bình mẫu nhằm tìm cơng thức có tỷ lệ mẫu sống cao Kết cho thấy, công thức CT1 (thời gian khử trùng 10 phút) công thức trội nhất, có trị số cao 10,0 Do đó, công thức CT1 trội Chứng tỏ thời gian khử trùng mẫu Ca(ClO)2 15% thời gian 10 phút có ảnh hưởng trội cơng thức khác đến tỷ lệ mẫu sống không nhiễm bệnh Kết thí nghiệm cho thấy khử trùng mẫu Ca(ClO)2 sử dụng Ca(ClO)2 10% vịng 20 phút đạt hiệu khử trùng mẫu tốt Tỷ lệ mẫu vô trùng cao đạt 53,33%, nhiên chồi gầy, vàng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng, thời gian khử trùng HgCl2 đến hiệu vô trùng vật liệu ni cấy Thủy ngân loại hóa chất độc nên dùng hạn chế cẩn thận Tuy nhiên, việc Tỷ lệ Tổng mẫu sống số không mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) CT Thời gian (phút) ĐC Không xử lý 30 100 30 46,67 43,33 10,0 10 30 73,33 13,33 13,33 15 30 60,0 10,0 30,0 Kết Bảng cho thấy, thủy ngân có tác dụng diệt nấm, khuẩn tốt, tỷ lệ mẫu cao biến động từ 46,67% - 73,33 % Khi mẫu Sa mộc dầu tiếp xúc với HgCl2 0,1% với thời gian thích hợp cho tỷ lệ mẫu cao, thời gian tiếp xúc mẫu với chất khử trùng lâu tỷ lệ mẫu chết cao Công thức khử trùng mẫu HgCl2 0,1% thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất, đạt 73,33%, tỷ lệ mẫu chết không cao, 13,33% Để thể rõ ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lê mẫu sống không nhiễm bệnh, tiến hành phân tích phương sai nhân tố lần lặp phần mềm SPSS Kết cho thấy, xác suất tỷ lệ mẫu sống không nhiễm bệnh cơng thức thí nghiệm 0,003